无菌室无菌操作及风险评估

1、无菌试验及无菌操作对灭活前样品无菌试验不合格的分析目录灭活前样品无菌试验不合格的分析灭活前样品无菌试验不合格的分析（一）无菌试验无菌试验：是无菌的制剂、原料、无菌试验：是无菌的制剂、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种辅料及其他品种是否无菌的一种检查方法，同时指出检查方法，同时指出“若供试品若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现了供试品在该检验条件下未发现微生物的污染微生物的污染”。（一）无菌试验培养基的制备及培养条件 培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存

2、在 2 25 、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。硫乙醇酸盐流体培养基常用培养基营养琼脂培养基（一）无菌试验改良马丁培养基硫乙醇酸盐流体培养基v酪胨 (胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0gv葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gvL-胱氨酸 0.5g 新配制的 0.1% 刃天青溶液 1.0 mlv硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.75gv(或硫乙醇酸) （ 0.3 ml) 水 1000 ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节 pH 值使灭菌后为 7.1

3、 0.2 。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的 1/2 。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的 1/5 ，否则，须经 100 水浴加热至粉红色消失（不超过 20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。硫乙醇酸盐流体培养基置 30 35 培养。返回改良马丁培养基v2.改良马丁培养基v胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0gv酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁 0.5gv葡萄糖 20.0g 水 1000 ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 值约为 6.8 ，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节

4、 pH 值使灭菌后为 6.4 0.2 ，分装，灭菌。改良马丁培养基置 23 28 培养。返回返回营养琼脂培养基v胨 10.0g 氯化钠 5.0gv牛肉浸出粉 3.0g 水 1000 ml取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入 14.0g 琼脂，调节 pH 值使灭菌后为 7.2 0.2 ，分装，灭菌。返回返回 （二）无菌操作概念人员操作物品无菌操作原则无菌操作原则环境概念明确基本概念明确基本概念 进行无菌操作时，应首先明确无菌区、非无菌区、进行无菌操作时，应首先明确无菌区、非无菌区、无菌物品的概念。无菌物品的概念。v无菌区：指经灭菌处理且未被污染的区域。无菌区：指经灭菌

5、处理且未被污染的区域。v非无菌区：指未经灭菌处理，或虽灭菌处理但又非无菌区：指未经灭菌处理，或虽灭菌处理但又被污染的区域。被污染的区域。v无菌物品：指通过物理或化学的方法灭菌后保持无菌物品：指通过物理或化学的方法灭菌后保持无菌状态的物品。无菌状态的物品。 环境操作环境清洁、宽敞操作环境清洁、宽敞操作环境应清洁、宽敞、定期消毒；操作环境应清洁、宽敞、定期消毒；操作台清洁、干燥、平坦、物品布局合理；操作台清洁、干燥、平坦、物品布局合理；无菌操作前半小时应减少走动、避免尘埃飞扬。无菌操作前半小时应减少走动、避免尘埃飞扬。人员工作人员仪表符合规范工作人员仪表符合规范 无菌操作前，工作人员应戴好帽子和口

6、罩，修剪无菌操作前，工作人员应戴好帽子和口罩，修剪指甲并洗手，穿好无菌衣、戴无菌手套。指甲并洗手，穿好无菌衣、戴无菌手套。人员物品物品放置有序，标志明显物品放置有序，标志明显无菌物品必须与非无菌物品分开放置，并且有明无菌物品必须与非无菌物品分开放置，并且有明显标志。显标志。无菌物品不可暴露于空气中，应存放于无菌包或无菌物品不可暴露于空气中，应存放于无菌包或无菌容器内。无菌容器内。无菌包外需标明物品名称、灭菌日期，并按失效无菌包外需标明物品名称、灭菌日期，并按失效期先后顺序摆放。期先后顺序摆放。 操作无菌操作无菌操作v进行无菌操作时，操作者身体应于无菌区保持进行无菌操作时，操作者身体应于无菌区保

