出血性疾病筛查实验

1、二、血小板系统 2.1 P-选择素 选择素家庭有3个成员，L-选择素、P-选择素和E-选择素。P-选择素是位于血小板颗粒和内皮细胞WeibeI-Palade小体的一种糖蛋白，以血小板膜P-选择素和血浆P-选择素两种形式存在。血浆P-选择素检测稳定性高，不受标本制备和抗凝治疗的影响，当血小板激活或内皮受损，血浆P-选择素浓度升高，PTS时可增高，有资料表明，血浆P-选择素更能直接反映血小板的活化程度，是血小板激活的特异性分子标志物。有报道，在冠心病患者行经皮冠状动脉成形术(PTCA)5 min后，P-选择素即明显升高，提示血小板激活。急性冠状动脉闭塞与PT

2、CA后再狭窄可能与此相关。血浆血小板P选择素可用RIA检测。2.2血浆血小板球蛋白(-TG)测定(ELBA法)-TG是由血小板颗粒合成并分泌的一种血小板特异性蛋白质，当血小板被激活时由，颗粒中释放出来入血，导致血浆中含量增高，PTS时可增高，-TG通常用RIA法。2.3 11-去氢血栓烷B2(DH-TXB2) 血栓烷A2：A2(TXA2)是血小板花生四烯酸代谢产物之一，亦属血小板活化的标志物。因其半寿期短，无法检测，故多测其进一步转化为已无生物活性的TXB2，但后者含量受多种体外因素的影响。已有文献报道，血小板在体外活化时产生TXB2的能力为300-400ugL，远高于TX

3、B2的生理浓度(50-200ngL)，因此少量血小板在体外活化就可明显地增高血浆TXB2 的含量。近年来已有检测血浆DH-TXB2的报道，DH-TXB2是由TXB2在体内形成的半寿期长的酶代谢产物，由于它只在体内血小板活化后产生而不在体外形成，故DH-TXB2测定是反映体内血小板活化的理想指标，且其半寿期长(45min)，易于检测，PTS时，血浆HD-TXB2含量常增高，11去氢血栓烷B2可用ELISA法检测。2.4血小板颗粒膜蛋白-140(granulemembrane protein 140，GMP-140)GMP-140存在于血小板颗粒、致密体颗粒、溶酶体及

4、weibel-palabe小体中，当血小板激活时，释放入血浆，它可介导活化血小板或受损内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞的粘附，并促进单核细胞识别、清除活化血小板。在血栓形成时，血小板表面和血浆GMP-140增高，进入稳定期后则明显降低。2.5血小板第4因子(platelet factor4，PF4)PF4是由血小板颗粒合成和分泌的特异蛋白质，它可以与血管内皮细胞表面的硫酸乙酰肝素结合，使后者灭活，从而减少凝血酶的灭活，此外，PF4对血小板具有促进聚集作用，血栓前状态时，血浆PF4水平升高。三、凝血系统3.1血浆纤维蛋白肽A(FPA)测定 凝血酶作用于纤维蛋白原之后，首先从其A

5、(a) 链的氨基端裂解下一对由1-16号氨基酸组成的小肽，即FPA，分子量为1536。它是凝血酶作用于纤维蛋白原的早期产物，是反映凝血酶已形成的敏感指标。在取得特殊抗凝的血浆后必须立即测定，有ELISA法比较方便，PTS时含量常增高。3.2凝血酶原片段1+2(prothrombin fragmentF1+2,F1+2)凝血酶原激活物作用于凝血酶原，使其肽键Arg273-Tbr274及Arg322-21e323同时裂开，从N端释出，前者为Fl+2片段，后者为凝血酶，F1+2测定的意义：(1)F1+2升高见于血栓前状态和2550的易栓症。(2)作为口服抗凝和溶栓治疗的监测，但同

