生物化学A之蛋白质2016

1、1Biochemistry 生物化学生物化学To be lectured by : Prof. 杨海灵公共邮箱：公共邮箱：biochemistry_biochemistry_通用密码：通用密码：2008080820080808蛋白质的主要生理功能蛋白质的主要生理功能 蛋白质（蛋白质（proteinprotein）是生活细胞内含量最丰富、功能最是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。的命题。

2、生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者，具有以下主要功能：的体现者，具有以下主要功能：催化功能；结构功能；调节功能；催化功能；结构功能；调节功能；防御功能；运动功能；运输功能；防御功能；运动功能；运输功能；信息功能；储藏功能信息功能；储藏功能 绪言3蛋白质的分类蛋白质的分类v简单蛋白质简单蛋白质(simple protein)(simple protein)：仅由氨基酸组成，如核糖核仅由氨基酸组成，如核糖核 酸酶、肌动蛋白等。酸酶、肌动蛋白等。v结合蛋白质结合蛋白质(conjugated protein)(conjugated

3、protein)：包含辅基或配体包含辅基或配体单体蛋白质单体蛋白质( ( monomericmonomeric protein ) protein ) ：仅由一条肽链组成，仅由一条肽链组成，如溶菌酶、肌红蛋白等。如溶菌酶、肌红蛋白等。寡（多）聚蛋白寡（多）聚蛋白( ( oligomericoligomeric protein ) protein ) ：由两条或多条由两条或多条多肽链构成，如血红蛋白（多肽链构成，如血红蛋白（ 2 2 2 2） 己糖激酶（己糖激酶（ 4 4）。）。I. I. 按蛋白质的组成按蛋白质的组成4v纤维状蛋白质纤维状蛋白质( fibrous protein )( fibr

4、ous protein ) ：主要主要起结构作用，不溶于水和稀盐溶液，胶原蛋白、起结构作用，不溶于水和稀盐溶液，胶原蛋白、弹性蛋白等弹性蛋白等。v球状蛋白质球状蛋白质( globular protein )( globular protein ) ：大多数大多数可溶蛋白都为球蛋白，如胞质酶类。可溶蛋白都为球蛋白，如胞质酶类。v膜蛋白膜蛋白( membrane protein )( membrane protein ) ：与细胞内的膜与细胞内的膜系统结合在一起，如通道蛋白、受体蛋白系统结合在一起，如通道蛋白、受体蛋白II.II.按蛋白质的形状和大小按蛋白质的形状和大小Biochemistry 生

5、物化学生物化学第三章：蛋白质一氨基酸化学二蛋白质的共价结构。三蛋白质的三维结构：以肌红蛋白为例。四蛋白质结构与功能的关系： 1）血红蛋白的别构效应。 2）血红蛋白分子病。五. 蛋白质的分离纯化和表征。6第一节第一节 氨基酸化学氨基酸化学蛋白质用蛋白质用H H+ +，OHOH- -或或酶酶彻底水解，可以得到许多彻底水解，可以得到许多种氨基酸的混合物，种氨基酸的混合物，氨基酸氨基酸是构成蛋白质的基本是构成蛋白质的基本单位。单位。 组成蛋白质的基本组成蛋白质的基本( (标准标准) )氨基酸（氨基酸（amino amino acidacid，AaAa）有有2020种种。这些氨基酸中，大部分属于这些氨基

6、酸中，大部分属于L-L- - -氨基酸氨基酸。其中，。其中，脯氨酸脯氨酸属于属于L-L- - -亚氨基酸，而亚氨基酸，而甘氨酸甘氨酸则属于则属于 - -氨基酸。氨基酸。7一、蛋白质一、蛋白质的基本单位的基本单位H3NCHCOOR-+H2NCHCOOHR或或结构通式结构通式(投影式投影式)与羧基相邻的与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而碳原子上都有一个氨基，因而称为称为-氨基酸氨基酸8构型：构型：分子中各原子或基团之间的连接方式称为分子的构型。分子中各原子或基团之间的连接方式称为分子的构型。组成蛋组成蛋白质的氨基酸除白质的氨基酸除GlyGly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同以外都

7、有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-D-型和型和L-L-型。型。 L- -氨基酸的分子构型氨基酸的分子构型(configurition)91.1 common structural of a-amino acids n特征：特征： - -氨基酸分子中的氨基酸分子中的 - -碳碳（分子中第（分子中第2 2个碳，个碳，C C ）结合着一）结合着一个碱性的氨基和一个酸性的羧基，个碱性的氨基和一个酸性的羧基，此外此外C C 还结合着一个还结合着一个H H原子和一个原子和一个侧链基团（用侧链基团（用

8、R R表示）。表示）。n每一种氨基酸的每一种氨基酸的R R都是不同的，侧都是不同的，侧链上的碳依次按字母命名为链上的碳依次按字母命名为 、 、 和和 碳，分别指的是第碳，分别指的是第3 3、4 4、5 5和和6 6位碳。位碳。-氨基酸的结构通式第一节 氨基酸102. 2. 基本氨基酸基本氨基酸( (standard amino acids)standard amino acids) 的分类、结构及代号的分类、结构及代号 (1)(1)按按侧链侧链R R基的结构基的结构氨基酸的氨基酸的分类分类11(2) (2) 按按侧链侧链R R基的极性基的极性甘氨酸甘氨酸 （Gly,G）丙氨酸丙氨酸 （Ala,

