实验九 细菌的生化鉴定

1、实验九 细菌的生化鉴定一、 实验目的1、了解细菌生理生化反应原理,掌握细菌鉴定中常用的生理生化反 应的测定方法;2、掌握糖发酵试验、淀粉实验、吲哚实验、 M.R. 及 V . P的原理、方 法及相应培养基的制备方法。3、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意 义;4、掌握以上实验的用途。二、实验原理各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有 的单细胞原核生物特性,这种差异就表现得更加明显。不同细菌 具有不同的酶系统,故不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白 类物质的能力不同,它们对物质的代谢谱和分解产物也就不同, 细菌的这种代谢特点可供鉴别细菌之用。用生理生化试验的方

2、法 检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物,从而鉴别细菌的 种属,称之为细菌的生理生化反应,其在菌株的分类鉴定中具有 主要意义。1、糖发酵实验不同的细菌含有发酵不同糖(醇的酶,因而发酵糖(醇的 能力各不相同。 其产生的代谢产物亦不相同,如有的产酸产气, 有的 产酸不产气。 酸的产生可利用指示剂来判定。 在配制培养基时预先加入溟甲酚紫P HS . 2 (黄色一 6 . 8 (紫色 ,当发酵产酸时, 可使培养基由紫色变为黄色。 气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管 中有无气泡来证明。 发酵后产生的有机酸:乳酸、 醋酸、 丙酸等 (溴 甲酚紫变色范围 pH5.26.8, pH6.8紫色 ; 发酵后产

3、 生的气体:甲烷、 氢、 二氧化碳等 (杜氏小管内有气泡, 产气漂浮 。 2、 M.R. 及 V .P 实验很多细菌, 如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸, 丙酮酸再被分 解,产生甲酸、乙酸、乳酸等,使培养基的 pH 降低到 4 . 2 以下, 这时若加甲基红指示剂呈现红色。 因甲基红指示剂变色范围是 pH4 . 4 (红色 -pH6 . 2 (黄色 。若某些细菌如产气杆菌,分解葡萄糖产 生丙酮酸,但很快将丙酮酸脱梭,转化成醇等物,则培养基的 pH 仍 在 6 . 2 以上,故此时加入甲基红指示剂,呈现黄色。甲基红试验是 用来检测由葡萄糖产生的有机酸,如甲酸、 乙酸、乳酸等。当细菌代 谢糖产生酸

4、时, 培养基就会变酸, 使加入培养基的甲基红指示剂由橘 黄色变为红色。 VP 试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性 或中性末端产物的能力,如丙酮酸。 丙酮酸经缩合、脱羧后生成乙酰 甲基甲醇,此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。 二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用,生成红色化合物。3、吲哚实验吲哚试验是用来检测吲哚的产生。 有些细菌能产生色氨酸酶, 分 解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。 吲哚与对二甲基氨基苯甲醛 结合,形成红色的玫瑰吲哚。4、淀粉水解实验微生物对大分子的淀粉、 蛋白质和脂肪不能直接利用, 必须靠产 生的胞外酶将大分子物质分解成小分子物质才能被微生物吸收利用。

5、 胞外酶主要是水解酶, 通过加水裂解大分子物质为较小的化合物, 使 其能被运输到细胞内。 如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、 双糖和单 糖; 脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸; 蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。 这些过程可以通过观察细菌菌落周围物质的变化来证实。 如可以用滴 加碘液到菌落周围看是否变蓝色来检查是否产生淀粉酶。 脂肪水解后 产生脂肪酸会使培养基 pH 下降,可以在培养基中事先加入中性红试 剂,培养基会从淡红色变为深红色。5、触酶实验触酶又称过氧化氢酶, 具有过氧化氢酶的细菌, 能催化过氧化氢 成为水和原子态氧,继而形成氧分子,出现气泡。 大多需氧和兼性厌 氧菌均产生过氧化氢酶,但链球菌科阴

6、性,故常用此试验来鉴定。 6、三糖铁实验(硫化氢产生实验某些细菌能分解含硫的氨基酸 (胱氨酸、半胱氨酸等 ,产生硫化 氢,硫化氢与培养基中的铁盐反应, 形成黑色的硫化铁沉淀,为硫化 氢试验阳性。细菌能发酵乳糖和蔗糖产酸或产酸产气(变黄 。 三、实验仪器、材料和用具1、实验仪器:37恒温培养箱。2、微生物材料:大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌种平板各 1个。3、试剂:40%NaOH 溶液、乙醚、甲基红试剂、 50g/L -萘酚 (95%乙醇溶液 、 30%双氧水和 1%溴麝香草酚蓝酒精液。4、用具:接种环、酒精灯、镊子、试管和杜氏小套管5、培养基及其配方:葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖 发

