南医微生物实验报告

1、脓汁和粪便标本中病原菌的检测摘要脓汁和粪便标本中有不同的病原菌。为了探究两种标本中病原菌的种类、特性和生化反应等，本实验将对脓汁和粪便中的病原菌进行分离培养、革兰染色、生化反应、血清学反应、细菌药物敏感性试验等操作。在实践中学习培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定等操作方法。从而达到掌握各种微生物实验的操作方法，培养对微生物实验的兴趣，反思微生物实验中所遇到的问题并总结探讨如何解决优化的目的。引言 常见的化脓性病原菌有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌等。 临床上，脓汁标本在做细菌分离培

2、养的同时，须直接涂片检查，观察是否有典型形态的菌体，芽孢有无，为临床提供最初的诊治依据；粪便和经离心的尿沉淀物等则直接接种与指定的培养基中。 粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、大肠埃希菌属、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基（如SS琼脂、伊红-美蓝平板等），选择培养基时应根据需要尽可能地抑制杂菌，以利于病原菌的检出。本实验通过常规的病原菌检测方法从脓汁标本中分离出黄白两种细菌，均为革兰氏阳性球菌，其中黄色是致病菌金黄色葡萄球菌，白色是白色葡萄球菌；从粪便标本中分离到紫黑色和粉红色的细菌，均为革兰氏阴性杆菌，其中紫黑色的是

3、大肠埃希菌，粉红色的是痢疾志贺菌。1.实验材料1.1器材 酒精灯、接种环、接种针、打火机、试管、棉塞、油性笔、污物盘、普通冰柜、奥林巴斯 CX21型生物显微镜、拭镜纸、称量纸、药勺、牛皮纸、电炉、橡皮筋、锥形瓶、刻度尺、镊子、玻片、吸水纸、培养皿、高压蒸汽灭菌器、隔水式电热恒温培养箱等。1.2 试剂药品 脓汁标本、粪便标本、营养琼脂、营养肉汤、半固体琼脂、普通营养琼脂培养基、伊红-美蓝培养基、斜面琼脂、结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释品红、香柏油、拭镜油、葡萄糖微量发酵管（2支）、乳糖微量发酵管（2支）、青霉素抗菌素纸片、先锋霉素抗菌素纸片、庆大霉素抗菌素纸片、蒸馏水、生理盐水、兔血浆、福氏

4、志贺菌诊断血清等。2.实验方法与步骤实验的总流程：培养基的制备细菌的分离培养细菌的纯培养细菌的形态学检查细菌的生化试验等细菌的血清学试验、结果分析2.1培养基制备（1） 营养琼脂培养基营养琼脂干粉与蒸馏水按适当比例充分混合均匀加热溶化高压蒸汽灭菌倒平板分装琼脂完全凝固后，平板倒放4冰箱保存备用（2） 斜面培养基营养琼脂干粉与蒸馏水按适当比例充分混合均匀加热溶化高压蒸汽灭菌倒试管分装培养基趁热斜放琼脂凝固以后，4冰箱保存备用2.2空气与人体体表细菌学检查2.2.1空气的细菌学检查2.2.1.1实验方法自然沉降法:根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养

5、以后，计数菌落形成单位（ Colony-Forming Units，CFU），可了解空气的污染情况。2.2.1.2实验步骤每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间、走廊等）将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边平板暴露于空气中15分钟平板倒扣盖上作标记37温箱培养24小时观察结果2.2.2人体体表的细菌学检查2.2.2.1实验步骤甲常规洗手，乙标准洗手，甲和乙共用1个平板。按下图在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。2.3 细菌的分离培养2.3.1实验方法平板划线法：借助于划线，将混杂的多种细菌，在平板表面分散成单个细菌，并固定在某

6、一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团（单菌落）。2.3.2实验步骤接种环烧灼灭菌分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和伊红美蓝平板上，各做两份烧掉接种环上多余的脓汁或粪便标本冷却后，使用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2份），粪便标本接种于伊红美蓝平板（2份）接种环烧灼灭菌将平板倒置37培养1824h观察结果2.4细菌的群体生长特性观察和纯化培养2.4.1实验方法斜面接种法：是一种从已经生长好的菌种中挑取少量菌种移植到另一个斜面培养基的饭方法。该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。用灭菌的接种环取单个菌落或少许细菌，从培养基斜面底部向上划

7、一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端。2.4.2实验步骤接种环烧灼灭菌挑选平板上典型的四种单菌落（白色、金黄色、紫黑色、粉红色）进行斜面接种纯培养做好标记接种环烧灼灭菌斜面培养基置于37培养过夜保存备用2.5细菌的个体形态特征的观察2.5.1实验方法:革兰氏染色法和肉汤接种法2.5.2实验原理革兰氏染色法：G菌的细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。G菌的肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，稀释品红复染后呈红色。2.5.