7、持一定距离。一定距离。v取放无菌物品时，应面向无菌区。取放无菌物品时，应面向无菌区。v取用无菌物品时应使用无菌持物钳。取用无菌物品时应使用无菌持物钳。v手臂应保持在腰部以上，手不可直接接触无菌手臂应保持在腰部以上，手不可直接接触无菌物品。物品。 操作v非无菌物品应远离无菌区；无菌物品一经取出，非无菌物品应远离无菌区；无菌物品一经取出，即使未用，也不可放回无菌容器内。即使未用，也不可放回无菌容器内。v避免面对无菌区谈笑、咳嗽、打喷嚏。避免面对无菌区谈笑、咳嗽、打喷嚏。v如无菌物品疑有污染或已被污染，应予更换并如无菌物品疑有污染或已被污染，应予更换并重新灭菌。重新灭菌。（三）灭活前样品无菌试验不合

8、格的分析取样物品前准备取样环节除菌过程操作前准备a）在对灭活罐进行整体）在对灭活罐进行整体CIP前，零部件是否拆卸前，零部件是否拆卸并进行冲洗。（如温度探头、取样阀）并进行冲洗。（如温度探头、取样阀）b）灭活罐）灭活罐SIP的过程是否按照的过程是否按照SOP执行，灭菌时执行，灭菌时间是否满足间是否满足SOP的规定。的规定。C）除菌管道是否按照）除菌管道是否按照SOP进行灭菌，灭菌结束应进行灭菌，灭菌结束应立即与外界隔断，并保证管道内正压。立即与外界隔断，并保证管道内正压。d）除菌滤材是否按照）除菌滤材是否按照SOP进行检测、冲洗、灭菌，进行检测、冲洗、灭菌，灭菌结束后是否放置于无菌区域，并关闭

9、所有手动灭菌结束后是否放置于无菌区域，并关闭所有手动隔膜阀和气嘴，包口不是否完整无破损。隔膜阀和气嘴，包口不是否完整无破损。 e）除菌滤器连接过程是否按照）除菌滤器连接过程是否按照SOP进行操作，连进行操作，连接过程中，人员、环境是否达到无菌操作的要求。接过程中，人员、环境是否达到无菌操作的要求。取样物品a）取样瓶是否按照）取样瓶是否按照SOP要求进行清洁灭菌，瓶口要求进行清洁灭菌，瓶口有无破损现象，锡箔纸封口是否完好。有无破损现象，锡箔纸封口是否完好。b）塞子铝帽是否按照）塞子铝帽是否按照SOP要求进行清洁灭菌。要求进行清洁灭菌。c）持物钳是否完好可用并进行消毒。）持物钳是否完好可用并进行消

10、毒。d）取样物品灭菌后是否摆放在无菌区域。）取样物品灭菌后是否摆放在无菌区域。除菌过程操作a）除菌过程开始前房间环境的清洁消毒措施是否）除菌过程开始前房间环境的清洁消毒措施是否到位，能否满足洁净室等级要求。到位，能否满足洁净室等级要求。b）除菌过程人员是否按照）除菌过程人员是否按照SOP进行操作，人员进行操作，人员进行无菌操作时是否满足无菌操作的要求。进行无菌操作时是否满足无菌操作的要求。c）在层流罩下进行操作的人员是否按照）在层流罩下进行操作的人员是否按照SOP进进行局部消毒。行局部消毒。d）操作过程所使用的设备设施是否异常。）操作过程所使用的设备设施是否异常。e）操作人员是否定期进行局部消毒。）操作人员是否定期进行局部消毒。取样环节a）取样物品是否按照）取样物品是否按照SOP进行清洗灭菌，灭菌后进行清洗灭菌，灭菌后的物品是否按照规定存放于无菌区域。的物品是否按照规定存放于无菌区域。b）取样操作前，取样阀是否进行）取样操作前，取样阀是否进行SIP，并在使用，并在使用周期内；操作人员是否进局部消毒，局部的取样环周期内；操作人员是否进局