免疫学检验 整理

1、键入公司名称免疫学检验整理键入文档副标题Administrator选取日期免疫学检验第一章绪论免疫学检验（immunoassay）：免疫学检验是研究免疫学技术及其在医学、生命科学等领域中的一门应用学科： 免疫学技术的发展历史：1、 经验免疫学发展阶段 （1618世纪）接种人痘（中国）/牛痘（英国）预防天花2、经典免疫学发展阶段（19世纪后期） 凝集反应、沉淀反应、补体结合反应等免疫学方法被大量运用于临床 肥达反应：1896年Widal用伤寒患者血清与伤寒杆菌发生特异性凝集反应来诊断伤寒3、近现代免疫学发展阶段（20世纪初） - Landsteiner的血型研究，开拓了免疫化学领域Karl La

2、ndsteiner(1868-1943)发现ABO血型Burner的克隆选择学说（clone selection theory)预见了一个细胞克隆产生一种特异性抗体 - Kohler和Milstein于1975年创立单克隆抗体技术20世纪6070年代，诸多免疫标记技术被广泛应用：放射标记免疫、酶标记免疫、荧光标记免疫、金（银）标记免疫、免疫印迹 - 免疫学检测的水平从mg提高到pg，检测范围从病原微生物扩大到多种物质免疫学检验的特点：特异性强、灵敏度高、稳定、简便、快速免疫学检验 细胞免疫检验：免疫活性细胞及其功能的检测 体液免疫检验：抗原、抗体、补体等的检测免疫学检验的应用范围： 传染病：血

3、清学检测病原微生物及其代谢产物 免疫性疾病：青霉素注射前的皮试 肿瘤抗原、抗肿瘤抗体、肿瘤标志物 组织器官移植：肝脏移植前的HLA配型 血型和血液病：输血前的ABO及Rh配型 其他：样品中微量的酶、激素、蛋白质、药物等免疫学检验的基本原理A与B相互识别构象，产生应答 抗原 抗体细胞因子受体补体抗原抗体复合物通过某种方法检测到A与B的识别反应 直接观察：沉淀、凝集通过标记：荧光、放射线、吸光值免疫学检验的一般思路1、选择合适的检验方法 检验的灵敏度 检验的特异度 方法的可行性2、对检验结果进行评价 阳性结果说明什么？阴性结果说明什么？ 检验的重复性 是否设立对照？ 检验过程的质量控制很重要！目前

4、常用的免疫学检验技术l 凝集反应l 沉淀反应l 补体测定和补体结合试验l 荧光免疫技术l 酶免疫技术l 放射免疫技术l 化学发光免疫技术l 金（银）免疫技术l 免疫细胞检测各种免疫学检验技术的比较免疫系统 是脊椎动物和人类的防御系统。它与神经系统、内分泌系统、呼吸系统等一样，是机体的一个重要系统。 机体的“安全部门”免疫系统的组成:免疫器官 免疫系统的功能：免疫防御病原体的入侵 免疫细胞 免疫稳定对衰亡死亡损伤的细胞的清除 免疫分子 免疫监视对突变细胞的清除免疫细胞发生分化发育成熟的场所免疫器官：中枢免疫器官 骨髓“士兵工厂” TB细胞的发源地、B细胞成熟场所胸腺“训练场” T细胞成熟场所外周

5、免疫器官 脾血液过滤器免疫细胞定居、应答的场所 淋巴结小战场 黏膜相关淋巴组织参与局部免疫应答 扁桃 咽喉守卫者 肠相关淋巴组织 肠道守护者 阑尾 免疫助手经抗原刺激后产生免疫细胞 适应性免疫细胞 T细胞 TH TS TC或CTL接上与生具有，先天的固有免疫细胞 M0 DC NK细胞间信息交流免疫分子 免疫球蛋白 特异性结合抗原，激活补体，Fc段结合Fc受体的作用补体 溶解靶细胞，免疫调节抗细菌抗肿瘤调节免疫刺激造血 细胞因子 白介素IL 肿瘤坏死因子TNF 干扰素IFN 集落刺激因子CSF 趋化因子生长因子GF 膜分子免疫细胞间相互识别第二、三章 抗原-抗体反应及抗原抗体的制备免疫器官： 中

6、枢免疫器官：骨髓 胸腺 外周免疫器官：淋巴结 脾脏 粘膜免疫系统免疫细胞：T淋巴细胞 B淋巴细胞 NK细胞 抗原提呈细胞 粒细胞 红细胞 肥大细胞 免疫分子：可溶性分子：抗体 补体 细胞因子 膜分子：CD分子 黏附分子 主要组织相容性抗原第一节 抗原和抗体抗原 antigen，Ag刺激机体免疫系统，使之产生特异性免疫应答，并能与应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内或体外发生特异性反应的物质，也称免疫原。抗原的性能1、免疫原性 immunogenicity 抗原刺激机体免疫细胞产生特异性免疫应答的能力2、免疫反应性 immunoreactivity 抗原可与相应的抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发