9、A）缬氨酸缬氨酸 （Val,V）亮氨酸亮氨酸 （Leu,L）异亮氨酸异亮氨酸 （Ile,I）中性脂肪族氨基酸中性脂肪族氨基酸含羟基或硫脂肪族氨基酸含羟基或硫脂肪族氨基酸丝氨酸丝氨酸 （Ser,S）苏氨酸苏氨酸 （Thr,T）半胱氨酸半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸甲硫氨酸 （Met,M）酸性氨基酸及酰胺酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸天冬氨酸 （Asp,D）谷氨酸谷氨酸 （Glu,E）天冬酰胺天冬酰胺 （Asn,N）谷氨酰胺谷氨酰胺 （Gln,Q）碱性氨基酸碱性氨基酸赖氨酸赖氨酸 （Lys,K）精氨酸精氨酸 （Arg,R）组氨酸组氨酸 （His,H）杂环杂环杂环氨基酸杂环氨基酸组氨酸组氨酸 （His,

10、H）脯氨酸脯氨酸 （Pro,P）芳香族氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸 （Phe,F）酪氨酸酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸色氨酸 （Trp,W）183. 蛋白质分子中在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为非标准(non-standard)氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本(标准)氨基酸衍生而来的。NHHOCOOH4-羟基脯氨酸H2NCH2CHCH2CH2CHCOOHOHNH25-羟基赖氨酸NH2CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH6-N-甲基赖氨酸HOIICH2CHCOOHNH23,5-二碘酪氨酸 硒代半胱氨酸其中重要的有：20二、天然的非蛋白质氨基酸二、天然的非蛋白质氨基酸

11、瓜氨酸：瓜氨酸：如在尿素循环中的关键代谢中间产物：鸟氨酸：鸟氨酸：H2N-C-NH-CH2-CH2-CH2-CH-COOONH3H3N-CH2-CH2-CH2-CH-COONH3+非编码氨基酸非编码氨基酸：天然氨基酸的衍生物天然氨基酸的衍生物, ,如：脯氨酸如：脯氨酸羟脯氨酸（羟脯氨酸（Pro-Pro-HypHyp),),赖氨酸赖氨酸羟赖氨酸羟赖氨酸 ( (Lys-HylLys-Hyl) )，谷氨酸谷氨酸焦谷氨酸焦谷氨酸 Glu-(Pyro-GLuGlu-(Pyro-GLu)半胱氨酸半胱氨酸胱氨酸胱氨酸 等等 特点：特点： 是组成蛋白质的构件；均有各自的遗传密是组成蛋白质的构件；均有各自的遗传

12、密 码码 ；无种属特异性；无种属特异性 。编码氨基酸（编码氨基酸（2020种）种）定义定义：组成蛋白质的氨基酸称编码氨基酸组成蛋白质的氨基酸称编码氨基酸 ( (标准氨基酸标准氨基酸) ) 221. 1. 氨基酸的一般物理性质氨基酸的一般物理性质 1). 1). 味感：味感：其味随不同氨基酸有所不同。谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。2).2).旋光性：旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性。3).3).光吸收：光吸收：在近紫外区(220-300nm) 酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。三三. . 氨基酸的主要理化性质氨基酸的主要理化性质23 酪氨酸的酪氨酸的 max275nm， 2

13、75=1.4x103; 苯丙氨酸的苯丙氨酸的 max257nm， 257=2.0 x102; 色氨酸的色氨酸的 max280nm， 280=5.6x103;氨基酸的光吸收氨基酸的光吸收24不同不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在：时氨基酸以不同的离子化形式存在： H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+ H+ OH-+ H+ OH-H2NCHCOOR-正离子正离子两性离子两性离子负离子负离子 氨基酸所带静电荷为氨基酸所带静电荷为“零零”时，溶液的时，溶液的pHpH值称为该氨基值称为该氨基酸的酸的等电点等电点（isoelectricisoelectric point point），），以以p

14、IpI表示。表示。2. 氨基酸的主要化学性质氨基酸的主要化学性质(1) (1) 氨基酸的离解性质及等电点氨基酸的离解性质及等电点25对于侧链R基不解离得中性氨基酸来说，pI=1/2（pKa1+PKa2）。对于有多个解离基团的氨基酸来说，只要写出它的解离公式，然后取等电兼性离子两边的pKa的平均值则得出其pI值。pI=1/2（pKa左+PKa右）26 实验证明等电点时氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。 当溶液的pH=pI时，氨基酸主要从两性离子形式存在。 pHpI时，氨基酸主要以负离子形式存在。 H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-

15、+H2NCHCOOR-H2NCHCOOHR2720种常见的蛋白质氨基酸的物理化学常数28第一节 氨基酸1.4. 氨基酸的化学反应1.4.41.4.4巯基反应：巯基反应：胱氨酸中的二硫键在稳定蛋白质构象中起很大作用。胱氨酸中的二硫键在稳定蛋白质构象中起很大作用。氧化剂和还原剂氧化剂和还原剂都可打开二硫键。都可打开二硫键。29I I 多肽多肽肽键Peptide bond formation by CONDENSATION 缩水反应缩水反应第二节：蛋白质的共价结构第二节：蛋白质的共价结构30The structure of a pentapeptide(五肽五肽)Ser-Gly-Tyr-Ala-Le

