马鞭草化学成分的研究

1、马鞭草化学成分的研究作者：孙成、李峰、李炎平、周明军 指导老师：杨勇勋年级专业：（2009级应用化工技术）摘 要：本论文由两部分组成，第一部分主要是对马鞭草的化学成分及药理作用作一介绍和说明；最后一部分是马鞭草的化学成分研究。为了寻找具有抗肿瘤等生理活性的环烯醚萜类化合物，我们对马鞭草进行了化学成分研究，现通过硅胶柱色谱等方法，从马鞭草中分离得一个化合物，并根据理化性质与核磁共振光谱，鉴定化合物为马鞭草苷，此化合物的分离与鉴定为下一步的新药开发奠定了坚实的基础。关键词：马鞭草 化学成分 环烯醚萜苷 马鞭草苷Abstract：This paper includes two chapters: p

2、art 1 is a review of the research progress on chemical constituents and bioactivity of Verbena officinalis L., the last part is the study on the chemical constituents from Verbena officinalis L.To find the iridoid glucosides constituents which have many bioactivities such as anticancer from Verbena

3、officinalis L., we investigated the chemical constituents of Verbena officinalis L. Now, one compound was isolated From the Verbena officinalis L. by the various chromatography such as silica gel column. On the basis of chemical evidences and extensive spectroscopic methods, the structure of the com

4、pound 1 was elucidated as verbenalin. The isolation and identify of compound 1 provide a basis of exploitation a new drug. Key words: Verbena officinalis L chemical constituents iridoid glucosides verbenalin1马鞭草研究现状1.1马鞭草概述马鞭草为马鞭草科多年生植物，又名紫顶龙牙草、燕尾草等，始载于名医别录1。马鞭草通常情况下高度为30-120厘米，主根近木质，黄白色，有多数须根；茎四棱形，

5、多分枝；双子叶对生；其花秋夏开放，成蓝紫色。马鞭草喜肥、喜湿润、怕涝、不耐干旱，但一般的土壤均可生长。广泛分布于中国的西南、江浙、陕西等地；其在国外分布亦广泛，主产热带美洲2。长期以来，马鞭草在中国被作为传统中药使用，其有清热解毒、活血散瘀、利水消肿等功效；可用于治疗疟疾、白喉、流行性感冒、咳嗽等病状。中国药典2005年版一部记载马鞭草用于经闭痛经、疟疾、水肿等病；现代医学研究表明马鞭草具有消炎、止痛、止血、抗菌等作用。国外对马鞭草的研究始于20世纪初，后来研究人员相继从马鞭草中分离出了环烯醚萜类、黄酮类、甾体类等几十种化合物，并确定部分化合物有免疫活性、抗癌、镇痛等药理作用3。1.2马鞭草药

6、理作用及临床应用1.2.1抗癌作用焦中秀、徐昌苏等研究者表明马鞭草醇提物对绒毛膜癌JAR细胞增值有明显抑制作用，具有抗绒癌作用，且有特异性4。1.2.2抗早孕作用马鞭草醇提物是孕妇忌用药物，南京医科大学一附院曾对76例停经33-42d的早孕妇女口服复方马鞭草粉剂，流产率达83.4%。张涛等发现马鞭草甲醇提起物对大鼠的妊娠率达到80%。进一步研究证明马鞭草苷、戟叶马鞭草苷和3、4二氢甲马鞭草苷均能显著增加大鼠子宫平滑肌条的收缩频率和振幅，从而更深入说明马鞭草具有抗早孕的作用4。1.2.3免疫调节作用刘玉琴对645例免疫性不孕者（血清抗精子抗体AsAb）、抗子宫内膜抗体（EmAb）、康卵巢抗体（A

7、oAb）、抗心磷脂抗体（AcAb）的阳性率分别为83.1%、7.4%、4.2%、40.9%。当中的580例施以以马鞭草为主的药方进行治疗，与只服用强的松对照组65例病人对比，前者的1、2、3个疗程的转阳率及总妊娠率分别比后者高出47.1%、26.7%、16.3%、46.1%，显示了确切的免疫调节作用5。1.2.4抗炎抗病毒作用N.E.Hernandez等发现马鞭草对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有明显的抑制活性，并表明这方面的活性与马鞭草中所含的黄酮类化合物有关。1.2.5其他作用马鞭草对哺乳动物有持久的促进乳汁分泌的作用；可促进家兔的血液凝固，对交感神经末梢小剂量兴奋，大剂量抑制；对疟原虫有抑

