反向胶束萃取技术

1、反相胶束萃取技术Reversed Micelle Extraction 报告人： 熊瑶一、反相胶束萃取概况 反相胶束萃取技术的提出 溶液萃取法主要包括溶剂萃取 、双水相萃取和反胶束萃取。 生物大分子物质一般在4050以上开始变性； 绝大多数生物大分子物质不溶于有机溶剂； 有机溶剂也易引起生物大分子物质的变性； 生物大分子表面带有许多电荷，普通离子缔合型 萃取剂很难奏效。 提取与分离酶蛋白的方法既要有高选择性又要不影响酶蛋白的活性，传统溶剂萃取并不适合；双水相萃取虽然可以保留产物的活性，但是由于成本较高真正工业化的例子很好；反胶束萃取成本低，溶剂可反复使用，萃取率高等特点，对生物大分子分离提取具

2、有很好的发展前景。 二、反相胶束萃取的概念反相胶束（reversed micelle）：当表面活性剂在非极性溶液中形成胶束或微胶团时，表面活性剂的排列方向正好与在极性溶剂中的情况相反，即疏水性基团朝外，而亲水性基团则朝内并形成一个极性核区，由于这种微胶团结构与正常微胶束结构相反，所以称这种微胶束称为反相微胶束。水池(water pool) ：在反相微胶束中，表面活性剂的亲水基团所围成的一个极性核心，称为水池。反相胶束萃取：如待分离组分是以反相微胶束（团）的形式被萃取的过程，就称之为反向微胶束萃取或反向微胶团萃取。 图 蛋白质在反胶束中的溶解过程 反胶束溶液是透明的，热力学稳定的系统。它由表面活

3、性剂，有机溶剂和水组成。 表面活性剂是由亲水憎油 的极性基团和亲油憎水的 非极性基团组成的两性分 子。表面活性剂表面活性剂有机溶剂有机溶剂AOTAOT 丁二酸丁二酸-2-2-乙乙基己基酯磺酸钠基己基酯磺酸钠n-n-烃类（烃类（C6C6C10C10）、）、异辛烷、环已烷、四异辛烷、环已烷、四氯化碳、苯氯化碳、苯CTABCTAB 溴化十六烷溴化十六烷三甲基铵三甲基铵已醇已醇/ /异辛烷，已醇异辛烷，已醇/ /辛烷，三氯甲烷辛烷，三氯甲烷/ /辛辛烷烷TOMACTOMAC 三辛基甲基三辛基甲基氯化铵氯化铵 环已烷环已烷Brij60Brij60 聚氧乙烯聚氧乙烯月桂醇醚月桂醇醚 辛烷辛烷Triton

4、XTriton X 烷基酚烷基酚聚氧乙烯聚氧乙烯 已醇已醇/ /环己烷环己烷磷脂酰胆碱磷脂酰胆碱苯、庚烷苯、庚烷磷脂酰乙醇胺磷脂酰乙醇胺苯、庚烷苯、庚烷在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂AOT，学名丁二酸2乙基己基酯磺酸钠，结构式如下图 AOT容易获得，具有双链，极性基团较小，形成反腔束临界胶束浓度较低，并且形成的反胶束较大，有利于大分子蛋白质的进入 临界胶束浓度（Critical micelle concentration) 临界胶束浓度：是胶束形成时所需的表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示。与表面活性剂化学结构、溶剂、温度、压力等因素有关。CMC值可通过测定表面活性

5、剂各种物理性质的突变(如表面张力，渗透压、浊度、当量电导等)来确定。图显示了表面活性剂十二烷基磺酸钠与溶液物理化学性质的关系，在特征浓度为0.008 molL时各性质都有一个突变现象，此时表面活性剂的浓度就是十二烷基磺酸钠在此溶剂中的临界胶束浓度 反胶束的形状与大小 反胶束的大小取决于反胶束的含水量W0。 含水量是指反胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比。 W0=H2Osurfactan 由于每个表面活性剂极性基团有一定的有效面积，因此，它决定了反胶束的大小和每个反胶束中表面活性剂的分子数。 在反胶束溶液与水相平衡的情况下， W0值取决于表面活性剂的种类、溶剂的类型、表面活性助剂、水相中盐的种

6、类和盐的浓度等。 蛋白质进入反胶束后，会使反胶束的结构发生变化。如大小、聚集数和W0等改变，这些变化的基本机理目前不太清楚。三、反相胶束萃取的基本原理 在反相胶束萃取过程中，蛋白质或酶等生物大分子主要以水壳膜形式存在于反相微胶团的极性核心内部，避免了与有机溶剂直接接触，保持整个萃取过程中生物大分子的活性，实现了既能溶出酶及蛋白质等生物大分子，又能与水分相分离，并能保持这些生物大分子的生物活性。 以水AOT异辛烷系统为例演示反胶束萃取蛋白质原理在宏观两相(有机相和水相)界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此反胶束扩散进入有机相中，从而

7、实现蛋白质的萃取。蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程。改变水相条件(如pH值、离子种类、强度等)又可使蛋白质由有机相重新返回水相，实现反萃取过程。 1.蛋白质在微胶束中的结合方式 （1） “水壳”模型反胶束系统中水通常可分结合水和自由水。结合水是指位于反胶束内部形成水池的水，自由水是存在于水相中的水。蛋白质在反胶束内的溶解情况可用水壳模型解释：大分子蛋白质被封闭在“水池”中，表面存在一层水化层与胶束内表面分开，使蛋白质不与有机溶剂直接接触。水壳模型较好地解释了蛋白质在反胶束内的存在状态。1、从弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存在一个单分子水层；2、糜蛋白酶在反胶束中的荧光特性与在水中特