7、生特异性结合的能力，也称抗原性抗原的种类完全抗原：既有免疫原性又有免疫反应性的物质，如各种微生物、大多数蛋白质不完全抗原：只有免疫反应性而没有免疫原性的物质，如多糖，简单小分子等，也称半抗原 hepten 耐受原：可诱导机体产生特异性无应答状态，形成免疫耐受的抗原，称耐受原 tolerogen 变应原：可刺激机体发生过强的免疫应答，发生超敏反应的抗原，称为变应原 allergen影响抗原免疫原性的因素抗原因素：1、抗原异质性 foreignness 异种物质、同种异体物质、自身物质2、抗原分子的理化性质分子量大小、化学组成与结构、分子构象与易接近性 conformation & accessi

8、bility应用 抗原与抗体之间的种属关系越远，组织结构差异越大，异质性越强宿主因素：1、宿主的遗传背景、年龄、性别、健康状况等2、抗原的剂量及进入机体的途径应用 - 选用遗传背景合适、健康年轻的动物个体作为宿主- 抗原剂量要适中，根据需要选择适当的免疫方法，一般皮内注射免疫原性最佳，口服免疫原性最差常见的抗原l 微生物及其代谢产物l 类毒素免疫动物后的动物免疫血清（含抗毒素）l 异嗜性抗原 不同种属间的共同抗原l 同种异型抗原 红细胞表面的血型抗原，MHC抗原l 其他抗原 肿瘤抗原、人工合成抗原。非特异性免疫刺激剂超抗原 superantigen ：某些物质可以非特异性地激活免疫细胞，产生强

9、烈的免疫应答，称为超抗原。如金葡菌肠毒素、金葡菌A蛋白（SPA）等。有丝分裂原 mitogen ：可非特异性地激活淋巴细胞进行分裂克隆的物质，称为有丝分裂原，简称丝裂原。如刀豆蛋白A、植物血凝素PHA、细菌脂多糖LPS、SPA等抗原特异性 是指物质之间的相互吻合性、针对性或专一性。l 抗原的特异性表现在两个方面:(1) 免疫原性的特异性(2)抗原性的特异性。l 特异性是免疫应答最重要的特点，也是免疫学诊断与防治的理论依据。l 决定抗原特异性的物质基础是抗原分子中的抗原决定簇(antigenic determinant),又称表位(epitope)抗原决定簇（抗原表位）: l 指抗原分子中决定抗

10、原特异性的特殊化学基团。是被免疫细胞TCR/BCR识别的靶结构，是抗原物质特异性的分子学基础。l 也是免疫反应具有特异性的物质基础。化学基团的化学组成为：l 一个多肽决定簇含515个氨基酸残基；l 一个多糖决定簇含57个多糖残基；l 一个核酸半抗原决定簇含68个核苷酸。抗原决定簇（表位）的类型(1)顺序决定簇(sequential determinant)-线性表位(linear epitope)(2)构像决定簇(conformationl determinant)-非线性表位( non-linear epitope)(3)T细胞决定簇 : T细胞决定簇位于抗原分子任何部，必须由APC将抗原加

11、工处理为小分子多肽并与MHC分子结合，然后才能被TCR所识别。识别的是线形表位(顺序决定簇)(4)B细胞决定簇:(半抗原决定簇)BCR能与未经APC加工的抗原发生反应，其识别的靶结构主要位于抗原分子表面的决定簇。线形表位和构像性表位T细胞B细胞抗原表位的特性比较抗原结合价:是指抗原分子表面能与抗体分子结合的抗原决定簇的总数，称为(antigenic valence)共同抗原与交叉反应 两种不同的抗原具有相同或相似的抗原决定簇，则称为共同抗原或交叉抗原。抗原（或抗体）除与其相应抗体（或抗原）发生特异性反应外，有时还可与其他抗体（或抗原）发生反应，称为交叉反应（cross-reaction）。交叉

12、反应是建立在两种不同的抗原具有相同或相似的抗原表位的基础上的，这种表位叫共同抗原表位（common epitope）l 抗体 antibody，Ab 免疫系统受抗原刺激后，B细胞转化为浆细胞，合成并分泌能与抗原特异性结合的球蛋白旧称：球蛋白/丙种球蛋白 l 免疫球蛋白 immunoglobulin，Ig 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。血清和细胞外液中含量最高、在免疫应答中起主要作用的是IgG。抗体是Ig，但Ig并不都是抗体！人体的5种抗体Ig也具有免疫原性l 同种型 isotype ： 同种属特异性的共有抗原表位结构l 同种异型 sllotype ：同种属不同个

13、体间的抗原表位结构l 独特型 idiotype： 同一个体内，不同B细胞产生的不同Ig分子应用：- 抗体的制备，单克隆抗体的制备一抗和二抗l 抗原接种于人或动物，机体产生的抗体，在试验中常称为第一抗体，简称一抗/Ab1l 利用免疫球蛋白Ig的同种型抗原特异性，将人Ig接种于动物，或动物Ig接种异种动物，可制备出抗抗体，又称第二抗体，简称二抗/Ab2应用：抗原-抗体反应 antigen-antibody reaction 抗原和相应抗体的特异性结合反应抗原-抗体反应可发生在体内（in vivo），也可发生在体外（in vitro）体内：吞噬、溶菌、中和。体外：凝集、沉淀、溶菌、溶血、中和。抗原-

