胆汁酸、结肠炎

1、PPAR-UGT axis activation represses intestinal FXR-FGF15 feedback signalling and exacerbates experimental colitisby142111.摘要 胆汁酸在炎症性肠道疾病（IBD）中发挥着重要作用，但胆汁酸IBD中失调的机制仍是未知。本文指出PPAR（过氧化物酶体增值物激活受体）-UGTs（葡萄糖醛酸转移酶）信号对胆汁酸体内平衡起着重要的决定作用。葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎通过激活过氧化物酶体增值物激活受体PPAR-UGTs途径，导致胆汁酸在发炎的结肠组织中积累。UGTs加速胆汁酸的清除

2、和代谢，从而降低其在小肠中的胞内水平。细胞内胆汁酸的降低使法尼醇X受体(FXR) -FGF15信号的减弱，导致肝CYP7A1的上调，从而促进胆汁酸的从头合成。PPAR的敲除和用重组FGF19治疗都能显著减轻DSS诱导的结肠炎。因此，本文推测，肠PPAR-UGTs和下游FXR-FGF15信号通路对胆汁酸体内平衡起重要的决定作用，并在结肠炎的病理发展中发挥重要作用。 回肠中OEA激活PPAR，上调UGTs的作用，增加胆汁酸的代谢清除。FXR內源性配体胆汁酸在小肠细胞内的水平减少，减弱了回肠FXR-FGF15的信号，导致肝CYP7A1的连续激活，并因此增加胆汁酸的从头合成，最后导致胆汁酸在发炎的结肠

3、组织中积累。2.基本介绍2.1结肠炎中结肠胆汁酸累积通过对DSS造模组的胆汁酸水平的观察发现：与正常鼠比，结肠炎小鼠胆汁酸池较大，表明胆汁酸从头合成增加；与正常鼠比，结肠炎小鼠血清中胆汁酸浓度较低，而在胆囊、小肠、结肠和粪便中较高。Figure 1 | DSS-induced colitis disrupts bile acids homeostasis. (a) Bile acid pool analysis. The bile acid pool size was analysed by measuring total bile acids in the whole enterohepat

4、ic system, including the liver, gall bladder and the entire small intestine and its contents, and the values were normalized by body weight. (be) Total amount of bile acids in individual compartments.2.2结肠炎中肝CYP7A1上调通过对DSS造模组的胆汁酸水平的观察发现：与正常鼠比，结肠炎小鼠胆汁酸池较大，表明胆汁酸从头合成增加；与正常鼠比，结肠炎小鼠血清中胆汁酸浓度较低，而在胆囊、小肠、结肠和

5、粪便中较高。Figure 1 | DSS-induced colitis disrupts bile acids homeostasis. (a) Bile acid pool analysis. The bile acid pool size was analysed by measuring total bile acids in the whole enterohepatic system, including the liver, gall bladder and the entire small intestine and its contents, and the values w

6、ere normalized by body weight. (be) Total amount of bile acids in individual compartments.2.3结肠炎中FXR-FGF15信号减弱 与正常组比，结肠炎小鼠回肠中 Fxr的mRNA和蛋白含量没有明显变化，但FXR靶基因Fgf15和Shp的mRNA含量显著减少；免疫染色也表明回肠FGF15蛋白含量明显降低。Figure 2 | The intestinal FXR-FGF15 signalling is compromised in colitis. (ce) Expression of Fxr, Fgf15

7、 and Shp mRNAs in the distal ileum. (f) Expression of Fgfr4 and b-Klotho mRNAs in the liver. (g) Immunohistochemistry staining and quantitative analysis of FXR protein content in the distal ileum (scale bar, 50 mm). (h) Immunohistochemistry staining and quantitative analysis of FGF15 protein content