6、时需注意以下几点：(1)血浆F1+2水平与年龄、性别、种族、吸烟有关。(2)机体大运动量活动后血浆F1+2水平可明显升高。(3)F1+2对抗血小板药物无监测价值。3.3组织因子(tissue factor,TF)近年来大量研究表明，与内在凝血途径相比，TF途径在生理性止血过程与病理过程的血栓形成中具有重要意义。在血管壁受损时，受刺激的内皮细胞表达TF。3.4可溶性纤维蛋白单体复合物(soluble fibrin monomer complex,SFMC)SFMC是纤维蛋白单体与纤维蛋白原或纤维蛋白降解产物形成的可溶性复合物，在血栓前状态时SFMC血浆浓度

7、增高。3.5因子IX-35、IX-9肽片段和因子X-52、X-15肽片段。这4种肽片段水平分别反映因子和因子X被激活情况，血栓形成急性期其血浆含量升高，是血栓前状态特异性的和敏感的、因子标志物。3.5血浆蛋白C活化肽(PCP)测定 PCP是蛋白C在凝血酶TM复合物作用下，被激活时由其重链氨基端所释放的，由12个氨基酸组成的酶性肽段，在凝血酶生成增多时的PTS，血浆PCP含量可增高。3.7生理性抗凝蛋白3.7.1血浆蛋白C(PC)测定 PC为维生素K依赖性抗凝因子，其本身无酶活性，只有被凝血酶一TM复合物激活成人为活化的C(APC)时才有抗凝作用，后者的机制在于：APC可灭活

8、a和Va。APC有促进纤溶的作用。PC的含量或活性有缺陷可导致PTS或易栓症。遗传性PC缺陷症的发生率在成人为0.1-0.5，在血栓性疾患患者的发生率为2-5。PC的遗传性缺陷症分为两型：I型者PC含量和活性均下降，其活性含量比值0.75；型者其含量正常，活性下降，活性含量比较<0.75。3.4.2 血浆蛋白S(PS)测定  PS亦为维生素K依赖因子，主要具有以下功能；有加强APC对a和a的灭活作用；对补体激活有调节作用。血浆中PS的存在有两种形式：40为游离型PS；60与C4bp以1：1非共价键形式结合成结合型。游离型PS能促进APC灭活a，Va而起抗凝作

9、用。遗传性PS缺陷症的I型者其游离型PS含量及PS活性均减低，总PS含量减少，型者其游离型PS含量及总PS含量正常，PS活性减低，型者游离型PS含量及PS活性减低，而总PS含量正常，PS含量及活性减低时可导致PTS或易栓症。3.4.3活化蛋白C抵抗性(APC-R)检测  近年研究发现由于FV缺陷而导致活化蛋白C(APC)不能灭活其a致使APC不能发挥其抗凝作用，而该有缺陷的FV仍然具有凝血活性反而可导致血栓形成。PC含时用火箭电泳法。PC活性可用APTT法和ELISA法。PS抗原检测火箭电泳法。APC-R检测可用APTT法。四、纤溶系统4.1血浆Bl-15和B15-42肽段

10、  凝血系统被激活的同时，纤溶系统也被激活。B1-42和B15-42肽段均属纤溶活性增强的早期产物。纤溶酶作用于纤维蛋白I(纤维蛋白原失去一对FPA后的名称)，降解下B1-15片段；纤溶酶作用于纤维蛋白1(纤维蛋白原进一步失去一对FPB后的名称)，降解下B15-42肽段，此二肽段均为纤镕酶活性增强的早期降解产物，PTS时可见血浆中此二肽段的含时增高。血浆B1-15和Bl5-42肽段可用层析法检测。4.2血浆纤溶酶a2抗纤溶酶复全物(PIC) 由于纤溶系统中起核心作用的纤溶酶其半寿期极短，不便进行测定。既往常以血浆纤溶酶原含理下降和a2抗纤溶酶含时减低来推断纤溶酶活

11、性的增强，后则转而测定PIC的含量，后者含量增高提示纤溶酶生成增多。在PTS时血浆PIC含量常见增高。4.3 D二聚体(D dimer，DD) DD纤溶酶对交联的纤维蛋白降解产物之一。DD水平与纤溶系统的活性及血栓的溶解有密切关系，目前认为DD是反映体内纤溶酶活性的理想指标，同时也是评价凝血加速的一个有用指标。4.4 纤维蛋白原降解产物E碎片(FDP-E)及纤维蛋白原附属物A碎片 二者均为纤溶初期阶段形成的纤维蛋白代谢产物，是诊断纤溶亢进的敏感指标，血栓形成及溶栓治疗后，二者血浆水平升高。故可作为诊断及治疗监测指标。 临床出血倾向评估及筛选试验