8、制作用，可使疟原虫变形。此外，马鞭草和其他草药一起作为日常保健可以降血糖、血压，可以抑制饮食中放射性元素的吸收。同时，马鞭草中马鞭草苷具有多种药理活性，尤其是在神经保护方面，起作用机制更是多靶点、多环节、多途径的；因此对老年痴呆、帕金森氏病等神经衰退病变的防治具有很大的应用价值6。1.3马鞭草化学成分研究现状1.3.1三萜类化合物三萜类化合物广泛存在于植物界，具有明显的生物活性，因此其是科研的热点。1986年，A.M.Makboul从马鞭草中分离出三萜类化合物熊果酸又名乌苏酸，具有广泛的生物学效应，其突出作用为抗肿瘤、对多种致癌、促癌有抵抗作用、对多种恶性肿瘤细胞也有抑制作用7。1.3.2甾体

9、类化合物甾体类化合物也广泛存于植物中，目前用于治疗的已超过150种。但在马鞭草中目前研究的不多。1985年我国科学家桂承会等从马鞭草中分离出-谷甾醇，填补了国内对马鞭草化学成分研究的空白8。1.3.3挥发油类化合物1996年，Jean-Claude Chakhat通过水蒸汽蒸馏，以GC和GC-MS法从得到的马鞭草叶的总挥发油中鉴定出40多种挥发性化学成分，其主要含有柠檬烯、氧化石竹烯、斯巴醇类等9。1.3.4脂肪酸类化合物1996年，J.L.Guil等人以GC法系统研究了马鞭草中的脂肪酸的种类和数量，发现了含有丰富的C14到C24长链饱和脂肪酸以及相同碳链长度的10种不饱和脂肪酸；同时他们通过

10、紫外光谱法发现其含有大量草酸10。1.3.5糖苷类化合物1908年，L.Bourdier就从马鞭草中分离出了第一个化合物马鞭草苷。1973年Horst Rimper等人从马鞭草和戟叶马鞭草中均分离出另一种重要的环烯醚萜类化合物戟叶马鞭草苷。1986年，A,M,Makboul从马鞭草中分离的到 一种新骨架环烯醚萜类糖苷-桃叶珊瑚苷11。此外，1998年J.L.Guil Guerrero等人还研究了马鞭草的无机成分，分析结果发现其含有丰富的Mg、Ca，另外还含有大量的K、Na、无机N、无机P和微量元素Cu、Zn、Mn。1.3.5.1马鞭草糖苷类化合物研究现状实验已经证实马鞭草苷、戟叶马鞭草苷、毛蕊

11、花苷是马鞭草水溶性成分中重要的糖苷类化合物。在生物活性方面1998年Singh B发现马鞭草苷口服给药对小鼠具有明显保护肝的作用；2001年张涛等发现马鞭草中的马鞭草苷、戟叶马鞭草苷和3、4二氢甲马鞭草苷均能显著增加大鼠子宫平滑肌条的收缩频率和振幅与马鞭草醇提物抗早孕有关12。在衍生物合成方面，1962年G.Buchi等在确定其立体化学结构时做过催化氢化等反应；1980年前后S.Damtoft对其生物合成进行了研究。波兰Milkowska-Leyck.K等总结了环烯醚萜类化合物涉及到了14个化合物的生物活性，包括抗细菌、抗真菌、抗过滤性病原体、抗炎、止痛、抗肿瘤以及治疗风湿等13。即便如此，马

12、鞭草化学成分的研究还是处于初级和发展阶段。如今在人们生活水平提高的同时，各种患高血脂、动脉硬化等病人的数量亦不断上升，人们对药物的需求量也不断增大。马鞭草以其丰富的资源、较低的价格、较强的药理作用赢得了研究者们的亲睐，再加之各种科学技术的发展，为马鞭草的研究提供了技术的可能性，马鞭草化学成分的研究引起了一轮热潮。本次我们决定选择马鞭草水溶性成分进行提取分离。查文献资料可知，其水溶性成分主要为环烯醚萜类化合物，是马鞭草中重要的活性物质之一，含量较高，相对容易提取；其次据研究发现环烯醚萜化合物是一些植物体内自身的防御性物质，具有抗癌、免疫调节等广泛生物活性，我们认为其含有治疗癌症、抗肿瘤的有效成分

13、14。2马鞭草化学成分的研究2.1提取分离原理解析2.1.1提取分离方法的选择从药材中提取天然活性成分的方法有溶剂法、水蒸汽蒸馏法及升华法等。后两种方法的应用十分有限，大多数情况下是采用溶剂法。溶剂法系选择适当溶剂将中草药中的化学成分从药材中提取出来，是根据“相似相溶”这一原理进行的。植物成分中萜类、甾体类等脂环类及芳香类化合物因极性极小，易溶于氯仿、乙醚等亲脂性溶剂中；而糖苷、氨基酸类等成分则极性较大，易容于水和含水醇中。此次我们将分离马鞭草中的环烯醚萜类化合物，所以应选择极性较大的溶剂进行提取。查文献可知，水、甲醇、乙醇等都是马鞭草的良好溶剂15。为了考虑到分离化合物的多样性和实验方便，我