14、抗体反应是免疫学检验最常用的检验原理！抗原-抗体反应的原理l 抗原-抗体间通过非共价键作用结合 静电引力、范德华力、氢键、疏水作用l 抗原-抗体间的亲和力affinity和亲合力avidity 亲和力：抗原表位抗体的抗原结合位点，是内在的 亲合力：抗原-抗体的结合强度，是整体的稳定性 亲合力与内在亲和力、抗体结合价、抗原和抗体的立体结构都有关系，是免疫化学技术的关键l 抗原-抗体结合后，电子云消失，亲水胶体转化为疏水胶体抗原抗体反应的特点 1、特异性 specificity 一种抗原只能与相应的抗体结合发生反应，这种特异性源自于抗原-抗体之间的结构互补性与亲和性1、互补性与亲和性应用：- 具有

15、相似抗原表位的物质，可与抗体构型部分吻合，产生交叉反应(cross reaction) 检验中使用的抗原或抗体制剂需要提纯、鉴定- 检测中让抗原抗体能充分接触，相互识别2、比例性 proportionality抗原与抗体发生可见反应需要一定的量比关系应用：检测时要注意抗原抗体的浓度比适中问题：怎么确定最适浓度？3、可逆性 reversibility抗原抗体结合成复合物，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体解离决定因素： - 抗体对相应抗原的亲和力 - 环境因素对抗原-抗体复合物的影响，如pH值和离子强度应用：- 检测时保证抗原-抗体反应处于合适的缓冲环境- 可通过改变pH值或离子强度来纯化抗原

16、、抗体 影响抗原-抗体反应的因素一、反应物自身因素1、抗原：理化特性、抗原表位的种类及数目等如 可溶性抗原抗体：沉淀 颗粒性抗原抗体：凝集2、抗体： - 来源：不同动物的免疫血清等价带不同，反应性能也有差异 - 浓度：最适比，试验中需进行抗体预滴定 - 特异性和亲和力：最重要的影响因素 免疫动物早期免疫血清特异性高但亲和力低，后期抗血清亲和力提高但特异性下降 二、反应环境条件1、电解质：- 0.85% NaCl溶液（0.15 mol/L）使抗原-抗体复合物形成可见沉淀或凝集- 高浓度电解质会造成非特异性蛋白质沉淀，即盐析2、酸碱度： - 抗原-抗体反应最适pH值为69，有补体参与时为pH7.2

17、7.4- pH3左右接近细菌抗原的等电点，会引起细菌的自身凝集，即非特异性酸凝集，造成假阳性3、温度一般为1540，最适374、其他因素 - 适当振荡可促进抗原、抗体接触，剧烈振荡会造成抗原-抗体复合物解离 - 其他蛋白质、多糖存在，会抑制抗原-抗体反应，或造成非特异性结合试验中须注意实验条件的选择和稳定，做好严格的对照，以保证试验结果的准确性！抗原和抗体的制备技术是免疫学检验的基础自学内容：抗原抗体的纯化方法离心分离法、盐析法、有机溶剂沉淀法、凝胶层析法、离子交换法、亲和层析法、电泳 了解各种方法的基本原理、优缺点、主要应用抗原的制备一、颗粒性抗原的制备1、细胞抗原2、细菌抗原不同种类细菌抗

18、原的制备l 菌体抗原（O抗原）：100水浴22.5 h杀菌并破坏鞭毛，加入苯酚至终浓度为5%l 鞭毛抗原： 选用有动力的菌株，菌液用0.3%0.5%的甲醛溶液处理l 毒素抗原（表面抗原，Vi、K抗原）： 沸水浴杀菌后，加入0.5%1%的CaCl2溶液l 菌液浓度的测定 Mc Farland标准比浊法：与1%硫酸溶液和1%氯化钡溶液比浊 稀释平板计数法：配置系列10倍稀释菌液，涂布平板或点10L样点 生长曲线估算：E. Coli 在LB培养液中，37 培养过夜达到生长静息期，浓度约为109 cfu/mL 二、可溶性抗原的制备l 制备可溶性抗原时需先破碎组织和细胞，然后再提取所需的目的成分，如蛋白

19、质、核酸等 组织破碎：l细胞破碎：细胞可来自于机械捣碎的组织，或培养的细胞用胰蛋白酶消化 超声破碎法：间隔进行，超声1 min，冰浴1 min，总时间为1015 min 冷热交替法：90 水浴数分钟，冰浴迅速冷却，反复进行，可提取病毒蛋白或核酸 反复冻融法：- 20 冻存，室温融化，反复进行 表面活性剂处理：SDS, 苯扎溴铵等l 蛋白质纯化：超速离心、盐析、凝胶层析、离子交换层析、亲和层析 Ig片段可通过酶裂解、氧化/还原断裂二硫键等方法制备l 核酸提取：酚/氯仿去除蛋白，乙醇/异丙醇沉淀l 脂多糖制备：苯酚处理菌液，对上层水相透析除酚、浓缩、超速离心 3、纯化抗原的鉴定l 抗原鉴定一般包括

