遗传转化 农杆菌Z

1、 实验八实验八 植物的遗传转化植物的遗传转化主要方法有：主要方法有： DNA直接导入基因转化直接导入基因转化 1 化学诱导化学诱导DNA直接转化直接转化 2 物理法诱导物理法诱导DNA直接转化直接转化 种质系统介导基因转化种质系统介导基因转化 1 花粉管通道法介导基因转化花粉管通道法介导基因转化 2 生殖细胞浸泡法介导基因转化生殖细胞浸泡法介导基因转化 3 胚囊、子房注射法介导基因转化胚囊、子房注射法介导基因转化 生物介导的基因转化生物介导的基因转化 1 植物病毒介导的基因转化植物病毒介导的基因转化 2 农杆菌介导的基因转化农杆菌介导的基因转化优点优点: 操作简单，不需要特殊的仪器，获得转基因

2、植株操作简单，不需要特殊的仪器，获得转基因植株 周期短，转化效率高等周期短，转化效率高等农杆菌介导的基因转移1 农杆菌简介农杆菌简介 革兰氏阴性土壤杆菌。根癌农杆菌根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens):Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤;发根农杆菌发根农杆菌 (Agrobacteriumrhizogenes):Ri质粒,能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。根癌农杆菌属于根瘤菌科,农杆菌属,革兰氏阴性菌。好氧，最适生长温度为25-30，最佳生长pH为6.0-9.0，研究表明，双子叶植物中有93属643种对农杆菌敏感，而单子叶植物则普遍不敏感。2.

3、根癌农杆菌致瘤的机制根癌农杆菌致瘤的机制根癌农杆菌Ti的致瘤过程需要如下条件：植物的损伤信号及环境因子。菌体的识别和附着位点。Ti质粒的必需组成元件，包括TDNA区域和致毒基因(Virgene)。位于根癌农杆菌染色体上的一些其他遗传座位植物损伤信号及环境因子植物损伤信号及环境因子植物损伤信号植物损伤信号（糖类和酚类化合物）可指导农（糖类和酚类化合物）可指导农杆菌对植物细胞的趋化性移动，并可诱导农杆菌杆菌对植物细胞的趋化性移动，并可诱导农杆菌Vir基因的表达。基因的表达。 化学诱导信号化学诱导信号中最强的为酚类化合物，包括儿茶中最强的为酚类化合物，包括儿茶酚、没食子酸、香草醛，乙酰丁香酮等酚、没

4、食子酸、香草醛，乙酰丁香酮等, 以以乙酰丁香乙酰丁香酮酮的诱导效果最佳。的诱导效果最佳。 。菌体识别和附着位点菌体识别和附着位点 在植物细胞壁上存在着由碳水化合物、蛋白质在植物细胞壁上存在着由碳水化合物、蛋白质和果胶组成的农杆菌附着的受体位点，位于完整细和果胶组成的农杆菌附着的受体位点，位于完整细胞的表面。在农杆菌细胞壁上也存在着吸附到植物胞的表面。在农杆菌细胞壁上也存在着吸附到植物细胞壁的结合位点，由位于细菌外膜的蛋白质和脂细胞壁的结合位点，由位于细菌外膜的蛋白质和脂多糖构成。农杆菌附着到植物细胞上后，分泌出果多糖构成。农杆菌附着到植物细胞上后，分泌出果胶酶等物质，消化植物细胞壁，从而形成农

5、杆菌侵胶酶等物质，消化植物细胞壁，从而形成农杆菌侵入植物细胞的通道。入植物细胞的通道。 T-DNA区：区：转移转移DNA，农杆菌侵染细胞时，农杆菌侵染细胞时， 从从Ti质质 粒上切割下来转移到植物粒上切割下来转移到植物 细胞上的一段细胞上的一段DNAVir区：区：毒性区，激活毒性区，激活T-DNA转移。转移。Con区：区：接合转移编码区，该区存在着与细菌间接接合转移编码区，该区存在着与细菌间接 合转移的有关基因（合转移的有关基因（tra），调控），调控Ti质粒在质粒在 农杆菌之间的转移。农杆菌之间的转移。Ori区：区：复制起始区复制起始区 染色体上的一些其他遗传座位染色体上的一些其他遗传座位