8、 in the distal ileum (scale bar, 50 mm). 2.4结肠炎利于胆汁酸葡糖苷酸化结肠炎中顶膜和基底膜胆汁酸的运输因子Asbt, Osta and Ostb和胞内胆汁酸结合蛋白Ibabp都未产生大变化，表明FXR的减少不太可能是胆汁酸的错误吸收导致的；结肠炎中，粪便和尿中的胆汁酸葡萄苷酸化代谢物都显着地增多；结肠炎中各种UGTs亚型，包括Ugt1a6, Ugt1a7, Ugt2b24 and Ugt2b35，在小肠中mRNA水平都显著上调，相关所有测试底物的酶活性都显着增加，其中CDCA葡萄苷酸化的酶活性增加了4倍。Figure 3 | Intestinal P

9、PAR-UGTs axis is overactivated in colitis. (a,b) The quantitative analysis of glucuronidation metabolites of bile acids in faeces and urine. (c,d) Expression and enzyme activity of UGT1A1, UGT1A6, UGT1A7, UGT2B34 and UGT2B35. 2.5PPAR是结肠炎中扰乱UGTs和胆汁酸的原因2.5.1实验中发现：与正常相比，结肠炎小鼠Acox1和L-Fabp mRNA表达增多，表明PPA

10、R在小肠中激活，同时PPAR的mRNA含量基本不变，但免疫组化表明其蛋白质含量略有上升；与正常相比，结肠炎小鼠（LC-MS）肠内OEA水平明显高出很多；与正常相比，结肠炎小鼠NAPE-PLD 的mRNA（负责OEA的生物合成）表达上调，FAAH的mRNA（参与其分解）表达不变，表明结肠炎小鼠中OEA水平的增加可能是由于生物合成增强引起的。Figure 3 | Intestinal PPAR-UGTs axis is overactivated in colitis. (e) Expression of Ppar, Acox1 and L-Fabp mRNAs in the small inte

11、stine. (f) Immunohistochemistry staining and quantitative analysis of PPAR protein content in the distal ileum (scale bar, 50 mm). (g) The concentration of OEA in the intestine contents of colitis mice, analyzed by LC-MS. (h) The mRNA expression of Nape-pld and Faah in the small intestine. 2.5.2 正常小

12、鼠施用PPAR的激动剂Wy-1464一周后，小肠中的PPAR典型靶基因ACOX1和L-FABP的mRNA显著上调，并导致肠道中Ugts的表达明显增加，表明PPAR在调节肠道胆汁酸葡萄糖醛酸化的关键作用；另外，回肠中FG15的表达显著抑制，肝Cyp7a1基因表达增加，而长FXR表达不受显著影响，表明肠道PPAR -UGTs轴的激活可以调节肠FXR- FGF15信号以及之后的胆汁酸平衡；降低小肠中的胆汁酸水平，但增加结肠和粪便中的胆汁酸含量，并且多种胆汁酸的粪便中葡萄糖醛酸比对照组高得多，表明可以PPAR激动剂处理可模仿DSS诱导结肠炎的现象。Figure 4 | PPAR controls in

13、testinal FXR-FGF15 and bile acid homeostasis. (a) The enzymatic activity of UGT isozymes towards the gluronidation of CDCA. The mice S9 in the distal ileum were a pool of eight individuals. (b) The mRNA expression of Ugt1a1, Ugt1a6, Ugt1a7, Ugt2b34 and Ugt2b35. (c) The ileum expression of Fxr and Fg

14、f15 in control and Wy-14643-treated mice. (d,e) The hepatic expression and protein content of CYP7A1 in control and WY-14643-treated mice. (f) Small intestinal bile acid profiles of control and Wy-14643-treated mice using UFLC-triple-time of flight analysis. 2.5.3 与野生型(WT)小鼠相比，PPAR缺失小鼠肝中表达的Cyp7a1基因m

15、RNA低得多，肝Cyp7a1基因的下调至少部分地是由于肠FGF15上调增加引起的，肠表达UGT基因明显较低，小肠S9部分CDCA的葡萄糖醛酸酶的活性较低，粪便中大多数胆汁酸的葡糖苷酸低得多。Figure 4 | PPAR controls intestinal FXR-FGF15 and bile acid homeostasis.(g) The hepatic expression of Cyp7a1, Fgf15, Fgfr4 and Shp in WT and Ppar-null (Ppar-/-) mice. (h) Expression of Fgf15, Shp and Fxr m