20、理化性质、浓度、纯度、免疫活性等，需多种方法联用鉴定l 相对分子量：SDS-PAGEl 蛋白浓度：分光光度计测OD280l 免疫活性：双向琼脂扩散法l 纯度：免疫电泳人工结合抗原 半抗原 偶联桥 载体蛋白半抗原：能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应 、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质（ 如青霉素、磺胺剂等 ） ，称为简单半抗原。 半抗原载体蛋白：制作人工结合抗原时与半抗原进行偶联的具有免疫原性的生物大分子，主要为大分子的蛋白质。如：牛血清白蛋白(BSA)。 1、选择合适的多肽序列，蛋白质

21、的抗原决定簇一般由6-12个氨基酸构成，呈连续性或者非连续性序列。 确定抗原区域性2、抗原决定簇大部分为亲水性基团，暴露在外侧，抗原决定簇柔韧性比较高。 亲水性、表露性、 柔韧性 3、制备性抗原地多肽有效长度一般是10-20个氨基； 334Da 半抗原的分子量 374Da 制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。 300Da 产生具有良好灵敏度和特异性单克隆抗体的可能性下降确定多肽的长度 人工抗原合成常用的载体载体的特点载体表面应首先应具有化学活性基团。 载体应具备一定的容量，可以偶联足够的分子。 载体应该是惰性的，不应干扰偶联分子的功能。 载体应具有足够的稳定性，且应该是廉价易得的。 牛血清白蛋

22、白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等是常用的载体蛋白。蛋白偶联方法通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合，不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行。 一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法。所有的偶联方法都应该是通过羧基或氨基端残基将多肽耦联到载体蛋白上。 蛋白偶联方法l 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联 l 混合酸酐法（mixed anhydride method），又称氯甲酸异丁酯法 正丁胺 -COOH- 中间体+NH3+ 结合产物 +氯甲酸异丁酯 l 碳二亚胺法(EDC)l l 含有氨基

23、或可还原硝基半抗原的偶联 l 戊二醛法 -N=C （schiff键） l 重氮化法 （用于活性基团是芳香胺基的半抗原） 芳香胺基+NaNO2 +HCl 重氮盐 l 含羟基半抗原的偶联 l 琥珀酸酐法 -OH-+琥珀酸酐 无水吡啶 带有羧基的中间体 EDC法或混合酸酐法 结合产物 l 羰基二咪唑法（CDI） N，N-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂 免疫血清的制备l 免疫血清：也称抗血清，是抗原接种动物后，取其血清制成，含有已知抗原的特异性抗体l一、免疫动物的选择制备抗血清常用哺乳类和禽类，如绵羊、兔子、豚鼠、鸡、山羊、马等选择的原则：1. 抗原与免疫动物种属差异越大，免疫原性越好2. 须选择适

24、龄、健康、SPF级的动物3. 根据抗血清需要量大小选择不同体型动物4. 根据所用抗原的性质选择不同种属动物蛋白质抗原家兔、山羊，细菌马、家兔，酶豚鼠二、免疫方法的确定l 抗原的注射剂量和间隔时间 综合考虑抗原的免疫原性、动物的个体状态、佐剂种类，通过预试验确定合适剂量与间隔时间 - 第一次接种适量宜小，避免免疫耐受 - 以后接种剂量适当增加，提高抗体效价 - 首次免疫后，间隔720 d接种第二次，避免免疫耐受，之后间隔710 d，防止抗体效价下降l 免疫途径 - 皮内、皮下一般多点注射 - 腹腔、静脉注射常用于颗粒性抗原免疫 - 宝贵抗原可淋巴结内微量注射免疫佐剂 immunoadjuvant

25、：简称佐剂，是非特异性的免疫增强剂，可先于抗原注入机体、或与抗原一起注射，能增强机体对抗原的免疫应答能力，或改变免疫应答的类型佐剂的作用机制l 增强抗原的免疫原性：改变抗原物理性质、降低分解速度、延长抗原的作用时间l 活化细胞膜，促进巨噬细胞和淋巴细胞对抗原的有效处理l 直接或间接激活免疫活性细胞、增强免疫应答功能常用佐剂的种类有免疫原性：卡介苗、百日咳杆菌、结合分枝杆菌无免疫原性：氢氧化铝、磷酸钙、液体石蜡、表面活性剂弗氏佐剂：不完全弗氏佐剂油剂（液体石蜡/花生油）+ 乳化剂（羊毛脂/吐温-80）2： 1完全弗氏佐剂不完全弗氏佐剂+卡介苗（220 mg/mL）将抗原和弗氏佐剂按11充分混合成

26、乳剂使用佐剂的应用原则l 免疫原性较强的抗原不需要使用佐剂，如颗粒性抗原l 可溶性抗原初次免疫必须使用佐剂l 完全弗氏佐剂会引起局部炎症反应，不应连用l 佐剂应该应该无毒性无副作用免疫失败的可能原因l 免疫动物的种属及品系不合适l 制备的免疫原不合适l 所用的佐剂不合适或使用有误l 免疫的方法不合适l 动物的饲养不符合要求为避免失败，应严格遵守已有的试验操作步骤（protocol）进行，不应随便更改细则抗血清采集l 颈动脉放血法 绵羊、山羊、家兔l 心脏采血法 家兔、大鼠、豚鼠、鸡等小动物l 静脉多次采血法l 小鼠还可采用眼球摘除或断尾采血l 注意对试验动物的人道处理！抗血清的鉴定、纯化与保存