12、的应用日期：2004-12-3来源：好医生网站  作者：上海第二医科大学附属瑞金医院 沈志祥 王黎字体：大 中 小 一、门诊患者出血倾向的评估对怀疑血小板减少，或者血管壁脆性增加的患者，可以进行毛细血管脆性试验、血小板计数和出血时间(BT)的检测。BT的检测过去我们常用Duke法检测出血时间，但由于扎针深度较难统一，现在已基本不用。目前推荐使用出血时间测定器法。测定器中含有统一规格的小刀，按下按纽后可以保证每次切割的伤口宽度及深度保持一致，同时用脉压带加压，BT为2.59分钟。出血时间延长，提示为血管性疾病或血小板缺少。但是BT结果敏感性不高，一些有轻度血小板减少的患者，BT仍可正常

13、。这时，我们可以进行阿司匹林耐量试验(ATT)检查。有出血倾向的患者服用0.6克阿司匹林后2小时和4小时所测得的BT比服药前延长2分钟以上，为阳性。该试验有助于检测出有轻度出血性疾病的患者。单纯性紫癜患者血小板计数和BT均正常，毛细血管脆性试验可为阳性，但也有假阴性者。    门诊经常遇到应用抗凝药物的患者。由于抗凝药物的不同，我们对其出血倾向评估所监测的指标也不同。对于口服华法林抗凝的患者，在开始口服抗凝剂时，应每天测凝血酶原时间(PT)共5天，以后每周23次，共12周。使PT维持在正常对照值的1.02.0倍，即2530秒。凝血酶原时间比值(PTR)=受检患者P

14、T/正常对照PT(正常值为1.00±0.05)，口服华法林患者维持在1.52.0为最佳。WHO推荐凝血酶原时间的国际化比率(INR)作为口服华法林的监测指标。INR=PTRISI(ISI为国际敏感指数)，ISI越低，INR越准确。一般以选用ISI值小于2.0的组织凝血活酶为妥。口服华法林用于预防血栓形成时可使INR达1.5，用于治疗时可使INR达2.03.0为宜。口服阿司匹林抗凝者，由于阿斯匹林可抑制花生四烯酸合成酶,减少血栓烷 A2(TXA2)形成,从而抑制血小板聚集和释放反应，防止血栓形成。若服用剂量大时，阿司匹林也可抑制血管内皮细胞合成前列环素，前列环素对血小板的聚集有强抑制作

15、用，若前列环素合成减少，则有利于血栓的形成。因此应对口服阿斯匹林的患者应进行出血时间、血小板聚集功能和血小板计数的监测。出血时间(BT) 推荐用出血时间检测器法。维持BT检测值是参考值(6.9±2.1分钟)的1.52.0倍为宜。血小板聚集试验(PAgT) 应用抗血小板功能药后使PAgT的抑制率维持在参考值的30%50%。血小板计数减低以参考值低限(100×109/L)的50%60%(即5060×109 /L)为宜。低分子量肝素(LMWH)是指相对分子量在10006000(平均<5000)的肝素。皮下注射每天一次的常规LMWH，勿需监测；但剂量增大时可考虑作L

16、MWH监测及血小板计数监测。治疗中LMWH的血浆浓度维持在0.51.0抗因子Xa单位/ml较宜。二、住院患者出血倾向的评估  住院患者出现大面积、多器官的出血多见于弥散性血管内出血。严重的肾功能障碍，如尿毒症以及可引起急性肾小管坏死的各种病因都可导致肾脏及全身血管内皮损伤，从而激活内源性凝血系统、激肽系统、纤溶和补体系统。同时坏死的肾皮质又可释放组织因子入血激活外源性凝血系统。内毒素、抗原抗体复合物等可促使血小板聚集和释放促进微血栓的形成。微血栓以及受损的内皮细胞又可激活纤溶系统，打破了凝血与抗凝的平衡，便发生了DIC。对于急性肾衰伴DIC患者的出血倾向的评估，可采取Minna等推荐