16、RNAs in the ileum. (i,j) The mRNA expression and activity of Ugts in control and Ppar-null mice. 2.6 PPAR-UGTs轴控制肠FXR-FGF19信号2.6.1 大鼠肠上皮细胞系IEC6经WY-14643处理CDCA葡萄糖醛酸的产生显著增加细胞内CDCA的量减少；FXR靶基因FGF15和SHP的表达显着减少；表明与FXR- FGF15活化的显著降低密切相关。2.6.2原代小鼠肠上皮细胞(PMIECs)经OEA和WY-14643处理都能使细胞内CDCA和CA的浓度下降，并且使其葡糖苷酸增加；显著促

17、进CDCA和CA的代谢消除；FXR的靶基因FGF15和SHP的表达显着减少；这表明PPAR的激活抑制FXR的活化的结果。Figure 5 | PPAR-UGTs axis controls FXR-FGF15 signalling in enterocytes. (gi) The relative levels of glucuronidation metabolites in the media and intracellular concentrations of FXR ligands, and the expression of FGF19 in HT29 cells under th

18、e treatment of OEA. (jl) The relative levels of glucuronidation metabolites in the media and the intracellular concentration of FXR ligands, and the expression of FGF19 in HT29 cells under the treatment of fenofibrate. (mo) The relative levels of glucuronidation metabolites in the media and intracel

19、lular concentration of FXR ligands, and the expression of FGF19 of control and UGT1A3 siRNA-transfected HT29 cells 2.6.3平移链接到人类HT29细胞，用OEA和非诺贝特处理PPAR激活，显着降低了CDCA的细胞内水平，而UGT1A3的小干扰RNA沉默显著增加CDCA的水平；显著促进了HT29细胞CDCA葡萄糖醛酸的产生和CDCA的细胞内水平的降低，从而导致FGF19的表达减少；UGT1A3的siRNA沉默大幅增加了细胞内CDCA水平，并降低了CDCA葡萄糖醛酸的产生，导致FGF

20、19表达的双重提升；结果表明，在人体PPAR-UGTs轴的破坏也可以减弱肠道FXR-FGF19信号。Figure 5 | PPAR-UGTs axis controls FXR-FGF15 signalling in enterocytes. (ac) The relative levels of glucuronidation metabolites in the media and the intracellular concentration of FXR ligands and the expression of Fgf15 in PMIECs under treatment with

21、 OEA. (df) The relative levels of glucuronidation metabolites in the media and the intracellular concentration of FXR ligands, and the expression of Fgf15 in PMIECs under the treatment of Wy-14643.2.6.4 IBD患者结肠活检分析PPAR靶基因，包括ACOX1和多个UGTs，分别显著高于对照组；FXR靶基因包括FGF19和SHP的表达，均显著低于健康对照组；与DSS诱导结肠炎的小鼠获得数据相同；结果

22、表明在IBD患者中PPAR-UGTs信号过度活跃，并可能压制FXR-FGF19信号。2.7 PPAR-FGF15信号控制DSS诱导的结肠炎2.7.1小鼠分为PPAR激动剂WY- 14643单独处理或WY- 14643与DSS共同处理两组单独使用DSS处理相比，WY-14643与DSS的联合处理导致体重和结肠的长度更急剧的下降，炎症损伤更严重，以及促炎因子和抗炎性细胞因子之间的不平衡程度更高；WY-14643处理显著上调PPAR和其靶基因ACOX -1，L-FABP和多个UGT亚型基因在回肠的表达；WY-14643和DSS共同处理组小鼠的回肠FXR的靶基因FGF15和SHP 的表达和和肝FGFR

23、4和SHP的表达水平进一步降低，导致肝Cyp7a1基因的表达更加上调以及胆汁酸池的大小增加。Figure 6 | Wy-14643 exacerbates DSS-induced colitis. (a) Body weight. (b) Colon length. (c) Histological assessment (scale bar, 100 mm). (d) Ileum expression of Fxr and Fgf15 mRNAs. (e) Hepatic expression of Fgfr4, b-Klotho, Shp and Cyp7a1 mRNAs. (f) Bil