27、l 抗血清的分离 - 离心法最常用 - 采集血液室温自然凝固后，37放置1h，4过夜，血块收缩后即可分离血清 - 某些血清在分离后需经56处理30min，以灭活补体l 抗血清的鉴定 1、双向免疫扩散法鉴定特异性抗体 2、双向免疫扩散法测定抗体效价 3、SDS-PAGE可测定抗体的纯度l 抗血清的纯化：去除其他非特异性成分单价特异性抗体纯化抗血清不纯的原因：1、免疫原不纯，出现杂抗体2、出现抗重链杂抗体或抗轻链杂抗体3、某些蛋白总与其他蛋白结合出现纯化方法：1、亲和层析法：杂抗原与Sepharose 4B层析柱交联，将抗血清过柱，其他杂抗体被吸附，特异性抗体被洗脱2、吸附法：非特异性抗原与戊二醛

28、制成固相吸附剂，加入抗血清，杂抗体与杂抗原结合，特异性抗体则存在于上清中特异性IgG抗体的纯化l 硫酸铵盐析法： 经多次盐析得到蛋白沉淀，复溶后透析除盐，可粗提取- 球蛋白l 亲和层析法： 制备SPA-Sepharose 4B层析柱，IgG先与SPA结合，然后被洗脱l 离子交换柱法：抗血清过QAE-Sephadex柱l 凝胶过滤法：多孔凝胶分离不同大小蛋白l 酶解法： 胃蛋白酶或木瓜蛋白酶制备F（ab)2和Fab片段l 抗血清的保存 纯化后的抗血清需进行过滤除菌，或用0.1%0.2%的NaN3溶液防腐，分装保存 - 4可存放3个月到半年 - 2070可保存5年- 真空干燥后， 4可存放510年

29、单克隆抗体的制备单克隆抗体 monoclonal antibody， McAb 由一个B细胞杂交瘤细胞产生的，只针对某一特定的抗原表位的抗体，称为单克隆抗体，由于来源于同一细胞系，单克隆抗体具有均一的特异性，其Ig的类、亚类、型都是均一的。1975年，Kohler和Milstein采用细胞融合技术，得到了B细胞杂交瘤，从而在体外培养制备出了McAb。McAb的制备技术要点:l 用人工的方法将B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤 - B 细胞可从抗原免疫过的小鼠脾脏中获得 - 骨髓瘤细胞应具备以下条件：1. 与B细胞有较高的融合率2. 本身不合成Ig 3. 与B细胞融合后能形成稳定的杂交瘤细

30、胞4. 缺乏HGPRT酶（次黄鸟嘌呤磷酸核糖转化酶）5. 稳定、容易培养McAb的制备流程1、 用抗原对小鼠进行免疫，获得分泌特异性抗体的小鼠B细胞，同时培养小鼠骨髓瘤细胞2、 两种细胞混合后加入融合剂聚乙二醇PEG，融合形成小鼠B细胞杂交瘤。B细胞杂交瘤既有肿瘤细胞无限增值的特性，又有B细胞合成分泌特异性抗体的特性3、 用HAT培养基对融合过程后的细胞进行筛选筛选原理：- HAT培养基含H、A、T三种核苷酸- A的存在抑制糖、氨基酸等分子合成核苷酸；在HGPRT和其他转化酶的作用下，可催化H和T合成所需核苷酸- 骨髓瘤细胞不含HGPRT酶，因此不能在HAT培养基上存活；离体的B细胞也不能存活

31、；只有融合后的B细胞杂交瘤可以存活4、 对融合细胞进行筛选，选出正确表达所需特异性抗体的高分泌性杂交瘤细胞，进行克隆化扩增，以大量制备McAb- 筛选方法一般采用ELISA- 扩增杂交瘤细胞可采用体外培养，或注入小鼠腹腔，也可从腹水中获得大量单克隆杂交瘤细胞- 杂交瘤细胞容易发生染色体丢失，失去分泌抗体的能力，因此筛出阳性克隆后，须尽快保种McAb的特点优点： 结构高度均一，特异性强，效价高，少有交叉反应 可大量生产，且稳定好缺点： 鼠源McAb对人是异种抗原，可能引起超敏反应现代基因工程可对编码Ig的基因进行修饰，直接合成所需的抗体小结l 抗原抗体特异性结合是免疫学检验的基础原理l 抗原抗体

32、反应受多因素影响，因此必须注意试验条件，以保证检验结果的准确与可靠l 纯化的抗原可用于诊断试验或制备抗血清l 抗血清中含有特异性抗体，经过纯化、鉴定后，可用于检测、鉴定抗原l 杂交瘤技术制备单克隆抗体是免疫学技术的一大突破三凝集实验抗原-抗体反应分为两个阶段 特异性结合阶段：抗原和抗体迅速识别、结合 可见反应阶段：受电解质、酸碱度、温度等环境因素影响，发生凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的溶血等可见现象，反应慢凝集反应 agglutination 颗粒性抗原，或与载体颗粒结合后的可溶性抗原（或抗体），与抗体（或抗原）结合后，在适当条件下，出现肉眼可见的凝集现象。参与反应的抗原称凝集原，抗体称凝集