8、3实验步骤革兰氏染色法：涂片 干燥 固定 染色 具体步骤如下：取洁净玻片用灭菌操作后的接种环取生理盐水1-2环于玻片上挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回2-3回合 结晶紫 初染1分钟水洗卢戈碘液媒染1分钟水洗95乙醇脱色约20秒钟水洗稀释品红复染1分钟水洗吸干,镜检。2.5.4肉汤接种法接种环烧灼灭菌分别在斜面培养物中挑取菌苔少许立即移入肉汤培养基管中在接近液面的管壁上轻轻研磨沾取少量肉汤调和混匀试管口通过火焰2-3次灭菌塞好棉塞35培养4-6小时2.6 药敏试验2.6.1实验方法纸片扩散法: 将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细菌的平板上。纸片中的

9、抗菌素吸收培养基的水分，溶解后不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸片周围的生长受到抑制，而形成没有细菌生长的抑菌圈。2.6.2实验步骤接种环烧灼灭菌分别取之前实验中得到的四种菌液在普通平板密集涂布接种环烧灼灭菌 标记:青、先、庆 镊子火焰消毒贴青霉素、先锋霉素、庆大霉素纸片 按压镊子消毒倒置37培养1824小时 观察结果2.7 血浆凝固酶试验2.7.1实验方法：玻片法2.7.2实验步骤取干净玻片一张在左右两边分别滴加兔血浆15l，生理盐水15l滴接种环烧灼灭菌冷却分别用接种环取之前实验所得到的白色和黄色菌苔(23个菌落的菌量)与血浆研磨混合边混匀边观察结果接种环烧灼灭菌稍等片刻，观

10、察结果2.8 糖发酵试验接种针烧灼灭菌用灭菌接种针分别刮取实验所得到的紫黑色和粉红色菌苔分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内接种环烧灼灭菌将微量管平放在平板内37培养过夜后观察结果2.9 动力试验2.9.1实验方法：半固体接种法2.9.2实验步骤接种针烧灼灭菌分别用接种针在紫黑色和粉红色的斜面取菌从半固体培养基中心垂直刺入，可刺达近底管处，但不要到达管底循原来的路线退出接种针试管口迅速通过火焰2-3次灭菌塞好棉塞烧灼灭菌接种针37培养24小时观察结果2.10血清学实验取洁净的玻片一张将磨面近端设为对照区滴加生理盐水15ul远端设为试验区滴加福氏志贺菌诊断血清15ul接种环烧灼灭菌用接

11、种环分别取粉红色菌苔研磨于盐水或血清内，混合均匀接种环烧灼灭菌玻片来回倾侧观察结果3.结果3.1空气的细菌学检查本小组将营养琼脂平板放置在女洗手间外的走廊上，暴露了15分钟，并在37温箱培养了24小时，所得结果：营养琼脂平板上一共出现6个菌落。经与实验室其他小组的实验结果相比，发现：若以菌落数的多少表示空气细菌含量的多少，则秋实堂五栋内，空气细菌含量最少的为女洗手间，而窗台、实验室等处空气细菌含量最大。经老师的指导与小组间的讨论得出如下猜想：空气细菌含量与场所人流量、通风状况等都有着密切的关系。人流量大且密闭不通风的条件下空气细菌含量大。3.2人体体表的细菌学检查正常人的手作为人最常使用的部位

12、之一，所接触到的细菌会比较多，其中有常驻菌群和暂驻菌群。皮肤“常驻菌群”种类、数量相对比较固定，清洗后数量可以减少，但不会彻底消失。皮肤“暂驻菌群”是由于人体频繁接触外部环境而沾染上的各种细菌。如上图所示，横轴上方为标准洗手，横轴下方为常规洗手。结果显示：标准洗手后培养基上的细菌数目反而增多，且多于常规洗手所得的细菌数目。经老师指导和小组间讨论得如下猜想：在标准洗手的过程中如果搓手，那么会将原来隐藏在皮肤深处的细菌带到手的表面，这样的手在干燥后接触培养皿时，会留下更多细菌。3.3细菌的分离培养根据任务分配，本人是乙，所取标本为脓汁标本，所接种的培养基为营养琼脂培养基。37培养1824h后观察得