16、u多肽的生物化学性质多肽的生物化学性质v 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。多肽链有两端：N 末端：多肽链中有自由氨基的一端；C 末端：多肽链中有自由羧基的一端。v 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。 氨基酸的平均分子量约为110.v 通常将分子量5000以下者称为肽，分子量5000以上者称为蛋白质。v 肽的酸碱性质主要决定于肽键中的游离末端-NH2 、游离末端- COOH以及侧链R基上的可解离功能团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链上的。32天然存在的活性肽天然存在的活性肽定义：定义：指生物体内具有调节功能的肽。广义上指一切具有生物学

17、功能的肽，包括少数起保护作用的肽。生物活性肽是沟通细胞之间和器官之间信息的重要化学信使。已知很多激素属于肽类物质。33兴奋剂目录之肽类激素兴奋剂目录之肽类激素34GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+ NADP+ 谷胱甘肽：谷胱甘肽：GSHGSH35II II 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置称为蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置称为蛋白质的一级结构的一级结构(primary structure)(primary structure)。例：例：牛胰岛素的一级结构牛胰岛素的一级结

18、构36蛋白质结构的组织层次蛋白质结构的组织层次37晶体学方法确定抹香鲸肌红蛋白结构的步骤38Biochemistry 生物化学生物化学To be lectured by : Dr. 杨海灵公共邮箱：公共邮箱：biochemistry_biochemistry_通用密码：通用密码：200808082008080839第三节第三节 蛋白质的三维结构蛋白质的三维结构稳定蛋白质三维结构的作用力稳定蛋白质三维结构的作用力二级结构：多肽链折叠的规则方式二级结构：多肽链折叠的规则方式超二级结构和结构域超二级结构和结构域球状蛋白质与三级结构球状蛋白质与三级结构亚基缔合和四级结构亚基缔合和四级结构40n稳定蛋白

19、质三维结构的作用力主要是一些非共价键或次级键，包括氢键、范德华力、疏水作用和盐键(离子键)。n此外二硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起着重要作用 3.1 3.1 稳定蛋白质三维结构的作用力稳定蛋白质三维结构的作用力41n氢键氢键侧链间侧链间n范德华力（范德华力（形成分子间作形成分子间作用力，受彼此距离影响用力，受彼此距离影响）n疏水键疏水键-“非极性基团被极性水分子排挤相互聚拢”作用力。离子键离子键（或盐键）或盐键）n 键 能n肽键肽键 n二硫键二硫键n离子键 n氢键氢键n疏水键疏水键 n范德华力范德华力 90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal

20、/mol这四种键能远小于共价键，称这四种键能远小于共价键，称次级键次级键提问：次级键微弱但却是提问：次级键微弱但却是维持蛋白质三级结构中主维持蛋白质三级结构中主要的作用力要的作用力,原因何在原因何在?43n一般认为，驱动蛋白质折叠的主要动力是一般认为，驱动蛋白质折叠的主要动力是熵效熵效应；应；折叠的结果是疏水基团埋藏在分子内部，折叠的结果是疏水基团埋藏在分子内部，亲水性基团暴露在分子表面。亲水性基团暴露在分子表面。n处于分子内部的主链极性基团必须被氢键中和处于分子内部的主链极性基团必须被氢键中和. .蛋白质主链的折叠产生由氢键维系的有规则的蛋白质主链的折叠产生由氢键维系的有规则的构象，成为二级

21、结构。构象，成为二级结构。n主要有主要有 - -螺旋螺旋、 - -折叠折叠、 - -转角转角和和无规则卷曲无规则卷曲。3.2 3.2 二级结构：多肽链折叠的规则方式二级结构：多肽链折叠的规则方式44n - -螺旋是蛋白质中最常见、最典型、含量螺旋是蛋白质中最常见、最典型、含量最丰富的二级结构元件。最丰富的二级结构元件。n在在 - -螺旋中肽平面的键长和键角一定；螺旋中肽平面的键长和键角一定； （ 3737 、 4747 ）1 1、 - -螺旋螺旋 -helix-helix45n多肽链中的各个肽平面围绕同多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上

22、升的距离即螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为距为0.54nm0.54nm, ,含含3.63.6个氨基个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距酸残基；两个氨基酸之间的距离为离为0.15nm0.15nm; ;n肽链内形成氢键，氢键的取向肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的残基的酰胺基团的-CO-CO基与基与第第四个四个氨基酸残基酰胺基团氨基酸残基酰胺基团的的- -NHNH基形成氢键。基形成氢键。n由氢键闭合的环是由氢键闭合的环是1313元环元环，因此也称为因此也称为3.63.61313。3n+446-螺旋中间隔三个氨基酸的残基的R基团的相互作用47多

23、肽链的偶极矩48o蛋白质分子通常为右蛋白质分子通常为右手手 -螺旋。螺旋。o右手的比左手的稳定。右手的比左手的稳定。o胶原蛋白左手螺旋胶原蛋白左手螺旋492 2、 - -折叠折叠n - -折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列（每条肽链称为链平行排列（每条肽链称为B-B-折叠股），通折叠股），通过股间的氢键交联而形成的。过股间的氢键交联而形成的。n肽链的主链呈锯齿状折叠构象肽链的主链呈锯齿状折叠构象 50（ 140140 、 + 133+ 133 ） 重复周期重复周期0.7nm0.7nm（ 119119 、 + 113+ 113 ） 重复周期重复周期0.