7、酵培养基(葡萄糖和山梨醇和三糖铁培养基。(1淀粉培养基 100ml (分装于四个三角瓶,包扎, 121126灭菌 20min :蛋白胨, 2g ; 可溶性淀粉, 0.4g ; 氯化钠, 1g ; 琼脂, 34g; 酵母提取物, 1g ;加单蒸水定容至 100ml ,调整 pH 为 7.2。(2 糖发酵培养基:100ml (分装于试管, 包扎, 105灭菌 20min :蛋白胨 2g; 氯化钠, 1g ; 葡萄糖, 1g ; 加单蒸水定容 100ml ; pH 调整为为 7.4。溴甲酚紫溶液(1.6%水溶液 1ml(3 M.R. 及 V .P 实验培养基 (葡萄糖胰蛋白胨水培养基 :100ml

8、(分 装于试管,包扎, 105灭菌 20min :蛋白胨 0.5g; K2HPO 4, 0.5g ; 葡萄糖, 0.5g ; 加单蒸水定容 100ml ; pH 调整为为 7.4。甲基红指示剂:0.1g 甲基红溶于 300ml 95%酒精中,再加入蒸馏水 200ml 。(4吲哚培养基(胰蛋白胨水培养基 :100ml (分装于试管,包扎, 105灭菌 20min 蛋白胨 1g ; 氯化钠, 0.5g ;加单蒸水定容 100ml 。(5三糖铁琼脂培养基(成品 :按培养基配方加。具体配方 (实验报告可以不抄 :蛋白胨 20.0g ; 牛肉膏 3.0g ; 乳 糖 10.0g ;蔗 糖 10.0g ;

9、葡萄糖 1.0g ;硫酸亚铁铵 (含 6个结晶水 0.5g ;酚 红 0.025g 或 5g/L溶液 5mL ;氯化钠 5.0g ;硫代硫酸钠0.5g ;琼 脂 12.0g ;蒸馏水 1000.0mL除酚红和琼脂外, 将其他成分加入 400mL 蒸馏水中,搅拌均匀, 静置约 10min ,加热煮沸至完全溶解,调至 pH7.40.1。另将琼脂加 入 600mL 蒸馏水中,搅拌均匀,静置 10min ,加热煮沸至完全溶解。 将上述两溶液混合均匀后,再加入酚红指示剂,混匀,分装试管 (12mm100mm ,每管约 24mL ,高压灭菌 105 20min,灭菌后置 成高层斜面,呈桔红色。四、实验原理

10、与步骤1. 糖发酵实验 试管标记:取分别装有不同糖类(如葡萄糖、蔗糖和乳糖等发 酵培养液的试管,根据需要培养的细菌做好标记(如大肠埃希菌、产 气肠杆菌、普通变形菌等和空白对照 。 接种培养:以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中, 空白对照中不接种,置 37恒温箱中培养,分别在培养 24h 、 48h 和 72h 观察结果。 观察记录:培养后各发酵管与空白对照相比,若接种培养液保持 原有颜色, 其反应结果为阴性, 表明该菌不能利用该种糖, 记录用 “-” 表示;如培养液呈黄色,反应结果为阳性, 表明该菌能分解该种糖产 酸,记录用“+”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应, 表明该菌

11、分解糖能产酸并产气,记录用“+” 表示;如杜氏小管内没 有气泡为阴性反应,记录用“-”表示。2. V.P. 试验 观察记录 ：加入 1ml 乙醚（作用是萃取出吲哚） ，震荡，静止片 刻使分层，沿管壁再在培养液中慢慢加入 10 滴吲哚试剂，使试剂浮 于培养物表面，形成两层，观察结果：如有吲哚存在，乙醚层呈现玫 瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“” 、 阴性用“”表示。 5、淀粉水解实验 把淀粉平板培养基平均分成 3 部分，分别接上提供的 2 种菌，留 一区作为对照。置 37培养箱内培养 24h。将平皿取出，打开皿盖， 加少量碘液于平板上，轻轻摇动平皿，使碘液均匀铺满整个平板。若 菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解。透明圈的大小， 说明该菌水解淀粉能力的大小。 6、触酶实验 取培养好的细菌于玻片上， 然后滴加 3%的双氧水数滴， 观察结果。 若立即出现大量气泡为阳性。无气泡为阴性。若有气泡产生，则说明 该细菌具有过氧化氢酶。 注意：3%的双氧水现用现配。 7、三糖铁实验 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜 面，置 36 1培养 1824h，观察结果。该培养基含有乳糖、蔗糖和 葡萄糖的比例为 10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产 酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触