24、e acid pool analysis. 2.7.2 WT小鼠和PPAR缺失的小鼠进行DSS诱导的结肠炎的比较PPAR缺失小鼠与野生型小鼠都体重减少较少，结肠长度较长和炎症组织损伤较少，由此判断它们比较不易受到慢性DSS诱导的结肠炎；PPARA缺失小鼠与WT同窝小鼠相比，PPAR靶基因L-FABP和多个UGT亚型基因，包括UGT1A1，UGT1A6和UGT1A7在PPAR的回肠表达明显较低；PPAR缺失小鼠与WT同窝小鼠相比，回肠表达FXR的靶基因FGF15和SHP显著较高，而的肝表达CYP7A1显著较低。Figure 7 | Ppar-null mice are less suscepti

25、ble to DSS-induced colitis. (a) Body weight. (b) Colon length. (c) Haematoxylin and eosin staining of colon tissues (scale bar, 100 mm). (d) The mRNA expression of Ppar and L-Fabp in the ileum and liver of WT control and PPAR-null (Ppar-/-) mice. (e) The mRNA expression of Ugts in WT and Ppar-/- mic

26、e. (f) The mRNA expression of Fgf15, Shp and Fxr in the ileum. (g) The hepatic expression of Cyp7a1, b-Klotho, Fgfr4 and Shp in WT and Ppar-/- mice. 2.7.3重组人FGF19 以25 mg kg-1腹腔给药治疗DSS诱导的结肠炎小鼠FGF19的慢性治疗能显著增加重量恢复能力，使结肠长度更长以及改善炎症组织损伤，揭示能够明显减轻DSS诱导结肠炎；FGF19治疗显著恢复FGFR4和SHP，并且尤其使肝Cyp7a1基因的表达水平和胆汁酸池的大小恢复到正

27、常；结果共同表明， FGF15分泌减少是促进DSS诱导的结肠炎病理发展的一个重要的因素，并在FGF19低剂量的慢性治疗可能成为治疗结肠炎是有希望的战略。Figure 8 | FGF19 treatment protects against DSS-induced colitis in mice. DSS-induced chronic colitis mice were treated with recombinant FGF19 at a dose of 25 mg kg-1 per day for the first 14 days per DSS cycle. (a) Body weig

28、ht recorded during the first DSS cycle. (b) Colon length. (c) Haematoxylin and eosin staining of colon tissues (scale bar, 100 mm). (d) Hepatic Fgfr4, b-klotho, Shp and Fxr mRNA expression. (e) Hepatic Cyp7a1 mRNA expression.(f) Hepatic levels of CYP7A1 protein. (g) Bile acid pool analysis. 3.讨论目前的研

29、究表明，慢性DSS诱导的结肠炎激活肠PPAR-UGTs轴，促进胆汁酸和FXR的内源性配体在小肠中的代谢消除。DSS诱导的结肠炎的条件下，内源性的FXR配体细胞内水平降低，抑制肠FXR-FGF15的反馈信号的激活，从而导致肝CYP7A1的上调，并由此增加胆汁酸的从头合成。本文研究结果表明，PPAR-UGT轴的过度激活和肠道FXR-FGF15的信号的减弱是结肠炎的DSS诱导模型的病理发展的关键因素。粪便排泄的胆汁酸增加是IBD中公认的模式，然而，然在IBD中胆汁酸在其他部分的潜在改变的处置不太为人所知并在之前的研究中有争议。实验性结肠炎小鼠的观察中发现，胆汁酸在粪便排泄增加但在血清水平减少，这与实

30、验性结肠炎和IBD 患者早期的观测都相一致。在炎症的结肠组织中胆汁酸积累的水平显着增加，这支持了毒性胆汁酸在加剧结肠炎的病变发展中的可能作用。值得注意的是，尽管胆汁酸池的大小增加了但是多种游离胆汁酸却在小肠显著减少。在回肠细胞中多种FXR配体（包括CDCA，CA和DCA）水平的减少，代表在结肠炎中FXR-FGF15反馈信号通路抑制背后的一个主要机制。此外，结肠炎中肝FGFR4的表达减少，由于FGF19处理可显著恢复FGFR4的肝表达，因此，这一过程可能涉及FGF15水平的减少。FGF15减少以及肝表达其受体FGFR4的降低可能共同合作参与CYP7A1的上调。此外，在结肠炎小鼠回肠中，TbMCA