24、63nm0.63nm51n在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，并交替的从平面上下二侧伸出。n在-折叠片中每条肽链称为-折叠股，氢键主要在股间而不是股内形成。n-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边，。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。n在纤维状蛋白质中，B-折叠片主要是反平行式的；而在球状蛋白质中几乎同样广泛的存在。523 3、 - -转角转角 -turn-turnn在在 - -转角部分，由四个氨转角部分，由四个氨基酸残基组成基酸残基组成; ;n弯曲处的第一个氨基酸残弯曲处的第一个氨基酸残基的基的 -C=O -C=

25、O 和第四个残基和第四个残基的的 N-H N-H 之间之间形成氢形成氢键键，形成一个不很稳定，形成一个不很稳定的环状结构。的环状结构。n这类结构主要存在于球状这类结构主要存在于球状蛋白分子的表面。蛋白分子的表面。n - -转角处的氨基酸多为转角处的氨基酸多为脯氨酸和甘氨酸。脯氨酸和甘氨酸。 534、无规卷曲、无规卷曲(random coil) n泛指那些不能被归入明确的二级结构如折叠片或螺旋的多肽区段。n实际上这些区段大多数既不是卷曲，也不是完全无规的，虽然也存在少数柔性的无序区段，但这些“无规卷曲”也像其他二级结构那样是明确而稳定的结构。n这类有序的非重复性结构经常构成酶活性部位和其他蛋白质

26、特异的功能部位。543.3.1 超二级结构超二级结构 (supersecondary struture) n在蛋白质分子中特别是在球状蛋白质分子中经常可以看到由若干相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多的、有规则的二级结构组合，在多种蛋白质中充当三级结构的构件，称为超二级结构。n现在已知的超二级结构有3种基本的组合形式：、。 551. n 这是一种螺旋束，它经常是由两股平行或反平行排列的右手螺旋段互相缠绕而形成的左手卷曲螺旋或称超螺旋 螺旋束中还发现有三股和四股螺旋。卷曲螺旋是纤维状蛋白质如角蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白的主要结构元件。56卷曲螺旋是纤维状蛋白质如角蛋白肌球蛋白

27、和原肌球蛋白的主要结构元件,也存在于球状蛋白质中。 细胞色素细胞色素C的的结构结构57头发的结构：头发角蛋白是一种伸长的螺旋。头发的结构：头发角蛋白是一种伸长的螺旋。58烫发是一项生物化学工程烫发是一项生物化学工程59胶原的结构：三肽重复序列胶原的结构：三肽重复序列 GLY-X-PRO602. n它是由两段平行折叠股和一段作为连接链的螺旋组成，股之间还有氢键相连。nRossman折叠 。 折叠片的疏水侧链面向螺旋的疏水面，彼此紧密装配(图329B)。作为连接链的除螺旋外还可以是无规卷曲。 613. n反平行折叠片，在球状蛋白质中多是由一条多肽链的若干段折叠股反平行组合而成，两个股间通过一个转角

28、连接起来 624.曲折(meander) n是一种常见的超二级结构，由氨基酸序列上连续的多个反平行折叠股通过紧凑的转角连接而成63643.3.2 结构域 (structural domain) 1. 结构域概念 多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体，称为结构域。6566 2.结构域的特点（1）结构域是球状蛋白质的独立折叠单位。对一些较小的球状蛋白质分子或亚基来说，结构域和三级结构是一个意思。例如红氧还蛋白，核糖核酸酶、肌红蛋白等。67（2）对于较大的球状蛋白质或亚基，其三级结构往往由两个或多个结构域缔合而成也即它们是多结构域的，例如免疫球蛋白

29、的轻链含2个结构域。68n结构域有时也指功能域。功能域可以是一个结构域，也可以是由两个结构域或两个以上结构域组成。n从功能角度看许多多结构域的酶，其活性中心都位于结构域之间，因为通过结构域容易构建具有特定三维排布的活性中心。n结构域之间常常只有一段柔性的肽链连接，形成所谓铰链区，使结构域容易发生相对运动，这是结构域的一大特点。结构域之间的这种柔性将有利于活性中心结合底物和施加应力。 3 结构域与功能域的关系69免疫球蛋白的结构704. 结构域的类型结构域的类型 结构域基本类型数目有限。根据其所含的二级结构种类和组合方式，结构域大体可分为4类：1.反平行螺旋结构域(全结构)、2.平行或混合型折叠

30、片结构域(，结构)、3.反平行折叠片结构域(全结构)4.富含金属或二硫键结构域(不规则小蛋白结构) 71n蛋白质结构的复杂性和功能的多样性也主要体现在球状蛋白质。n一个蛋白质的三级结构是指由二级结构元件构建成的总三维结构，包括一级结构中相距远的肽段之间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间的相互关系。 3.4 3.4 球状蛋白质与三级结构球状蛋白质与三级结构722. 2. 球状蛋白质三维结构具有明显的折叠层次球状蛋白质三维结构具有明显的折叠层次n肽链主链在熵驱动下折叠成借氢键维系的螺旋折叠片等二级结构二级结构。n在一级序列上相邻的二级结构往往在三维折叠中彼此靠近并相互作用形成超二级结构超二级结