14、们选择95%的乙醇作溶剂，因为水对非极性化合物溶解不好，不利于多样性的选择；甲醇有巨毒，不利于实验操作，同时不利于投入中式和生产；而乙醇对极性和非极性化合物都有较好的溶解性，又没有巨毒。此外，考虑到马鞭草有效成分可能不稳定，和实验条件的限制，我们采用溶剂法中的渗渍法在常温常压下提取其化学物质。2.1.2大孔树脂柱色谱的选择大孔树脂吸附柱是利用分子间范德华力和氢键的相互作用力而工作的，大孔树脂是吸附性和分子筛选原理相结合的分离材料。根据吸附作用的强弱选用不同的洗脱液或不同浓度的同一溶剂，常见洗脱液有：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。对非极性大孔树脂，洗脱液极性越小，洗脱能力越强；对于中等极性的大孔

15、树脂和极性较大的化合物来说，则选用极性较大的洗脱液为宜。大孔树脂现在已被广泛应用于天然化合物的分离和富集工作中，如苷与糖类的分离、生物碱的制备，在多糖、黄酮、三萜类化合物的分离方面都有很好的实例。大孔树脂对糖类吸附能力很差，对色素的吸附能力很强。利用大孔树脂的多孔结构和选择性吸附功能可提取分离中药中的精致部位或有效成分，最大限度的去粗取精；目前这项技术已广泛运用于各类中药有效成分提取及中药复方的现代化研究中16。我们选择大孔树脂吸附柱分别用浓度为10%、20%、30%、40%、95%的乙醇作冲洗液，以出去酚类、鞣质类、黄酮类等杂质。2.1.3硅胶柱的选择在天然有机化合物分离和精制过程中，吸附现

16、象利用的十分广泛。其中以固-液吸附用的最多，并有物理吸附、化学吸附及半化学吸附之分。其中硅胶、氧化铝为吸附剂进行的吸附色谱属于物理吸附，实际工作中最常用。使用过程中吸附剂目粒大小、装柱溶剂、洗脱剂的选择要根据实际需要而确定16。本次我们选择硅胶吸附柱色谱，用蒸馏水装柱，分别用体积比为10：1、10:2、10:3的氯仿-甲醇作洗脱液。2.1.4薄层色谱的选择薄层色谱分离是色谱法的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术。它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量（几到几微克）样品的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加大加厚，又可以用样精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较

17、高温度下易发生变化而又不能用气相色谱分离的物质。此外，薄层色谱还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种预试。我们将利用薄层色谱的这些优点对马鞭草水溶液成分进行最后分离。 2.2提取分离药品和仪器据文献报道，在研究马鞭草化学成分时，一般选择马鞭草全草（地上部分）作为研究对象。本次我们将其根部和地上部分一起提取分离，以期获得不同结果。还需要药品：95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、氯仿、大孔树脂、硅胶粉等。仪器：旋转蒸发皿（型号：RE-5205.上海亚荣生化仪器厂)、真空泵（SHZ-3型）、层析缸、气泵、量筒、烧杯、移液管、硅胶柱、分液漏斗、注射液小瓶等。2.3提取分离工艺流程根据文献资料

18、可知，张承忠在分离蒙古醚苏中的环烯醚萜类化合物成分时，用乙醇回流提取之后在用丙酮溶解，粗提物先经聚酰胺柱，不同粗组织在经反复硅胶柱层析，用不同溶剂洗脱，最后得到3种化合物。张涛等人用甲醇作溶剂提取马鞭草粗末后，回收甲醇至浸膏，用硅藻土干燥后上硅藻土柱，用不同溶剂洗脱，洗脱液分别回收至三部分，第三部分经反复硅胶层析则可得3个化合物。参照前人研究经验，我们将马鞭草根和地上部分共2500g粉粹，用95%乙醇（13L左右）在常温下浸析三次，每次间隔时间为1天，然后减压蒸馏粗滤液，得粗浸膏0.4kg。向浸膏中加入蒸馏水进行转溶，并用石油醚萃取，重复操作4次，以出去水不溶性杂质。向水溶性物质中加入乙酸乙酯