13、上图结果。本次分区划线分离法操作成功，且得到了一定数目的单菌落，菌落颜色有黄色和白色两种。另有伊红美蓝培养基得到两种菌落，颜色有紫黑色和粉红色两种。根据具体结果制得下表：细菌分离培养结果表标本脓汁粪便菌落颜色金黄色白色紫黑色粉红色形态特征圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、不透明，菌落较小，直径为2mm左右具有金属光泽、大而隆起、不透明，菌落直径23mm半透明，菌落较小，直径为12mm结果根据形态特征可大胆推测为葡萄球菌；根据菌落颜色，金黄色的是金黄色葡萄球菌，白色的是白色葡萄球菌从形态上暂时不能鉴别是什么细菌，需要进一步检测鉴定3.4细菌的个体形态特征的观察 四种细菌在1000油镜下观察结果如上

14、图，具体形态如下图： 根据实验结果绘制下表：细菌的个体形态特征表菌落来源脓汁标本粪便标本菌落颜色黄色白色紫黑色淡粉红色油镜下特征呈紫色，均为G+球菌，呈葡萄串状，排列不规则呈红色，均为G-杆菌，散在排列3.5糖发酵实验和动力试验结果 根据实验结果绘制下表：葡萄糖乳糖半固体紫黑色+粉红色-：产气产酸 +：产酸不产气或阳性 -：不产酸不产气或阴性经查阅资料得肠道杆菌生化反应特性如下表：葡萄糖乳糖半固体埃希菌属+志贺菌属-沙门菌属/+ -+霍乱弧菌+-+变形杆菌属-+：产气产酸 +：产酸不产气或阳性 -：不产酸不产气或阴性根据肠道杆菌生化反应特性表与实验结果对照得结果为：紫黑色菌落为埃希菌属，粉红色

15、菌落为志贺菌属。3.6血浆凝固酶实验结果实验结果如上图。放大观察如下图：根据致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白,附着于菌体表面,形成凝块的原理，可得结果：金黄色菌落为金黄色葡萄球菌，白色菌落为白色葡萄球菌。3.7血清学实验实验结果如上图。放大观察如下图：菌液凝集者记为阳性，菌液均匀混浊记为阴性。根据上图得实验结果得：粉红色菌落为志贺菌属。3.8药敏试验结果 根据实验结果绘制下表： 药敏试验结果表一：菌落黄色白色紫黑色粉红色青霉素+-先锋霉素+庆大霉素+备注：“+”为敏感，“-”为耐药表二：抑菌圈直径（mm）青霉素庆大霉素先锋毒素V金黄色菌落463646白

16、色菌落333136紫黑色菌落-2628粉红色菌落-3034表三：常用药敏试验纸片判断标准抗菌药物纸片含药量抑菌圈直径（mm）耐药中毒敏感敏感青霉素G10单位28-29先锋霉素V30微克1415-1718庆大霉素10微克1213-1415 从之前实验的种种的现象与结果可知，金黄色的是金黄色葡萄球菌，白色的是白色葡萄球菌，紫黑色的是大肠埃希菌，粉红色的是痢疾志贺菌。其中，四种菌对先锋霉素和庆大霉素都敏感，而金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌对青霉素敏感，大肠埃希菌和痢疾志贺菌对青霉素表现为耐药。4.综合结果讨论4.1对脓汁中细菌的分析讨论应用分区划线分离法，于营养琼脂平板上，从脓汁标本中分离出金黄色和白

17、色两种菌落。在1000油镜下观察时，这两种细菌均为G球菌，排列不规则，呈葡萄串状，符合典型葡萄球菌的特征。结合菌落的颜色，可以初步断定，这是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。通过血浆凝固酶试验，观察到金黄色葡萄球菌能使血浆产生颗粒性物质，白色葡萄球菌则没有反应，说明了金黄色葡萄球菌是致病菌。最后进行的是药敏试验，从培养基上可以观察到，不同的抗生素所形成的抑菌圈不同，其中青霉素对金黄色葡萄球菌最敏感。用伊红美蓝平板分离菌落时，可以从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽的菌落和粉红色半透明菌落。4.2对粪便中细菌的分析讨论在显微镜下观察时，这两种菌均为G杆菌，排列不规则，从形态上暂时不能鉴别是什么细菌。