31、构。n由超二级结构进一步装配成相对独立的球状实体结构域或三级结构结构域或三级结构(对于单结构域蛋白质或亚基)， 或再由两个或多个结构域(对于多结构域蛋白质或亚基)装配成紧密的球状或椭球状的三级结构。n如果这是亚基的三级结构，将由三级结构的亚基缔合成四级结构四级结构的多聚体如血红蛋白。 1. 1. 球状蛋白质分子含多种二级结构元件球状蛋白质分子含多种二级结构元件 一、球状蛋白质三维结构的特征一、球状蛋白质三维结构的特征 733. 3. 球状蛋白质分子是紧密的球状或椭球状实体球状蛋白质分子是紧密的球状或椭球状实体 4. 4. 球状蛋白质疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧球状蛋白质疏水侧链埋藏在分子内部

32、，亲水侧 链暴露在分子表面。链暴露在分子表面。 疏水作用力是维持三级结构的主要动力。3. 3. 球状蛋白质分子的表面有一个空穴球状蛋白质分子的表面有一个空穴( (也称裂沟、也称裂沟、 凹槽或口袋凹槽或口袋) ) 这种空穴常是结合底物、效应物等配体并行使生物功能的活性部位。 7475767778一、有关四级结构的一些概念一、有关四级结构的一些概念 1. 四级结构：自然界中很多蛋白质是以独立折叠的球状蛋白质的聚集体形式存在的。这些球状蛋白通过非共价键彼此缔合在一起。缔合形成聚集体的方式构成蛋白质的四级结构。3.5 3.5 亚基缔合和四级结构亚基缔合和四级结构792. 2. 亚基：亚基：四级结构的蛋

33、白质中每个球状蛋白质称为亚基，亚基一般是一条多肽链。亚基有时也称单体，3. 3. 寡聚蛋白质：寡聚蛋白质：由两个或两个以上亚基组成的蛋白质统称为寡聚蛋白质。寡聚蛋白质包括许多很重要的酶和转运蛋白。（1）同多聚蛋白质：）同多聚蛋白质：由单一类型的亚基组成（2）杂多聚蛋白质）杂多聚蛋白质：由几种不同类型亚基组成4. 4. 单体蛋白质：单体蛋白质：仅由一个亚基组成并此无四级结构的蛋白质称为单体蛋白质。80二、四级缔合的驱动力二、四级缔合的驱动力 n稳定四级结构的作用力与稳定三级结构的没有本质区别。n相互作用力包括范德华力、氢键、离子键和疏水作用。主要为疏水作用。n对某些蛋白质对亚基缔合的稳定性作出贡

34、献的还有一个重要因素是亚基之间二硫桥的形成。例如所有的抗体都是由两条重链和两条轻链组成的四聚体。 81四、四级缔合在结构和功能上的优越性四、四级缔合在结构和功能上的优越性 1. 1. 增强结构稳定性增强结构稳定性 亚基缔合的一个优点是蛋白质的表面积与体积之比降低。结果是增强蛋白质结构的稳定性。亚基缔合还可以屏蔽亚基表面上的疏水残基以避开溶剂水。 822. 2. 提高遗传经济性和效率提高遗传经济性和效率编码一个将装配成同多聚蛋白质的单体所需的DNA比编码一条相对分子质量相同的多肽链要少。3. 3. 使催化基团汇集在一起使催化基团汇集在一起寡聚体的形成可使不同单体亚基的催化基团汇集在一起以形成完整

35、的催化部位。834. 4. 使寡聚蛋白具有别构效应和协同性使寡聚蛋白具有别构效应和协同性 多亚基蛋白质一般具有多个结合部位，结合在蛋白质分子的特定部位上的配体对该分子的其他部位所产生的影响(如改变亲和力或催化能力)称为别构效应别构效应(allosteric effect) 。 具有别构效应的蛋白质称为别构蛋白质别构蛋白质( allosteric protein ) ，除活性部位外还有别的配体(如效应物或调节物)的结合部位，称别别构部位构部位(allosteric site ) 或调节部位。 84 1）血红蛋白的别构效应。 2）血红蛋白分子病。 蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的蛋白

36、质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。构，高级结构和其功能密切相关。 第四节第四节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系85同源蛋白质：homologous protein不同物种中具有相同或相似功能的蛋白质或具有明显序列同源性的蛋白质。 人细胞色素C氨基酸序列：黄色表示不变氨基酸；蓝色表示保守氨基酸；86建立在各种细胞色素C的氨基酸差异基础上的真核生物进

37、化树的主要分支。87错误折叠引起的死亡：错误折叠引起的死亡：朊病毒疾病朊病毒疾病884.1 血红蛋白的别构效应一肌红蛋白的结构与功能二血红蛋白的结构三氧合引起的血红蛋白的构象变化四血红蛋白的协同性氧结合五血红蛋白的别构效应物一：肌红蛋白的结构与功能90一：肌红蛋白的结构与功能肌红蛋白结构特点肌红蛋白结构特点1.呈紧密球形2.有8段-螺旋区3.有18个螺旋间区4.内部存在一口袋形空穴，血红素居于此空穴中91肌红蛋白中血红素辅基的结构肌红蛋白中血红素辅基的结构 9293肌红蛋白的功能：肌红蛋白的功能：肌肉细胞储存和分配氧的蛋白质，在组织中接纳释放自血红蛋白的氧，分配给细胞中耗氧的细胞器（线粒体）。