6、这些基因在致瘤过程中具有决定农杆菌细胞表面特性和调控这些基因在致瘤过程中具有决定农杆菌细胞表面特性和调控Ti质粒质粒Vir基因的表达的作用。基因的表达的作用。Ti质粒的必需组成元件质粒的必需组成元件土壤农杆菌介导转化土壤农杆菌介导转化 主要步骤：主要步骤： (1)细菌在植物敏感细胞上吸附；细菌在植物敏感细胞上吸附； (2 )农杆菌中农杆菌中Ti质粒上的质粒上的Vir区基因被激活区基因被激活；损伤细胞分泌物损伤细胞分泌物Vir自身磷酸化自身磷酸化 VirG(转录因子转录因子) (3)T-DNA切割和切割和T-DNA复合物形成；复合物形成； virD基因产物对基因产物对T-DNA进行剪切进行剪切

7、virE2蛋白分子（为蛋白分子（为DNA单链结合蛋白）相结合，形成单链结合蛋白）相结合，形成T链复合物（链复合物（T-complex）。）。 (4)T-DNA复合物由农杆菌进入植物细胞；复合物由农杆菌进入植物细胞； T链复合物在链复合物在virD2和和virE2核定位信号（核定位信号（NLS）引导下以）引导下以virD2为先导被转运入细胞核为先导被转运入细胞核 (5)T-DNA整合到植物染色体上并且进行表达。整合到植物染色体上并且进行表达。1. 农杆菌的培养农杆菌的培养培养基：培养基： LB, YEM, YEB 生长周期生长周期: 固体培养固体培养1-2天，液体培养天，液体培养2-3天。天。

8、农杆菌接种后，一般需要在农杆菌接种后，一般需要在25-30 的条件下，的条件下，1-2小时才开始小时才开始分裂。因此当用抗生素筛选菌株时，需要在液体培养液中分裂。因此当用抗生素筛选菌株时，需要在液体培养液中2小时后小时后再加入抗生素，以便让抗性基因充分表达。再加入抗生素，以便让抗性基因充分表达。 2Vir区基因活化诱导物的使用区基因活化诱导物的使用乙酰丁香酮乙酰丁香酮(AS) ，羟，羟 基乙酰丁香酮基乙酰丁香酮(OH-AS) 使用方法：使用方法： 1, 在农杆菌培养液中加入在农杆菌培养液中加入AS。 2, 共培养基中加入。共培养基中加入。 3，在农杆菌培养液中和共培养基都加入，在农杆菌培养液中

9、和共培养基都加入AS。 使用的使用的pH值：值： 5.0-5.6, Vir区基因的诱导达到最高水平。区基因的诱导达到最高水平。3外植体的选择外植体的选择 转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期 细胞分裂周期的的细胞分裂周期的的S期（期（ DNA合成期）合成期） 合子胚、体细胞胚或者胚性细胞。合子胚、体细胞胚或者胚性细胞。 性质未定细胞：性质未定细胞： 分生组织，分生组织， 微管形成层，静微管形成层，静止薄壁组织及胚，雌、雄配子体，这些组织的细止薄壁组织及胚，雌、雄配子体，这些组织的细胞具有很强的分生能力，而且发育性质未定，当胞具有很强的分生能力，而且发育性质未

10、定，当这些组织发生创伤或者环境因素诱导时，则加速这些组织发生创伤或者环境因素诱导时，则加速分裂，形成愈伤组织或者迅速分化，趋向某一器分裂，形成愈伤组织或者迅速分化，趋向某一器官的发育、处于转化的敏感期。官的发育、处于转化的敏感期。 4外植体的农杆菌接种外植体的农杆菌接种 将外植体先切成小块，然后浸泡在制备好的农杆将外植体先切成小块，然后浸泡在制备好的农杆菌菌液中，浸泡一定时间后，然后用无菌滤纸吸干菌菌液中，浸泡一定时间后，然后用无菌滤纸吸干 注意事项：注意事项： 1，浸泡时间：浸泡时间：时间太长，外植体因农杆菌的毒害时间太长，外植体因农杆菌的毒害缺氧而软腐，一般缺氧而软腐，一般不超过不超过30

