PCR技术及其应用-

1、1张文举张文举生命科学学院生命科学学院2这些事件有何联系？这些事件有何联系？n末代沙皇尼古拉二世末代沙皇尼古拉二世n1918年的流行性感冒病毒年的流行性感冒病毒n电影电影侏罗纪公园侏罗纪公园n辛普森杀妻案辛普森杀妻案n曹操姓曹么？曹操姓曹么？这些事件都运用到了这些事件都运用到了PCR技术！技术！3DNADNA是最重要的生物大分子之一是最重要的生物大分子之一DNA分子经过多个层次的包装DNA双螺旋4DNA及其复制及其复制半保留复制一系列因子帮助DNA的复制5复制叉复制叉6DNA聚合酶聚合酶1）总是从5-3端复制；2）DNA的复制需要一小段RNA作为“引物”5-3端复制一段RNA作为“引物”7PC

2、R技术的发明技术的发明n基因克隆的需要催生了基因克隆的需要催生了PCR的发明的发明n1953年年 DNA双螺旋结构的发现双螺旋结构的发现n1956年年 DNA聚合酶的发现聚合酶的发现n1985年年 PCR的发明的发明DNA聚合酶的分离聚合酶的分离“引物引物”的合成的合成使极少量的使极少量的DNA样本进行了大量的扩增！样本进行了大量的扩增！8，PCR）91234522557294时间（min）温度（）PCR技术的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR反应过程PCR的特

3、点PCR的操作步骤10PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA955311PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物12PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶13PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点第1轮结束95第2轮开始14PCR的基本原理n

4、PCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50TaqTaqTaqTaq15PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束16PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 重复30轮后230=1,073,741,8241.8530=103,550,41717PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善n1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合

5、酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。18PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善n但测序和引物合成的困难n70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能n所以，Khorana的设想被人们遗忘了19PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善n1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）n实现了在试管中模拟细胞内的DNA复制。n然而，采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错20PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善n1988年初，Keo

6、hanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，特异性、真实性也较高，但每循环一次，仍需加入新酶。 n1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 n耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪21PCR技术的基本原理PCR反应过程PCR的特点PCR的操作步骤n灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.细菌、病毒检测的灵敏度可达3个拷贝n简便、快速1.一次性加好反

7、应液，14 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析n对标本的纯度要求低u血液、体液、洗嗽液、毛发、活组织、细胞、石蜡包块、古生物标本等的粗提DNA22PCR技术的基本原理PCR反应过程PCR的特点PCR的操作步骤标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugDNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L23PCR技术的基本原理PCR反应过程PCR的特点PCR的操作步骤2425PCR结果：1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）26Lambda DNA，模板量分别为100 pg, 10p

8、g, 1pg, 100fg , 10fg 27 2829330n可以在www.ncbi.nih/blast.cgi进行在线比较n通过OMIGA、Clustal X等软件进行两两或多序列的比较。引物序列同源性比对：31引物设计常用软件主要有：nPrimer Premier 5.0 nOligo 6nprimer 3nThe Primer GeneratornNet Primer 321. 将序列输入软件中（2）在表中粘贴序列（1）新序列两个方法33选择序列文选择序列文件所在位置件所在位置（2）打开原有的序列文件34 在对话框中输入待扩增序列 点击左上角的“Primer”按钮352. 设置相关参数

9、363. 得到的引物结果37Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构引物自身是否会形成发夹结构Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体同一种引物是否会形成二聚体False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对引物在待扩增序列中其他位置是否有配对Cross Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚体正向与反向引物间是否会形成二聚体正向和正向和反向引反向引物的互物的互换换正向和反向正向和反向引物的评价引物的评价正向和反向正向和反向引物的信息引物的信息每点击左每点击左边红色的边红色的按钮，就按钮，就出现相应出现相应的内容的内容对正向和反向引物进行编辑对正向和反向引物进行

10、编辑38可对引物进行增加或减少碱基用键盘输入5个碱基39引物的信息引物的信息改动后引物的信息40重新回到双引物的界面41“Edit”“Copy”“Sense Primer”5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 34. 输出引物序列42n引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC 纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。 普通PCR：OPC纯（95%） 较长引物（大于50个碱基） ：PAGE纯（95%） 经过修饰或标记的引物：HPLC纯（ 99%,但价格昂贵）n引物浓度：0.1-0.5 mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。 43 合成内容合