38、94With aWith a 2 2 2 2 structure structure二：血红蛋白的结构95 Fe Fe1.血红素与氧结合氧合时铁原子变小而进入卟啉环血红素与氧结合氧合时铁原子变小而进入卟啉环三：氧合引起的血红蛋白的构象变化962. 构象重调导致链间盐键断裂97 氧合作用显著改变氧合作用显著改变Hb的四级结构，血红素铁的的四级结构，血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换（从微小移动导致血红蛋白构象的转换（从T态态R态）态）T态（态（tense state）紧张态）紧张态 R态（态（relaxed state）松驰态。）松驰态。3.从从T态态R态态98Deoxy-HbDeoxy-

39、HbOxy-Oxy-HbHbConformational changes observed from Conformational changes observed from the T to R transition: Tertiary structures the T to R transition: Tertiary structures changed little, only the two pairs of changed little, only the two pairs of dimersdimersslide past each and rotate.slide past

40、each and rotate.99A possible way for triggering the conformational A possible way for triggering the conformational changes by Ochanges by O2 2 binding in binding in HbHb: shifting of the : shifting of the position of the Helix F (1970, by position of the Helix F (1970, by PerutzPerutz). ).Helix FHe

41、lix FHelix FHelix FSlightly puckeredporphyrin ringFe2+More planarporphyrin ringO2牵引牵引Fe2接近卟啉平面，这一微小的移动具有很深接近卟啉平面，这一微小的移动具有很深的生物学后果。的生物学后果。当当Fe原子移动时，它同时拖动原子移动时，它同时拖动HisF8残基，并进而引起残基，并进而引起螺旋螺旋F和拐弯和拐弯EF和和FG的位移。的位移。上述位移传递到亚基界面引发构象重调，导致维系去氧上述位移传递到亚基界面引发构象重调，导致维系去氧血红蛋白四级结构的链间盐键断裂以及血红蛋白四级结构的链间盐键断裂以及亚基之间的亚基之

42、间的空隙变窄，并挤出空隙变窄，并挤出BPG分子等变化。分子等变化。血红蛋白有两种主要构象血红蛋白有两种主要构象T态与态与R态。态。O2与一个处于与一个处于T态态的血红蛋白亚基结合将引发构象由的血红蛋白亚基结合将引发构象由T态转化为态转化为R态。态。R态态血红蛋白对血红蛋白对O2的亲和力明显高于的亲和力明显高于T态，并且氧的结合更态，并且氧的结合更稳定了稳定了R态。态。血红蛋白的氧合具有正协同同促效应，也即一个血红蛋白的氧合具有正协同同促效应，也即一个O2的结的结合增加同一合增加同一Hb分子中其余氧合部位对分子中其余氧合部位对O2的亲和力。的亲和力。O O2 2引发血红蛋白别构效应的结构基础引发

43、血红蛋白别构效应的结构基础101 别构效应是指含亚基的蛋白质分子由于一个亚基构象的改变而引起其余亚基以至整个分子构象、性质和功能发生变化。 对于血红蛋白而言： 由于能够在较窄的氧分压范围完成输氧功能，保障机体内的氧水平大致恒定。 四：血红蛋白的协同性氧结合102MbMb和和HbHb的氧解离曲线：蛋白构象与氧合关系的氧解离曲线：蛋白构象与氧合关系n Mb：矩形双曲线，表示易于：矩形双曲线，表示易于氧结合；氧结合；n Hb：S型曲线，表示在低氧分型曲线，表示在低氧分压时结合较难，亚基与压时结合较难，亚基与O2结合结合呈现呈现正协同效应正协同效应（positive cooperativity），表明

44、），表明Hb的四个的四个亚基与亚基与O2结合的亲和力不同，结合的亲和力不同，第一个结合较难，但一旦结合后，第一个结合较难，但一旦结合后，促进第二、第三亚基与促进第二、第三亚基与O2结合，结合，而后者又大大促进第四个亚基与而后者又大大促进第四个亚基与O2结合。结合。n氧分子（配体）与氧分子（配体）与Hb亚基结合亚基结合后引起亚基构象变化，称为变构后引起亚基构象变化，称为变构效应（效应（allosteric effect） 1031.1.波耳（波耳（BohrBohr）效应）效应 H+和和CO2促进促进HbO2释放释放O2 五：血红蛋白的别构效应物波耳效应具有重要的生理意义1042.BPG2.BPG

45、降低降低HbHb对氧气的亲和力；有重要的生理意义对氧气的亲和力；有重要的生理意义Or 2, 3 - Bisphosphoglycerate (BPG)105本节小结本节小结氧的S形曲线结合，Bohr效应以及BPG效应物的调节使得血红蛋白的输氧能力达到最高的效率。由于能够在较窄的氧分压范围完成输氧功能，保障机体内的氧水平大致恒定。血红蛋白也使机体内的pH维持在较为稳定的水平。 血红蛋白的别构效应充分反应了它的生物学适应性，结构与功能的高度统一性。 发展出血红蛋白这一输氧分子与完善的循环系统是生物进化到脊椎动物的决定性原因。106 1）血红蛋白的别构效应。 2）血红蛋白分子病。 蛋白质复杂的组成和

46、结构是其多种多样生物学功能的蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。构，高级结构和其功能密切相关。 第四节第四节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系107一镰刀形细胞贫血病。二血红蛋白的分子病理学。三地中海贫血病。四发现突变种血红蛋白所造成的影响4.2 血红蛋白的分子病4.2.1 镰刀形细胞贫血病导论：导论：19041904年第一例镰刀形细胞贫血病的发