33、素。凝集反应：直接凝集反应 间接凝集反应凝集反应的影响因素l 电解质：0.85% NaCl溶液，降低颗粒性抗原的电荷l pH值： 合适pH值为68，pH在3左右出现细菌的自凝现象，称为酸凝l 温度：过冷反应速度慢，过热破坏蛋白结构l 抗体与抗原的比例 什么现象？ 一、直接凝集试验颗粒性抗原直接与相应抗体结合，在适量电解质存在的条件下，出现肉眼可见的凝集现象1、玻片法简便、快速的定性试验，敏感度低 如：人类ABO血型鉴定，细菌分离株的鉴定与分型2、试管法半定量试验：了解抗体及其含量 二、间接凝集试验将可溶性抗原吸附或偶联在大小适当、与免疫无关的载体微粒上，制成致敏颗粒，再与相应的抗体作用，在适宜

34、电解质存在时，出现特异性凝集现象，也称被动凝集试验 致敏： 将可溶性抗原吸附或偶联到载体微球上的过程称为致敏，致敏后的载体微球称为致敏微球。致敏后的颗粒反应面积增加，敏感性提高。 载体微球的条件1、不溶于水，理化性质稳定，无化学活性和免疫学活性2、大小均匀一致，密度与生理盐水等介质相近，短时间内不致下沉3、可直接吸附或偶联结合抗原或抗体，且不影响其特性致敏所用的抗原或抗体需要纯度高，且免疫活性较好常用载体：红细胞：绵羊、家兔、鸡红细胞，人O型血红细胞 吸附多糖抗原较好，吸附蛋白抗原较差 使用前醛化，可增强吸附蛋白的能力，能耐60加热，可长期保存不溶血。且延长保存期，不易溶血聚苯乙烯胶乳颗粒：人

35、工合成颗粒，带负电 物理方法吸附蛋白，但结合牢固性较差 羧化后，带化学活性基团，可化学交联蛋白，性能稳定，保存期长间接凝集反应的类型1、正向间接凝集试验 用已知抗原致敏载体颗粒，检测样本中的抗体。常用于检测病原微生物相关的抗体2、反向间接凝集试验 用已知抗体致敏载体颗粒，检测样本中的抗原。可检测新型隐球菌荚膜抗原，乙肝表面抗原等3、间接凝集抑制试验 用已知抗原致敏载体颗粒，检测样本中是否含有相同的抗原（正向）。亦可用已知抗体致敏载体颗粒，检测样本中是否含有同样的抗体（反向）。4、间接血凝试验（IHA）：是以红细胞作为载体的间接凝集试验血凝试验 可在微量滴板或试管中进行，将倍比稀释的标本滴一滴到

36、V形板孔中，同时设一空白孔，再滴入一滴0.5%致敏RBC悬液，混匀，室温静置1-2h。 结果： RBC沉积孔底，集中于一圆点为阴性 RBC凝集，分布孔底周围，可根据凝集程度判断阳性反应的强弱，以+为滴度终点。5、胶乳凝集试验（LAT）一种以聚苯乙烯胶乳为载体颗粒的间接凝集反应。通过物理吸附、化学交联的方式结合蛋白质抗原/抗体分为试管法和玻片法胶乳为人工合成的载体，性能比红细胞稳定，均一性好，但与蛋白质结合能力以及聚集性能不如红细胞，因此作为间接凝集反应，胶乳凝集的敏感度不及血凝试验。 6、协同凝集试验用金葡菌作为载体，其表面A蛋白（SPA）可与IgG的Fc非特异性结合，可看做IgG致敏的金葡菌

37、，检测样本中与IgG结合的抗原。可用于细菌的快速鉴定和分型，细菌中和病毒等可溶性抗原的测定。7、自身红细胞凝集试验 抗人O型红细胞抗体：能与各种血型的红细胞结合，但不引起凝集反应 将特异性抗原（抗体）与抗O型红细胞抗体连接，检测全血样本中特异性结合的抗体（抗原） 待测标本：全血凝集反应的特点l 凝集反应所用的抗原是较大的颗粒性物质，在介质中分散成均匀的颗粒悬液l 反应所形成的凝集物主要由抗原物质组成l 由于抗原颗粒大，反应表面积相对较小，为防止抗体过量，试验时需稀释抗体，以利于合理配比抗原抗体，形成可见凝集l 反应效价多以抗体稀释度来判定凝集反应的优点 反应敏感、快速，操作简便，无需特殊仪器设

38、备，适应性强凝集反应的用途 检测各种抗原 检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体 用于青霉素抗体、花粉抗体等抗体的检测小结l 凝集反应试验是以颗粒性抗原或致敏载体微粒的凝集为判定结果的检验方法，包括直接凝集法和间接凝集法l 直接凝集试验中的玻片法是一种定性试验，常用于鉴定血型、细菌等；试管法是一种半定量试验，以效价判定结果。l 间接凝集试验中的正向凝集试验是用已知的抗原检测未知抗体；反向凝集试验和协同凝集试验是用已知的抗体检测未知的抗原；间接凝集抑制试验即可检测抗原，又有检测抗体（四）沉淀反应沉淀反应 precipitation可溶性抗原与相应抗体结合后，在适当条件下，出现肉眼可见的沉淀物的