31、，一种最近发现的内源性的FXR拮抗剂的细胞内积累显著升高。因此，不能排除的可能性是在结肠炎小鼠中，除了在FXR激动剂的降低，FXR拮抗剂TbMCA水平的提高也可以使回肠FXR-FGF15的信号减弱。然而，这些研究结果表明DSS诱导的结肠炎促进胆汁酸粪便消除和肝从头合成胆汁酸增加。在DSS诱导的结肠炎中这样的胆汁酸失调非常类似于使用的胆汁酸螯合剂观察到的现象，即促进了粪便消除胆汁酸和肝表达Cyp7a1基因的上调。最近的一项研究表明胆汁酸在结肠colestilan eatment的特定富集，这似乎说明粪便消除胆汁酸的增加能够促进胆汁酸输送到肠的远端部分，而以上皮细胞受损为特点的炎症结肠组织因此得以

32、易于丰富胆汁酸的种类。由于结肠炎的小鼠与正常对照组相比粪便排泄的游离胆汁酸含量更高，结肠炎小鼠的解离活性降低就无法说明在小肠中细胞内游离胆汁酸的减少。相反，这些结果强烈表明，在结肠炎小鼠胆汁酸的葡糖苷酸化的急剧增加，导致胆汁酸胞内水平的减少这一可能。不像与牛磺酸-和甘氨酸- 结合的胆汁酸，糖醛酸化胆汁酸不能被再吸收，这可能代表了异常的胆汁酸聚集的条件下的一个重要解毒机制。以前的研究表明，胆汁酸的肝葡萄糖醛酸化可能为负反馈机制的一部分，因为胆汁酸限制了它们本身生物活性，并控制它们的细胞内水平，避免了病理生理集聚。本数据表明，肠胆汁酸的葡萄糖醛酸化也是保持胆汁酸内环境稳定的重要因素，它通过控制内源

33、性的FXR配体细胞内水平，从而影响回肠FXR-FGF15信号来发挥这一作用。尽管关于参与小鼠胆汁酸的葡糖苷酸化的确切UGT亚型仍不明了，但由于多种UGT亚型（包括UGT1A3，UGT2B4，UGT2B7，UGT2A1和UGT2A2）被发现在人胆汁酸葡萄糖醛酸化中起作用，本文合理推测多种UGT也参与小鼠的这一过程。以往的研究对于PPAR激活调节CYP7A1和胆汁酸平衡的作用存在争议。一些研究报告说，贝特类药物激活PPAR可以抑制Cyp7a1基因，并认为这是贝特类药物导致人胆结石的副作用的潜在机制。而其他研究表明，内源性激动剂（如脂肪酸的代谢物）激活PPAR，可以促进Cyp7a1基因转录活性并且P

34、PAR特异性激动剂WY-14643能增加小鼠的胆汁酸合成。然而，先前的研究从未考虑过PPAR的活化通过肠的FXR-FGF15信号调节CYP7A1的潜在影响。如今发现小肠中OEA（一种内源性PPAR配体）的增加，和由此导致的PPAR典型靶基因和一些编码UGT的基因的上调，共同表明在结肠炎小鼠中PPAR-UGTs轴的活化。口服PPAR激动剂WY-14643很大程度上模仿了在结肠炎观察到的特征模式，包括UGT表达和活性的增强、肠道FXR-FGF15信号的抑制、肝CYP7A1表达的上调，甚至和胆汁酸部分处理的模式。此外，PPAR缺失小鼠肠道FXR-FGF15反馈信号被发现显著的上升了。在PMIECs中，WY-14643或OEA激活PPAR，导致通过CDCA或CA激活的FXRFGF15信号的抑制。而