47、现年第一例镰刀形细胞贫血病的发现1904年年James Herrick& 一个一个20岁黑人大学生岁黑人大学生红细胞的性状很不规则，但特别引人注意的红细胞的性状很不规则，但特别引人注意的是大量细长、镰刀形和月牙形的红细胞。是大量细长、镰刀形和月牙形的红细胞。一个严重贫血病例中所见细长核镰刀形一个严重贫血病例中所见细长核镰刀形的奇异红血球的奇异红血球镰刀形细胞贫血病患者镰刀形细胞贫血病患者: : 纯合子纯合子位于常染色体上的两个拷贝都是不正常的基因位于常染色体上的两个拷贝都是不正常的基因。19281928年发现镰刀形贫血病是常染色体隐性遗传疾病年发现镰刀形贫血病是常染色体隐性遗传疾病19

48、281928年发现镰刀形贫血病是常染色体隐性遗传疾病年发现镰刀形贫血病是常染色体隐性遗传疾病具有镰刀形细胞特性的人：杂合子具有镰刀形细胞特性的人：杂合子只有一个拷贝是不正常，通常并无病征。只有一个拷贝是不正常，通常并无病征。 预言预言“红血球本身的组成中某些尚未认红血球本身的组成中某些尚未认识的变化可能是决定性因素识的变化可能是决定性因素” 。James B. Herrick 正常成年人的血红蛋白：正常成年人的血红蛋白：HbA 镰刀形细胞贫血病患者的血红蛋白：镰刀形细胞贫血病患者的血红蛋白：HbS 1、normal正常人正常人; 2、Trait具有镰刀形细胞特性的人具有镰刀形细胞特性的人(镰刀

49、形基因的杂合子镰刀形基因的杂合子);3、Patient镰刀形细胞贫血病患者。镰刀形细胞贫血病患者。1949年鲍林的研究：年鲍林的研究：淀粉电泳分析突变种血红蛋白淀粉电泳分析突变种血红蛋白 1、normal正常人正常人; 2、Trait具有镰刀形细胞特性的人具有镰刀形细胞特性的人(镰刀形基因的杂合子镰刀形基因的杂合子);3、Patient镰刀形细胞贫血病患者。镰刀形细胞贫血病患者。 正常人有且仅有正常人有且仅有HbAHbA 患者有且仅有患者有且仅有HbSHbS 杂合子兼有两种血红蛋白，杂合子兼有两种血红蛋白，且含量大致相等。且含量大致相等。1949年鲍林的研究：年鲍林的研究：淀粉电泳分析突变淀粉

50、电泳分析突变体体血红蛋白血红蛋白 1949年鲍林的研究：年鲍林的研究：淀粉电泳分析突变淀粉电泳分析突变体体血红蛋白血红蛋白 HbSHbS在一级结构上发生了氨基酸的在一级结构上发生了氨基酸的替换。替换。导致这两种血红蛋白可电离基团的导致这两种血红蛋白可电离基团的数目或者种类有差异。数目或者种类有差异。使得使得HbSHbS比起比起HbAHbA少了少了2 2到到4 4个负电荷个负电荷1954年年Vernon Ingram 进行了指纹图谱分析。进行了指纹图谱分析。 胰蛋白胰蛋白酶消化酶消化分离分离HbS与与HbA的的亚基和亚基和亚基：离子交换色谱法。亚基：离子交换色谱法。第一向：电泳第二向：纸色谱法肽

51、段进行肽段进行双向层析双向层析1954年年Vernon Ingram 进行了指纹图谱分析。进行了指纹图谱分析。 胰蛋白胰蛋白酶消化酶消化分离分离HbS与与HbA的的亚基和亚基和亚基：离子交换色谱法。亚基：离子交换色谱法。第一向：电泳第二向：纸色谱法肽段进行肽段进行双向层析双向层析 Ingram V等人HbA与HbS这两种血红蛋白都用胰蛋白酶在同样条件下水解成若干肽段（28个），进行双向滤纸层析电泳，然后对比所得的图谱称为指纹图谱指纹图谱。HbAHbS血红蛋白血红蛋白S S的变化在于它的的变化在于它的链链 ；HbAHbS血红蛋白血红蛋白S S的变化在于它的的变化在于它的链链 ；HbAHbS血红蛋

52、白血红蛋白S S的变化在于它的的变化在于它的链链 ；从一级结构来看，只是从一级结构来看，只是6Glu6Glu被替换成被替换成6Val6Val。遗传信息的传递遗传信息的传递中心法则中心法则DNAmRNA蛋白质蛋白质mRNA核糖体核糖体蛋白质蛋白质 subunit of Hb A subunit of Hb S subunit of Hb A subunit of Hb S单氨基酸突变来源于单核甘酸突变（单氨基酸突变来源于单核甘酸突变（CTTCAT)蛋白质结构与功能的关系：蛋白质结构与功能的关系： 肽链必须折叠以便埋藏疏水侧链，使之与溶剂水的接触降到最小程度。球状蛋白质分子约8090的疏水侧链被埋