39、现象参与反应的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素沉淀反应：l 液相沉淀试验：环状沉淀试验 絮状沉淀试验l 凝胶沉淀试验 单向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验l 免疫电泳技术 对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫电泳 自动化免疫电泳l 免疫浊度测定 免疫透射浊度测定 免疫胶乳浊度测定 免疫散射浊度测定沉淀反应的影响因素l 电解质l 温度l 抗原抗体的亲和力 - 一般用多克隆抗体，容易与多个抗原表位结合 - 单克隆抗体适合结合有多个相同表位的抗原 - 免疫小动物获得的R型抗体与抗原有较宽的合适比例范围且亲和力高l 抗体与抗原的比例，初始浓度抗体量固定的沉淀反应曲线l 一般来讲，当抗体的浓度刚好能使所有抗原表位都

40、结合时，抗原和抗体的浓度是最适合的l 由于沉淀反应中使用的抗原分子很小，表位比较多，因此更容易出现抗原过剩的情况，所以常需要对抗原进行稀释使用l 合适比例确定：絮状沉淀试验第一节 液相沉淀试验一、环状沉淀试验 在两液体界面间进行的抗原-抗体反应，一般在小口径试管或毛细管内进行。快速的定性试验，灵敏度低，已少用。二、絮状沉淀试验 常用于抗原抗体最适比的测定：稀释抗原法，稀释抗体法，棋盘格法第二节 凝胶沉淀试验凝胶沉淀试验 gel phase precipitation 抗原和抗体在含电解质琼脂糖凝胶内自由扩散，形成浓度梯度，在二者比例适当处出现肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 方法简单方便，但灵敏度较

41、低。常用琼脂糖凝胶浓度为1%，分子量在100 KD以上的分子不能自由扩散：l 游离抗原、抗体可被洗脱l 抗原-抗体复合物被固定，方便后续工作凝胶网孔有一定限度，当抗原抗体结合成分子量在百位以上的复合物时被网格在凝胶中出现肉眼可见沉淀物。分子越大，扩散越慢，以判断分子量；浓度越大，扩散越快，以判断浓度。 凝胶沉淀试验步骤举例 材料：琼脂粉、平皿、打孔器、生理盐水或其他缓冲溶液、抗原抗体一、单向免疫扩散试验 single immunodiffusion test 在融化的琼脂中混入抗体，冷凝后将待测抗原溶液向凝胶内扩散，形成沉淀环l 应用： 经典抗原定量技术。可通过标准浓度的抗原样品绘制标准曲线，

42、测定样本中的抗原浓度，或测定样本中的抗体浓度（逆向免疫扩散试验）。l 特点： 重复性和线性好，但灵敏度稍差抗原浓度 （x轴） 沉淀环直径（y轴）Mancini曲线：C=kd2Fahey曲线： logC=kd 二、双向免疫扩散试验double immunodiffusion test 抗原与抗体各自在凝胶内自由扩散，在二者比例适当处形成沉淀线l 沉淀线的数目、位置和形态与抗原和抗体的纯度、浓度、相对分子量、扩散速度等有关l 通过沉淀线的情况可分析：1、抗原、抗体的定性分析2、抗原、抗体相对分子量和浓度 沉淀线向分子量大的方向弯曲 沉淀线靠近浓度较低的一方 浓度决定位置，分子量决定形状3、抗原、抗

43、体的纯度鉴定 抗原-抗体单一对应，产生一条沉淀线 抗原-抗体多种成分对应，产生多条沉淀线4、抗体效价测定选出现沉淀线的最高稀释倍数计算效价 5、抗原性质分析第三节 免疫电泳技术免疫电泳技术 Immunoelectrophoresis (IEP)凝胶扩散试验 + 直流电场优点：- 提高沉淀反应的速度和敏感度 - 根据蛋白所带电荷不同进行分离，可进 行细致的成分分析一、免疫电泳：先电泳，后双向免疫扩散 常用此法进行血清蛋白种类的分析，对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义。二、对流免疫电泳 CIEP counter immunoelectrophresis 双向琼脂扩散+电泳：同

44、时进行pH8.2-8.6Ag泳向正极Ab泳向负极应用：- 灵敏度高，但分辨率低于双向琼脂扩散 - 抗原不能是Ig蛋白（Ab、Ag会同向泳动）三、火箭免疫电泳 RIEP rocket immunoelectrophresis 单向琼脂扩散+电泳：同时进行含抗体凝胶- 抗原泳向正极- 抗原和抗体形成峰状沉淀孔中加抗原峰高与抗原的量成正比，与同样条件下已知浓度的Ag标准品比较可得到待测Ag的含量，反之可测Ab的含量（反向火箭免疫电泳）。第四节 免疫浊度测定免疫浊度测定 immunoturbidimentry 抗原-抗体复合物（IC）在增浊剂作用下，形成微粒，使溶液变浊。保持抗体过量，一定范围内浊度与