18、球菌是致病菌。经糖发酵试验，可以观察到，紫黑色菌落的细菌使能使葡萄糖和乳糖的试管变色和产生气体，粉红色菌落的细菌只能使葡萄糖的试管变色而无气体，对乳糖无反应。说明紫黑色菌落的细菌可以分解利用葡萄糖和乳糖，并产生气体，粉红色菌落的细菌只可以分解利用葡萄糖，且不产生气体，不能分解利用乳糖。经半固体动力试验，观察到紫黑色菌落的细菌使半固体培养基细菌扩散生长,培养基混浊，粉红色菌落的细菌沿接种线生长,培基清澈透明。说明紫黑色菌落的细菌有动力（有鞭毛），粉红色菌落的细菌无动力（无鞭毛）。根据上述实验得出结论，紫黑色菌落的细菌为大肠埃希菌，粉红色菌落的细菌为痢疾志贺菌。玻片凝集试验，福氏志贺菌诊断血清与粉

19、红色菌落的细菌混合，出现肉眼可见的凝集块，证明粉红色菌落的细菌为痢疾志贺菌。最后进行药敏试验时，发现大肠埃希菌对青霉素不敏感，对庆大霉素和先锋霉素都敏感。 综上所述，脓汁标本中分离得金黄色菌落为金黄色葡萄球菌，白色菌落为白色葡萄球菌，致病菌为金黄色葡萄球菌；粪便标本中分离得紫黑色菌落为大肠埃希菌，粉红菌落为福氏志贺菌，致病菌为福氏志贺菌。5. 讨论 本次脓汁和粪便标本中病原菌的检测微实验，是本人的第一次微生物实验。许多实验方法都是第一次接触和亲自操作。在老师耐心细致的指导下，通过自我总结和小组讨论，本人有如下总结：5.1 在培养基制备中一定要规范操作，如果培养基的效果差的话就会直接影响到后续的

20、实验，会导致整个实验所得到的结果都受到影响。5.2空气的细菌学实验中，空气细菌含量与场所人流量、通风状况等都有着密切的关系。人流量大且密闭不通风的条件下空气细菌含量大。5.3人体体表的细菌学检实验中，在标准洗手的过程中如果搓手，那么会将原来隐藏在皮肤深处的细菌带到手的表面，这样的手在干燥后接触培养皿时，会留下更多细菌。5.4细菌的分离培养实验中，采用分区划线发法分离细菌时，接种环与平板须成大致30，涂布时切勿用过大的力度，以免划破平板。5.5实验时应坐着，在火焰周围1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。5.6伊红美蓝平板上，大肠杆菌分解利用完乳糖之后，就要利用

21、蛋白质，蛋白质分解大多产生碱性物质，中和了乳糖分解时产生的酸。因此培养、放置时间过长或者平板上某个部位细菌比较多、菌落比较密集时，大肠杆菌菌落可能会由原来的紫黑色变成粉红色，或者菌落中心黑色，边缘粉红色。5.7挑取细菌时，应在菌落分布最稀疏的区域，选择平板上相同的菌落数多的、典型的、容易挑取的单菌落。5.8细菌的形态学检查实验中，从斜面上取菌时，一般只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在菌苔上轻刮一下即可。倘若取菌过多，则在油镜下观察时会使视野中的细菌过于密集，出现重叠，难以观察细菌形态，且常常会导致假阳性的出现。5.9革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，若脱色过度，则阳性菌可被误染

22、为阴性菌：若脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。因此应该要操作迅速，控制在20秒以内。此外，染色时通常会用新鲜的细菌培养物，因为菌龄会影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。5.10在糖发酵实验当中，存放的时间不应过长，否则会使产气的微量发酵管的气体排出，导致所看到的现象不准确。此外，实验完成后，管口不能朝上，这是因为管口朝上时，反应过程中产生的气体会溢出，观察不到正确的实验结果，最终会影响到细菌的最终鉴定。5.11在糖发酵实验当中，若出现四支微量发酵管均呈黄色，可能是因为纯培养时，菌落挑错了或所取的不是单菌落，无菌操作不严格导致污染杂菌，或接种时未协调好，接种错误。5.12玻片凝集实验中，在适量电解质存在的情况下，颗粒性抗原(细菌)与特异性抗体结合，如果比例合适，则出现肉眼可见的凝集块。因此该实验应注意取适量的细菌。5.13在操作动力实验的过程中，接种针应该要顺着原路退出，如果此过程中接种针左右摆动了，会出现本没有鞭毛的细菌经培养呈现一片浑浊，难以判断是操作有误还是细菌的运