53、藏，分子表面主要是亲水侧链，因此球状蛋白质是可溶的。从单氨基酸突变到镰刀形细胞贫血病从单氨基酸突变到镰刀形细胞贫血病 缬氨酸缬氨酸 （Val）血红蛋白血红蛋白S S的溶解度降低了的溶解度降低了谷氨酸谷氨酸 （Glu）镰刀形血红蛋白在它的表面有粘斑镰刀形血红蛋白在它的表面有粘斑互补口袋可能由互补口袋可能由EFEF拐弯附近的拐弯附近的Phe85Phe85和和Leu88Leu88形成。形成。 氧合氧合HbS脱氧脱氧HbS氧合氧合HbS脱氧脱氧HbS脱氧脱氧HbS聚集形成沉淀聚集形成沉淀 在氧合血红蛋白中互补部位已被在氧合血红蛋白中互补部位已被覆盖，虽然仍有粘斑，但它不能覆盖，虽然仍有粘斑，但它不能够

54、与另外一个血红蛋白够与另外一个血红蛋白S S结合。结合。 脱氧血红蛋白脱氧血红蛋白S S既有黏性凸起又既有黏性凸起又有互补口袋，聚集在一起有互补口袋，聚集在一起形成细形成细长的螺旋纤维。长的螺旋纤维。 镰刀形化发生于血红蛋白镰刀形化发生于血红蛋白S S的脱的脱氧形式达到较高浓度之时氧形式达到较高浓度之时 。镰刀形血红蛋白在它的表面有粘斑镰刀形血红蛋白在它的表面有粘斑 电镜观察的沉淀由直径电镜观察的沉淀由直径21.5nm21.5nm的纤维组成，每根纤维是一个的纤维组成，每根纤维是一个1414股股HbSHbS链形成的超螺旋。链形成的超螺旋。纤维沉淀的形成压迫细胞质膜，使它弯曲成镰刀状。纤维沉淀的形

55、成压迫细胞质膜，使它弯曲成镰刀状。镰刀形细胞不象正常红细胞那样平滑而有弹性，不易镰刀形细胞不象正常红细胞那样平滑而有弹性，不易通过毛细血管。通过毛细血管。毛细血管被长且形状不正常的细胞所阻塞，将引起强毛细血管被长且形状不正常的细胞所阻塞，将引起强烈的疼痛并干扰正常器官的功能。烈的疼痛并干扰正常器官的功能。 镰刀形红细胞贫血病是一种分子病。镰刀形红细胞贫血病是一种分子病。1、编码血红蛋白的基因发生突变（、编码血红蛋白的基因发生突变（CTT CAT)，引起，引起 链第链第6位的氨基酸残基由正常的位的氨基酸残基由正常的Glu变成了疏水性的变成了疏水性的Val。2、突变体血红蛋白、突变体血红蛋白S在脱

56、氧状态下溶解度降低，形成纤维状沉在脱氧状态下溶解度降低，形成纤维状沉淀使得红细胞变形成为镰刀形。淀使得红细胞变形成为镰刀形。3、毛细血管被长且形状不正常的细胞所阻塞，将引起强烈的疼、毛细血管被长且形状不正常的细胞所阻塞，将引起强烈的疼痛并干扰正常器官的功能。导致镰刀形细胞贫血病。痛并干扰正常器官的功能。导致镰刀形细胞贫血病。4.2.2 血红蛋白的分子病理学大多数不正常的血红蛋白并不使人得到选择优势，它们几乎总是中性或者无害的。血红蛋白突变绘影响血红蛋白分子中下述4个关键区域之一的都可能造成严重的后果。突变发生在血红蛋白分子的表面突变发生在血红蛋白分子的表面突变发生在血红素基的附近。突变发生在血

57、红素基的附近。突变发生在特异部位影响了血红蛋白三维结构正确的折叠。突变发生在特异部位影响了血红蛋白三维结构正确的折叠。突变发生在亚基界面上突变发生在亚基界面上4.2.3 地中海贫血病地中海贫血（简称地贫）是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病，人群发生率高达 10%以上，以广东、广西为主。本组疾病的临床症状轻重不一，大多表现为慢性进行性溶血性贫血。地中海贫血地中海贫血 地中海贫血地中海贫血 4.2.4 发现突变种血红蛋白所造成的影响 它们是对正常血红蛋白的结构和功能之间产生透辟见解的源泉；突变种血红蛋白的发现，揭示出在一种多肽链上一个单一的氨基酸的改变足以产生疾病；突变种血红蛋白的发现已增进我

58、们对进化过程的了解。 132Biochemistry 生物化学生物化学To be lectured by : Dr. 杨海灵公共邮箱：公共邮箱：biochemistry_biochemistry_通用密码：通用密码：2008080820080808133第五节第五节 蛋白质的分离、纯化与表征蛋白质的分离、纯化与表征5.1 蛋白质的理化性质5.2 分离纯化的一般步骤5.3 纯度鉴定5.4 蛋白质含量的测定1341.蛋白质的两性电离 5.1 5.1 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质 蛋白质分子在一定的溶液pH条件下都可解离成带负 电荷或正电荷的基团。 蛋白质的等电点( ( isoelectrici

59、soelectric point, point, pIpI) ) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。1352.蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至万至100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。为胶粒范围之内。 蛋白质胶体稳定的因素1. 颗粒表面电荷颗粒表面电荷2. 水化膜水化膜136+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋

60、白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉137138临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。灭菌。此外此外, , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。制剂（如疫苗等）的必要条件。 应用举例应用举例139 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性14