11、分钟分钟。 2，菌液浓度：菌液浓度：OD600 为为0.05-0.70之间。之间。5. 农杆菌与外植体的共培养农杆菌与外植体的共培养共培养共培养: 接种后的外植体培养在诱导愈伤组织接种后的外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽分化的固体培养基上，在外植体细胞分或不定芽分化的固体培养基上，在外植体细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切面也增殖生裂、生长的同时，农杆菌在外植体切面也增殖生长，这二者共培养的过程。长，这二者共培养的过程。 农杆菌转化时，并不侵入到植物细胞中，而农杆菌转化时，并不侵入到植物细胞中，而是把是把T-DNA转移到植物细胞中，农杆菌附着后不转移到植物细胞中，农杆菌附着后不能立即转化，

12、只有在创伤部位生存能立即转化，只有在创伤部位生存16小时之后的小时之后的菌株才能诱发肿瘤，共培养时间必须长于菌株才能诱发肿瘤，共培养时间必须长于16个小个小时。共培养时间过长，农杆菌过度生长，植物细时。共培养时间过长，农杆菌过度生长，植物细胞受到毒害而死亡。胡萝卜一般为胞受到毒害而死亡。胡萝卜一般为3天。天。6外植体的脱菌及选择培养外植体的脱菌及选择培养 脱菌培养脱菌培养，即把共培养后的外植体转移到含有，即把共培养后的外植体转移到含有脱菌抗生素的培养基上，以杀死或者抑制农杆菌的脱菌抗生素的培养基上，以杀死或者抑制农杆菌的生长。生长。 常用的抗生素有：常用的抗生素有： 羧苄青霉素，头孢霉素等使用

13、羧苄青霉素，头孢霉素等使用浓度一般为浓度一般为500mg/L。选择培养，选择培养，转化的细胞和未转化的细胞生长发育转化的细胞和未转化的细胞生长发育存在着竞争，如果转化细胞生长不起来，转化就不存在着竞争，如果转化细胞生长不起来，转化就不能成功。因此选择培养是转基因必须的步骤。能成功。因此选择培养是转基因必须的步骤。常用的选择压力有常用的选择压力有：Km，Hyg,除草剂除草剂ppt等。等。 l将根癌农杆菌菌株接入含有将根癌农杆菌菌株接入含有50 g/L的的Km的的YEB培养基，培养基，28，200rpm/min摇摇床旋转培养过夜，取床旋转培养过夜，取02m1接种接种20 ml新鲜新鲜 YEB培养基

14、（含培养基（含 Km 50gml），旋），旋转培养至转培养至 OD值为值为 06 左右。左右。离心离心10 min，弃上清，用，弃上清，用2-3mL的的附加乙酰丁香的的附加乙酰丁香酮酮 （AS）的）的MS共培养基共培养基(200uL乙酰丁香酮乙酰丁香酮 加入加入20mL MS共培养基共培养基)悬浮菌体，悬浮菌体，将菌液移入三角瓶，待用。将菌液移入三角瓶，待用。l在超净工作台上，将胡萝卜愈伤组织切成小块。在超净工作台上，将胡萝卜愈伤组织切成小块。l将愈伤组织小块浸入步骤将愈伤组织小块浸入步骤2所制备成的新鲜根癌农杆菌菌液所制备成的新鲜根癌农杆菌菌液中，并不时摇动，中，并不时摇动，20 min后吸

15、取菌液，并将愈伤组织置于无后吸取菌液，并将愈伤组织置于无菌滤纸上吸去多余菌液。菌滤纸上吸去多余菌液。l 随即将愈伤组织转移至含随即将愈伤组织转移至含 0.5mg/L 2，4-D MS固体培养基上，固体培养基上，26共培养共培养2-3 d，取出愈伤，用无菌滤纸吸去组织表面的菌，取出愈伤，用无菌滤纸吸去组织表面的菌液，并转入选择培养基，筛选抗性愈伤组织。液，并转入选择培养基，筛选抗性愈伤组织。l三天后进行三天后进行GUS基因的瞬时表达检测。基因的瞬时表达检测。实验步骤实验步骤 实验九实验九 植物体内植物体内GUS 基因的检测基因的检测 原理原理: GusA基因基因编码编码一葡糖苷酸酶基因一葡糖苷酸酶基因, 催化葡催化葡糖苷酸糖苷键水解糖苷酸糖苷键水解,其中很多水解产物具有发色团或其中很多水解产物具有发色团或形成荧光物质，形成荧光物质，可以用分光光度计、荧光剂和组织可以用分光光度计、荧光剂和组织化学法对其