17、的诊断标准。(1)PT15s，血小板数100×109/L，血浆纤维蛋白原1.6g/L。(2)FDP大于正常值的2倍(16-40mg/L)，TT25s，优球蛋白溶解时间(ELT)120min。(3)D-D阳性。凡满足(1)中3项指标者即可诊断为DIC；满足(1)中2项指标和(2)中3项指标也可诊断为DIC；满足(1)中1项指标或全为阴性，必须满足(2)和(3)中指标才可诊断为DIC。严重肝病患者因肝脏合成的凝血因子、纤维蛋白原、抗凝血酶-III、蛋白C、蛋白S以及纤溶酶原减少，使凝血稳态更易被打破。对肝病患者进行出血倾向评估时，PT延长率：急性肝炎2025%，慢性肝炎2651%，肝硬化

18、71%，重症肝炎90% 。APTT延长率： 急性肝炎1015%，慢性肝炎1551%，肝硬化8285%，重症肝炎85100%。对凝血因子进行测定，因子VII是最早开始降低也是降低最多的因子，最后及减少最少的是因子V，当Fg小于1g/L时，提示预后不佳，而且FVIII:C/vWF:Ag 增高程度与肝病的严重程度呈正相关。肝病的DIC诊断标准为： BPC<50×109/L或进行性下降，或有下列二项以上血浆血小板活化产物水平升高：-TG、PF4、TXB2、P-选择素； Fg1.0g/L或进行性下降； 血浆因子VIII：C活性50%(必备)； PT延长5秒以上，或APTT延长10秒以上；

19、 3P试验或血浆FDP60mg/L或D-D升高(阳性)； 血浆凝血因子激活分子标志物(F1+2、TAT、FPA、SFMC)水平升高。三、新生儿出血倾向的评估  新生儿的止凝血系统尚未发育完善，储备能力有限，与成人相比有许多不同之处。新生儿的血小板数量与成人无异，但vWF量高于成人。孕妇随着妊龄的增加，各种凝血因子的量也增加，处于高凝状态。胎儿第1011周开始合成凝血因子，随着胎龄的增加，凝血因子的浓度增加，但是直至出生，其凝血因子的量一直低于正常成人，处于相对低凝状态。胎盘对凝血因子起到屏障的作用。新生儿肝脏合成凝血因子能力不足，合成的凝血蛋白功能不全，除纤维蛋白外，因子XII、VI

20、I、PK和蛋白C均有可能成“胎儿型”，新生儿基础代谢率快，使某些凝血因子的清除增加。新生儿抗凝物质的水平与凝血因子一样，随着年龄的增长而增加，出生时蛋白C和蛋白S<0.7U/L，AT-III的水平直至一岁左右才与成人相当。与之对应，新生儿的纤溶酶原约为成人的一半，2-抗纤溶酶约为成人的80%，但t-PA和PAI较高，约为成人的2倍。因此健康的新生儿出生时并无出血或血栓形成。1990年，M Andrew等报道了初生婴儿的维生素K依赖的凝血因子(II、VII、IX、X)和接触因子(XI、XII、PK、HMWK)均不足于成人的70%，凝血酶原生成延迟，且水平较低。若出生几天，维生素K摄入不足，

21、易患“新生儿出血症”，是一种自限性出血性疾病。该病与下列因素有关：维生素K通过胎盘量少，胎肝内储存量低；新生儿出生时肠道无细菌，维生素K的合成少；母乳中维生素K含量仅为15g/L(牛乳为60g/L)，故母乳喂养的初生儿多见；婴儿有先天性肝胆疾病或慢性腹泻者，影响肠粘膜对维生素K的吸收；母亲在孕期曾使用抑制维生素K代谢的药物。主要表现为出生后24小时后婴儿出现脐残端、皮肤受压及穿刺处、胃肠道的出血；头颅血肿，颅内、胸腔内或腹腔内出血。当患儿有出血现象时，应立即静脉注射维生素K11mg,可迅速改善出血；严重者，可输新鲜全血或血浆1020ml/kg。 有文献报道，新生儿维生素K依赖的凝血因子中因子V