45、抗原的量成正比（前带）。应用：对照标准品的浓度曲线，可对抗原样品进行定量。透射比浊法和散射比浊法抗原量越高IC越多透射光越少，散射光越多免疫胶乳比浊法反向间接凝集试验+光电比浊用抗体致敏大小适中、均匀一致的乳胶颗粒，以提高测定的灵敏度。根据测定时间不同，免疫比浊分为：1、终点比浊法 抗原、抗体反应达到平衡时测定 评价 IC可能会聚合成较大凝聚物，使光信号减弱 耗时长、需扣除本底 2、速率比浊法 测定IC形成的散射光速率峰，峰值大小与抗原浓度成正比 评价 耗时较短，灵敏度高，不需扣除本底 对仪器性能和抗体质量要求较高影响免疫浊度测定的因素l 抗原抗体比例：保持抗体过量l 抗体的质量： 特异性、效

46、价、亲和力、等价带范围l 反应的环境条件：缓冲液的离子强度、离子种类、pH值，温度等l 入射光波长l 内源性光漫射干扰l 伪浊度伪浊度：并非由抗原、抗体特异性结合生成的免疫复合物（IC）形成的浊度，是假阳性的重要原因1、标本浑浊，含高血脂，保存时间过长2、抗血清效价太低，或经过灭活，存在交叉反应3、PEG过高使血清中杂蛋白非特异性共沉淀4、试剂被污染，仪器不够清洁5、反应条件不合适使蛋白质变性、盐析免疫比浊法的使用规则l 使用新鲜样本，离心或稀释后再使用l 避免加热灭活抗血清和样本l 选用等价带范围宽的R型抗体，保证效价在1:20以上、且亲和力和特异性均高l 保持合适的pH值和离子强度，一般用

47、磷酸缓冲液，反应pH在6.5-8.5l 保证比色皿洁净，试剂未被污染（可滤膜过滤）l 每次更换试剂需重新制作标准曲线l 选择合适的入射光波长l 设置空白试剂、抗血清和样品 沉淀反应的特点l 抗原是相对分子质量较小的可溶性蛋白和多糖类物质，分散在介质中呈均匀的液相交替l 反应形成的沉淀物主要由较大的抗体组成l 为避免分子质量相对较小的抗原过量，常稀释抗原以达到适当抗原抗体比例，有利沉淀产生l 反应结果以抗原稀释度来判定效价凝集反应与沉淀反应比较小结l 沉淀反应中的抗原是可溶性的，反应形成白色沉淀l 沉淀反应可在液相及凝胶内进行l 液相的经典沉淀反应主要用于定性；用免疫比浊法可进行快速、准确、微量

48、测定l 凝胶内的沉淀反应包括自由扩散的单、双向扩散试验，结合电场作用则为免疫电泳，通过沉淀线可判定抗原、抗体的性质、相对分子量、纯度等，通过绘制标准曲线可测定抗原浓度（五）补体测定和补体结合试验免疫溶血反应 免疫溶血反应是指红细胞-抗体复合物激活补体，导致红细胞溶解的反应。反应组分绵羊红细胞 SRBC （无纤维蛋白）抗红细胞抗体，即溶血素hemolysin 补体自学内容：免疫溶血反应各组分的制备免疫溶血反应的应用直接用途l 测定血清总补体活性l 测定单个补体成分的活性指示系统l 对溶血素效价进行滴定l 检测另一反应系统的抗原或抗体一、补体总活性的测定l 原理：补体可使溶血素致敏的SRBC溶解，

49、在一定范围内，溶血程度与补体总活性成正相关。l试验要点1、使用新鲜SRBC配制2%悬液，并进行吸光度校正 缓冲液对照透光度为100%，2%SRBC为40%2、溶血素的效价需预先滴定3、缓冲pH为7.2-7.4，可添加适量Ca2+和Mg2+增强补体的活性4、用溶血素致敏SRBC时，需随加随摇，充分混合5、试管、吸管等器材应清洗干净，无脂应用与评价l 补体系统主要参与一些病理反应，因此补体活性测定常用于疾病的辅助诊断和疗效判断l CH50法简便快速，但敏感性和重复性较差二、单个补体成分的测定1、免疫溶血法 测定补体的功能和活性2、化学免疫法 测定补体的浓度 单向免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫比浊法三

50、、补体结合试验 CFT complement fixation testl 主要原理：抗原-抗体复合物可结合补体，从而用补体和致敏红细胞来检测抗原、抗体间有无特异性结合 反应系统：已知抗原与待测抗体，或已知抗体 与待测抗原 补体系统 指示系统：溶血素致敏的SRBC试验要点l 各成分的加入顺序：反应系统，作用一段时间后加入补体，最后加指示系统l 各成分的加入剂量要预先滴定，防止假性结果l 除了标准的阳性和阴性对照，还应对试验用的各成分设置对照检查l 器材洁净无脂，试剂无菌，防止抗补体现象应用与评价l 补体结合试验主要用于抗原、抗体的定性检测诊断病毒性疾病和螺旋体立克次体等疾病及定量分量，也可分析抗原的结构差异分型鉴定l 由于补体活化过程的放大作用，检测灵敏度高，特异性强，反应结果易于观察，不需特殊仪器l 因参与反应的成分多，操作较繁琐，影响因素多，且补体难以标准化，目前该方法的应用已逐渐减少小结l 补体检测主要包括补体溶血活性测定、单个补体成分的含量或溶血活性测定l 补体活性测定常用CH50法l 根据补体能与抗原-抗体复合物结合的特点，可利用