19、萃取4次，进一步出去脂溶性杂质，得除酯层液。将除酯层液反复减压蒸馏至出尽有机溶剂为止。将蒸馏品加蒸馏水稀释过大孔树脂以出去酚类、鞣质类、黄酮类等杂质，让我们需要的环烯醚萜类化合物停留在大孔树脂内。然后分别用10%、20%、30%、40%、95%乙醇溶液700ml洗柱，并分别回收冲洗液。分别对冲洗液在40摄氏度的温度下减压蒸馏并回收精馏品，经观察10%、20%冲洗液颜色较浅，化合物组分较少，易分离。故我们决定将10%、20%精馏品混合加入适量硅藻土干燥得粉末，将其加入已经装好的硅胶柱中，分别用体积比为10：1、10：2、10：3的氯仿-甲醇液冲洗，同时用注射液小瓶回收洗液并做好编号记录（因过柱速

20、度太慢，用气泵加压提速）。制备薄层色谱板若干（小板用于测试，大板用于最后分离。），对回收洗液用毛细管点板测试，并观察点板，发现7-39号分离效果比较明显，将7-39号洗液混合在30摄氏度的温度下减压蒸馏至粉末。用甲醇溶液溶解粉末，将溶解液点薄层色谱板（60ml羟甲基纤维素钠和20g硅胶粉铺板）共点4块该类板。放入层析缸中待层析好后在紫外分光光度计下查看斑点，并用铅笔勾出斑点范围，然后用小刀将圈好的部位削下，装进柱中用甲醇溶液冲洗；最后进行氢谱、碳谱分析推断其结构。2.4结构鉴定核磁共振谱是有机化合物结构解析中最为有力的工具，特别是近十年发展起来的具有高分辨能力的超导核磁分析技术，不断提高了图谱

21、质量。故我们选择核磁共振谱对分离物进行结构推测，其核磁共振氢谱、核磁共振碳谱图见附图。经观察化合物为一白色无定形粉末，TLC色谱：在254nm下有荧光熄灭暗斑，硫酸乙醇显色后显黑色。由13C-NMR的化学位移数据可知该物质可能有一个甲基碳（20.596），三个sp3次甲基碳（29.890，43.519，49.000），一个sp3亚甲基碳（45.462），一个甲氧基碳（51.979），一个非糖端基半缩醛碳（51.979），四个sp2碳（215.814，168.814，153.816，105.452）。同时13C-NMR图谱给出了一组六碳单糖基信号峰（97.077，78.367，77.930，74

22、.636，71.554，62.727）。于上初步分析1H和13C-NMR的数据表明该白色无定形粉末分子结构由环烯醚萜苷元和一个六碳糖基两部分组成。其次看其1H-NMR化学位移值，最左边化学位移值为7.46796、7.46521说明该化合物可能含有一个双键的碳氢-CH=C-和环烯芳烃结构；最右边化学位移值为0.96522在1左右波动说明其可能有CH3质子信号；化学位移值在2.02792到2.56500说明其可能含有CH2质子信号；中间化学位移值在3.20109到3.90319较多，说明可能含有糖基，甲氧基；化学位移值在4.65417到4.89754和化学位移值在5.23063到5.24835说明

23、其可能有-CHO-O-基团，证实初步分析正确。从核磁共振氢谱图，可知从左到右峰的积分高度比约为1:1:1:7:6:4:4，由于峰面积正比于质子的数目，所以可以判断其质子数可能为24。核磁共振碳谱图中共有碳棒17根，判断该化合物有17个碳；其化学位移值从左到右依次为215.814、168.814、153.816、105.452、100.554、97.077、78.367、77.930、74.636、71.554、62.727、51.979、49.000、45.462、43.519、29.890、20.596，分别于马鞭草苷的C6、C11、C3、C4、C1、C1*、C5*、C3*、C2*、C4*、

24、C6*、OMe、C5、C7、C9、C8、C10的化学位移值相近，并且氢质子也得到完全归属，总结上述说论再参考文献确定其为马鞭草苷。分子式为C17H24O10，结构式为：2.5小结通过本次探究性实验使我们彻底的了解了目前马鞭草化学成分国内外研究现状及其药理作用；建立了马鞭草水溶性成分的提取分离方法；学会了用波谱分析对未知物进行结构推断；并提取了一个化合物-马鞭草苷，达到了预期目标。虽然不是首次从马鞭草中提取分离，但对马鞭草化学成分的研究具有借鉴作用，我们以后还会尝试用不同的方法去探究马鞭草的化学成分，以期发现新物质，新的活性成分。参考文献：1田箐,赵毅明，栾新慧.马鞭草化学成分的研究J.中国中药杂志，2005,30(4)：2682刘宏民，鲍峰玉，阎学斌. 马鞭草化学成分的研究J.中草药，2002，33（6）：4923金伟军，张志东.马鞭草研究进展J.时珍国医国学，2007,18(3)：14徐昌芬，卢小东，焦中秀，等马鞭草抗早孕作用机理的初步研究南京医科大学学报，1998,18：402-4065中国药典委员会.中国药典，部S.北京：化学工业出版社，20