8、性相象；3、反胶束中酶所显示的动力学特性接近于在水中的特性等，这些事实都有力地支持了水壳模型。(2)“吸附”模型 “吸附”模型认为生物大分子虽然溶解于由表面活性剂极性部分围成的中心中，但在中心部分生物大分子是以被吸附的状态附着于胶团的极性壁上(3)疏水基“架连”模型 该模型认为生物大分子的非极性部分与多个微胶团的非极性部分连接，由此形成生物大分子溶解于多个微胶团之间的一种状态四、反相胶束萃取的方法 反相微胶团萃取分离过程分两步： 形成含生物大分子的反相微胶团最常用到的方法有3种。 相转移法 通过将含生物大分子的水相与溶解有 表面活性剂的有机相接触，缓慢地搅 拌，在形成反向微胶团的同时，其中 的

9、生物大分子即转入到反相微胶团中， 直到处于萃取平衡状态为止。含生物大分子的反相微胶团的形成反相微胶团的破乳及生物大分子的释放 注入法 通过将含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性剂的有机相中，从而实现萃取过程。 溶解法 对于固体粉末中的生物大分子，或不溶于水的生物大分子，可采用溶解法进行。先制备好含水(w0 =330左右)的反相微胶束的有机溶液，然后把含生物大分子的固体粉末加入此种反相微胶团的有机溶液中，同时搅拌，生物大分子慢慢即可进入到反相微胶团内的水池中心而实现萃取过程。五、简单且敏感的AOT/异辛烷反相胶束方法测定脂肪氧合酶 1.介绍和说明 脂肪氧合酶在动物界广泛存在，在豆类中具有较高

10、的活力，尤其以大豆中的活力为最高。属于氧化还原酶，是一类含非血红铁素的蛋白质，能转一催化具有顺，顺4-希结构的多不饱和脂肪酸，通过分子内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物。 脂肪氧合酶对它作用的底物具有结构特异性的要求，在植物中其天然底物主要是亚油酸和亚麻酸。 测定脂肪氧合酶的活性方法： 比色法、燃料溶液漂白方法、分光光度法。其中分光光度法是最为人们所接受的一种方法，但是这个方法有两个局限性： 粗酶液中含有其他吸收紫外光的材料，光谱分析的敏感度降低甚至失去敏感度。 低水溶性脂肪酸引起的浊度回干扰吸光度的读数。 2.材料和方法 2.1材料 大豆脂肪氧合酶 丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠（AOT

11、） 异辛烷 环己烷 正己烷 十六烷 亚油酸 乙醇 2.2反相胶束的制备 AOT/异辛烷反胶束溶液的配制:按一定质量浓度配制反胶束溶液,称取AOT 置于100mL的锥形瓶中,同时加入有机溶剂异辛烷,在磁力搅拌器上搅拌至AOT完全溶解待溶液透明。 将大豆中提取的原油酶液溶于pH=9.0的5mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中。 2.3脂肪氧合酶的测定过程 AOT/异辛烷反相胶束溶液在800rpm，25oc的水浴中处理，然后添加亚油酸原液配成25m亚油酸/5ml反相胶束溶液。反应一段时间后，在确定的间隔时间内取样且用1.8ml的异辛烷稀释，然后添加30的乙醇水溶液，离心10min后分离。在234nm处测定

12、上清夜的吸光度。 加热使酶失活，然后用同样的步骤做空白对照实验，做校准曲线。 2.4用反相胶束测定脂肪氧合酶活性的实际应用 以大豆，黑大豆，红豆三种豆科植物为例。 在4环境中用上面三种植物提取粗酶液，添加到三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中，搅拌均匀。30min离心分离后，上清液用膜滤器过滤。滤液用饱和度为80的硫酸铵盐沉淀分离，离心分离30min。然后溶于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中隔夜处理。 3.结果与讨论 3.1AOT对反相胶束测定脂肪氧合酶活性的影响 一个主要的局限就是AOT作为表面活性剂具有强的紫外吸收作用。 为了克服这一干扰，清楚AOT是必须得。 去除反相胶束中的AOT是通过在溶液中添加乙

13、醇水溶液实现的。 AOT的去除效率依赖于AOT的浓度 3.2有机溶剂的选择 环己烷、正庚烷、正己烷、异辛烷和十六烷这五种有机溶剂经常用于反相胶束中测定脂肪酶的活性。 在测定脂肪氧合酶活性的反相胶束溶剂中异辛烷是最有效的。 根据报道，logP为溶液极性的值，用它表示在有机溶剂中酯酶和脂肪氧合酶的催化活性。 亲水性溶剂中logP2 温和性溶剂中logP为2和4 高疏水性溶剂中logP4 有机溶剂分子结构的差异。 通过测试环己烷、异辛烷和一些直连烷烃有机溶剂，得出短C链可与AOT分子嵌入形成的界面膜中，碳氢化合物会在界面膜上形成一个附加层，大部分的饱和烃渗析进入反相胶束的表面活性剂上，阻碍了脂肪氧合酶与底物之间的相互作用。 由上述可以得出的是，脂肪氧合酶的活性与有机溶剂的logP值没有关系，而是取决于有机溶剂的结构。 因此，异辛烷作为反相胶束的有机溶剂进行进一步的研究。 3.3水含量对AOT/异辛烷反相胶束的影响 反相胶束中水含量对生物催化活性的大小是一个关键的因素，并且它甚至会影响内部