22、II发育最快，在出生的24天即达到成人水平，其次为凝血因子II和X，因此出生3周后，新生儿的凝血酶原时间基本正常。新生儿出生时APTT的延长与其低活性的因子XI、XII的程度相一致。还有报道，新生儿因子VIII水平较低，但大于0.30，而血友病A的患者因子VIII水平小于0.25，故通过因子VIII的检测在新生儿期就可作出血友病的诊断。综上所述，在对新生儿进行出血倾向的评估时，不仅要测定凝血因子的量，还要综合考虑患儿的年龄及病情才能作出诊断。四、出血筛选试验的应用1.血管壁与血小板的筛选试验(1) 毛细血管脆性试验：毛细血管壁的完整性有赖于毛细血管的结构、功能和血小板质和量的正常，也与某些体液

23、因素有关。当这些因子有缺陷时，毛细血管的完整性就受到破坏。毛细血管脆性试验或称束臂试验是在上臂增加血管负荷，观察前臂一定范围内皮肤出血点的方法。本试验主要反映毛细血管结构和功能，也与血小板质和量有关。(2) 出血时间(BT)：是指刺破皮肤出血到出血自然停止所需要的时间。它反映血管壁通透性、脆性和血小板的数量与功能的试验。当血管壁破损后，血小板能否聚集到受损处，形成微血栓堵塞伤口。同时也反映了前列环素(PGI2)与血栓烷A2(TXA2)之间的平衡状态有无失衡。当PGI2减低，TXA2增高时，BT缩短；PGI2增高，TXA2减低时，BT延长。出血时间延长： 见于血管性疾病或血小板缺少症，如遗传性出

24、血性毛细血管扩张症、血管性血友病、维生素C缺乏、血小板减少、无力及一些血小板贮存池病等。出血时间缩短：见于血栓栓塞性疾病，如心脑血管性疾病、糖尿病伴血管病变、妊高症、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)以及DIC高凝血期。(3) 血小板计数：指单位容积的血液中血小板的数量。血小板计数是反映血小板生成与血小板消耗之间平衡的试验。血小板增加： 见于骨髓增生性疾病，如原发性血小板增多症、真红等；以及脾切术后、恶性肿瘤早期等。血小板减少： 见于血小板生成障碍，破坏过多或一些遗传性疾病。如再生障碍性贫血、急性白血病、血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、脾功能亢进、巨血小板综合征等。(4) 血块收缩时间(

25、CRT)：血液凝固后，血小板膜上的肌动蛋白与受体相互结合，肌凝蛋白与肌动蛋白微丝相互滑动，使血小板伸出伪足，牵动纤维蛋白网，从而使得血块收缩，挤出血清，使血块的止血作用更加牢固，在一定的条件下，按规定的时间观察血块收缩情况或计算血块收缩率，即为血块收缩试验。CRT与血小板数量与质量、凝血酶原、纤维蛋白原和因子浓度以及血小板数量有关，但主要反映了血小板的质量。血块收缩不佳：主要见于血小板功能数量的障碍以及纤维蛋白原异常，如血小板无力症、血小板减少性紫癜、血小板增多症、红细胞增多症、纤维蛋白原缺乏或增多症等。血块收缩过度：见于先天性凝血因子XIII缺乏症、严重贫血等。2.凝血因子的筛选试验(1) 活化的部分凝血活酶时间(APTT)：在37下，以活化剂(白陶土、硅藻土、凹凸棒粘土)激活凝血因子XII和XI，加入部分凝血活酶代替血小板提供磷脂，再加入适量的钙离子即可满足内源抗凝血的全部条件。从加入钙离子到血浆凝固所需的时间即称为活化部分凝血活酶时间。是内源性凝血系统较为敏感和常用的筛选试验。APTT延长： 主要见于内源性凝血途径中的凝血因子的缺乏或抗凝血因子的存在，最多见于血友病A、血友病B、血管性血友病和DIC患者。APTT缩短： 多见于血液高凝状态。(2) 凝血酶原时间(PT)：在受检者血浆中加入过量的组织凝血活酶和Ca2+，使凝血