11、成内容产量产量(OD)发货时间发货时间(工作工作日日)纯化方式纯化方式价格价格(￥)普通引物合成(12kb）的功能较强。n Pfu DNA聚合酶 ：具有35外切酶活性的校对功能，催化DNA合成的忠实性比Taq聚合酶高12倍，但不适于2kb的片断扩增。4647484950二、PCR的衍生技术 逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR） 反向PCR（inverse PCR） 巢氏PCR（nesting PCR） 原位PCR（in situ PCR） 多重PCR（multiplex PCR） 多重等位基因PCR（multiplex allele PCR） 不对称

12、PCR（asymmertric PCR） 锚定PCR（anchored PCR） 长片段PCR（long fragment PCR） 荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）51逆转录酶DNA聚合酶活性mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增 52影响因素（1）模板对RT-PCR的影响 对RNA制品的纯度和完整性要求都极为严格 （2）逆转录酶对RT-PCR的影响 MLV逆转录酶能合成大于2kb的较长cDNA，但对热的稳定性较AMV逆转录酶差。 （3）逆转录引物对RT-PCR的影响 随机引物：原核细胞多用 oligo(dT)：真核细胞多用 基因特异性的引物（G

13、SP）：特异性强，广谱性低 53例子： S.pn的转化对PsaA基因mRNA表达的影响na、RNA的提取： 野生型和转化缺陷型S.pn都诱导转化后，采用Qiagen试剂盒进行总RNA提取。 nb、cDNA的制备： 取RNA 2l，随机引物1l，DEPC水9l，混匀后，70变性5min，立即置于冰上。然后顺序加入逆转录buffer 5l，dNTP 1.5l, RNasin 0.5l, DEPC水5l, 逆转录酶M-MLV 1l。混匀后于37，1小时，得到cDNA。nc、PCR扩增: PsaA的引物3L，cDNA 1L，Tag plus酶0.2L，共30L体系。循环参数：94 30秒，55 40秒

14、，72 45秒，循环30次。用16s rRNA的PCR产物为标准物，2%琼脂糖电泳。54 电泳结果用软件Quantity-one 3.2进行半定量比较，结果进行配对t检验分析00.40.501020Time after CSP added(min)EB density of PsaA/16S22d16S(463bp)PsaA(254bp)图2， 2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA mRNA的表达。 1 2 3 4 5 6 7图1， 2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA 的RT-PCR电泳图。line1: Marker2. line2-

15、4: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2 was added CSP. line5-7: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2d was added CSP. *555657转化到大肠杆菌后，提取质粒，采用质粒引物即可直接对X片断进行扩增后测序，得到X基因序列信息。（10/64）EGFPXdw序列序列Xdw序列序列质粒引物质粒引物质粒引物质粒引物质粒引物质粒引物例子：S.pn体内诱导基因序列的获得58 59 图1 第1、2、3组引物多重PCR电泳图 1：正常对照；2：DL2000 marker；3

16、10：检出的缺失型患者 杜氏/贝克型肌营养不良症 一种常见的致死性神经-肌肉系统的X连锁隐性遗传病，其基因突变中缺失最常见，约占55%65%，缺失分布的位点较多，随地域及民族的差异而有不同特点 60（1）随机突变：应用：构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特殊性质的突变个体 策略：易错PCR（error-prone PCR）。n利用Taq DNA聚合酶等耐热DNA聚合酶不具有35校对功能的特性，在PCR扩增反应中可能掺入错误的核苷酸，从而产生随机错误的扩增产物。n加入次黄嘌呤核苷酸并限制某一种核苷酸的用量，从而促进DNA聚合酶选择其它3种核苷酸或次黄嘌呤核苷酸，导致扩增产物发生突变。61（2）

17、定点突变（1）5端引入突变：通过修饰上游引物的5 端，即可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启动子序列等。（2）序列中的单位点突变：采用重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE PCR)62（A）为5端引入突变 （B）为单碱基突变63例子：S.pn的ply146aa缺失的突变序列构建 S.Pn的ply为一细胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗： 首先设计4个引物：（M1和M2完全重叠）P1: 5-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3 BamH IP2: 5-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGT

18、C-3 Xho IM1: 5-GGTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-3 M2: 5-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-3 64突变位点M2M1P2P1555335为酶切位点序列1. 以基因组DNA 为模板，以P1和M1为引物扩增出ply上游片断，以P2和M2为引物扩增出ply下游片断2. 以上下游片断为模板，以P1和P2为引物，扩出全长3. 酶切后克隆到质粒中保存65（3）多位点突变n策略：多次重叠PCRn关键：重叠引物的设计（每对突变引物需要部分重叠，方向相反）。6667A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达68三、实时荧光PCR

19、技术69Ct值的定义：PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。 实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。 70C(t)值的重现性n相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图n终点处检测产物量不恒定；C(t)值具重现性71荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量n初始模板量越多，初始模板量越多，C(tC(t) )值越小值越小

20、nC(tC(t) )与初始与初始模板浓度的对数值模板浓度的对数值成线性关系成线性关系72定量原理q初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值）qLog浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量确定初始模板的浓度73 I745353SGExcitationSGSGSGSGEmission 755353SGSGSGSGSGExcitationEmission 76优点n使用方便- 不必设计复杂的引物 n没有序列特异性，可和双链DNA结合（坏处？）- 可以用于不同的模板 n便宜 n灵敏77例子：荧光定量PCR检测肺炎链球菌comE基

21、因转录水平 方法流程：1、标准品制备：普通PCR扩增出comE基因片断装入克隆质粒定量稀释为109拷贝作为标准品备用2、定量检测comE基因表达水平：提取RNA逆转录成cDNA与成10倍梯度稀释的标准品一起作为模板，同时进行荧光定量PCR根据实验数据分析结果得到其表达的绝对量。78图图1 comE基因荧光定量基因荧光定量PCR扩增曲线扩增曲线图图2 comE基因荧光定量基因荧光定量PCR融解曲线融解曲线 表1 D39菌株在CSP诱导后不同时间的comE基因mRNA表达批次comE/16SrRNA0min10min*20min10.03410.95200.040220.19741.20470.1

22、11230.01240.40730.0160*：p0.05，CSP诱导10min时comE的表达量较0min和20min时显著增高实验结果：79Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量传递（荧光共振能量传递（FRET Probe）80双标记探针双标记探针（Taqman Probe）81优点n对目标序列有很高的特异性 -特别适合于SNP检测n是目前应用最广泛的一种技术TACCGGGGGTTACGAACG GTAATG A T C C T A C CG A T C C C A C CSNP检测82

23、RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标分子信标（Molecular Beacon Probe）83灵敏度高：荧光检测较电泳检测灵敏度高特异性高：引物和荧光探针定量准确：全程监控，准确的算法进行定量无需跑胶，自动化程度高封闭体系，环境污染少844通道实时荧光定量通道实时荧光定量PCR仪仪3、荧光定量 PCR仪85 PCR只是一个简单的不起眼玩艺 凯利穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 它最大的特点就是能不断推出新形式。 摘自Making PCR

24、: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow86PCR技术的应用 研究与生产基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断细菌、病毒、过敏原、寄生虫检测，肿瘤诊断 法医犯罪现场标本分析 其他87RACE扩增扩增cDNA末端克隆基因末端克隆基因OpADC的全长基因克隆88PCR方法检测方法检测mRNA表达量表达量89Real-time PCR检测检测mRNA表达含量表达含量90PCR方法检测食物过敏原方法检测食物过敏原扩增内标内标和目的条带同时扩增91PCR方法检测人类基因组中方法检测人类基因组中COMT基因基因的多态性（的多态性（SNP）通过测序方法检测基因的通过

25、测序方法检测基因的SNP92PCR方法检测婴儿性别方法检测婴儿性别n如何做？如何做？n先决条件？先决条件？93小小 结结nPCR的反应原理；的反应原理；nPCR的特点及局限性；的特点及局限性；nPCR的应用的应用94思考题1.一次特异性很好的PCR后，所得产物的长度都是一样的吗？2.PCR技术的核心思路是什么，还可以有哪些变化，以实现不同的研究目的？95n1998年年2月月，美国国防病理中心（，美国国防病理中心（AFIP）辖下所属的分子病理部门在）辖下所属的分子病理部门在阿拉斯阿拉斯加加的的 Brevig Mission附近发现了一具被完整冰封近附近发现了一具被完整冰封近80年的爱斯基摩女子的尸年的爱斯基摩女子的尸体。体。Brevig Mission 在在1918年年11月由于流感失去了月由于流感失去了85%的人口。的人口。4件样本的件样本的其中之一含有一些其中之一含有一些