基因工程综合实验

1、基因工程综合实验马正文生物13班 130434109摘要：20世纪80年代以来,基因工程技术在农业上的应用取得了斐然成果,植物基因工程已成为农业绿色革命的最重要技术手段。为此对植物基因工程中目的基因的克隆，植物表达载体构建与目的基因的转化以及转基因植株的检测的研究进展作了综合评述。 1.目的基因克隆1.1实验目的1.11 通过PCR法分离克隆目的基因。1.12 熟悉掌握PCR、凝胶电泳、DNA回收纯化、PCR产物与T载体链接、大肠杆菌感受态细胞制备、连接产物转化、重组子筛选等一系列克隆相关技术1.2实验原理基于已知序列或已知同源基因序列，设计基因特异引物或简并引物，以DNA或cDNA为模板进行

2、PCR扩增，扩增产物电泳后回收纯化，与T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经抗性筛选和PCR检测、质粒酶切鉴定获得重组子。1.3实验试剂药品及仪器设备1.31试剂药品PCR反应试剂 (Taq DNA polymerase, 10PCR Buffer (Mg2+)，2.5mM dNTPs, Primers(合成)1TAE, CaCl2，无水乙醇、LB培养基DNA 回收试剂盒，质粒DNA提取试剂盒，DNA markerT-Vector, T4-DNA ligase,质粒DNA提取试剂盒常用限制性核酸内切酶1.3.2仪器设备PCR仪、电泳装置、离心机、恒温箱、摇床、凝胶成像仪、移液器等耗材

3、：PCR管、离心管、吸头、培养皿等1.4实验步骤14.1PCR1.4.11PCR原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。1.4.1.2PCR反应体系DNA模板 1ml上游引物(10pmol/ml) 1ml下游引物(10pmol/ml) 1ml10PCR Buffer 5ml25mM Mg

4、Cl2 4ml2.5mM dNTPs 4mlTaq(4,5units/ml) 0.5mlddH2O 33.5mltotal 50ml或DNA模板 1ml上游引物(10pmol/ml) 3ml下游引物(10pmol/ml) 3ml10PCR Buffer 5ml10mM dNTP (each) 1mlPfu(2,3units/ml) 0.5mlddH2O 36.5mltotal 50ml1.4.1.3模板DNA可以是基因组DNA、DNA片段、cDNA、质粒DNA或含目标DNA的细菌及病毒等，浓度一般小于100ng。1.4.1.4引物设计应遵循下列原则：(1) 长度一般在20-24碱基;(2) 与

5、模板DNA的配对同源性在80%以上;(3) 上游引物与基因编码链序列一致, 下游引物则与之互补;(4) 3未端与模板配对能力较好(最好未端5个碱基能配对);(5) 两引物G+C百分含量相近;(6) 3未端不出现3个连续的G/C;(7) 引物自身或两引物间不存在连续5个或5个以上碱基的互补能力;(8) 两引物3未端序列不应相近;(9) 目标PCR产物的长度应能预测;(10) 经GenBank同源性检索, 目标基因与引物的配对能力应远强于其它基因。1.4.1.5循环条件：一般情况下Taq采用 94, 5min (94, 40s 退火温度, 40s 72, 60-120s)30 72, 10min。

6、Pfu采用 95, 2min (95, 40s 退火温度, 30s 73, 60-240s)35 73, 5min。退火温度是PCR成败的关键，虽然根据引物的特性可估计退火温度， 但更多情况下是通过试验确定退火温度，一般为45-60。退火温度大致可按下式推算：Tm=4(G+C)+2(A+T)-5n， n代表错配的碱基数。延伸时间Taq是每kb 1min, Pfu则每kb 2min。14.2琼脂糖凝胶电泳14.2.1胶的浓度因DNA长度而异：基因组DNA，l DNA 0.4-0.5%质粒(3-5kb) 0.7%3-1kb 0.7-1.0%1-0.5kb 1.0-1.5%0.5kb 2.0%1.4

7、.2.2 电泳缓冲液可选用0.5TBE或1TAE，前者缓冲能力较后者强，但不适用于从胶中回收DNA，建议只采用1TAE用于琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖用电泳缓冲液配制。1.4.2.3电泳电压以5V/cm为宜, 即电泳槽的长度5。1.4.2.4电泳胶中添加0.5g/ml EB。1.4.2.5DNA样品与6上样缓冲液混合后点样，为使DNA条带肉眼可见， 条带DNA必须达2ng。1.4.2.6采用合适的DNA Marker。1.4.3PCR产物与T载体连接反应体系：0.1g载体DNA，2-5l PCR纯化产物，1l连接缓冲液，1l(3units/l) T4 DNA连接酶，加ddH2O至10l，12-16连

8、接过夜。1.4.4大肠杆菌感受态细胞制备及DNA转化感受态细胞1.4.41挑取TG1单菌落在LB培养基中37过夜培养；1.4.42过夜培养的TG1菌按1：50或1：100稀释培养1.5-2hr;1.4.43冰上冷却10min;1.4.44 4000rpm 3min, 4离心；1.4.45沉淀用1ml 100mM CaCl2悬浮，冰上放置10min;1.4.46 4000rpm 3min, 4离心；1.4.47沉淀用0.2ml 100mM CaCl2悬浮，冰上放置30min-24hr后使用;1.4.48将连接产物与感受态细胞混合，冰上放置30min；1.4.49于42热激90s后迅速放冰上2mi

9、n;1.4.410加入1ml LB(不含氨苄青霉素)，混合后于37保温1hr;1.4.411在含100mg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板(直径7cm)表面涂30ml x-gal (20mg/ml, 用二甲基甲酰胺配制)和3ml IPTG (200mg/ml), 然后涂布转化后的细菌;1.4.412 37倒置培养10-14hr，待菌落长成后将平板置于4中保存。1.4.5大肠杆菌感受态细胞的快速制备及转化1.4.51取1ml过夜培养的细菌, 置冰上10min, 离心收集细菌后加入100ml TSS悬浮, 置冰上10min后可用;1.4.52加入要转化的DNA, 置冰上10min;1.4.53

10、 加入0.9ml 含20mM 葡萄糖的TSS, 37培养1小时即可涂板。注：此感受态细胞可于70保存4个月。1.4.6农杆菌感受态细胞制备及冻融转化1.4.61农杆菌稀释100倍过夜培养；1.4.62吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；1.4.63 5000rpm离心5min，弃去上清液；1.4.7质粒提取常规法1.4.71取1ml细菌，12000rpm, 15s；1.4.72用200ml Solution I重悬浮细菌，室温放置5min;1.4.73 加入200ml Solution II，轻轻颠倒混匀， 冰上放置5min；1.4.74 加入200ml Solution III，轻

11、轻颠倒混匀， 冰上放置5min；1.4.75 12000rpm, 10min;1.4.76上清液移入新离心管，加等体积异丙醇, 颠倒混匀, 室温放置2min;1.4.77 12000rpm, 5min，吸干残液；1.4.78溶于50ml 含10mg/ml RNase的TE，37保温20min；(到此步骤的质粒可供电泳检查)1.4.79 补加TE至100ml,加等体积酚/氯仿，剧烈颠倒混匀1min；1.4.710 12000rpm, 5min;1.4.711上清液(上层)移入新离心管，加等体积氯仿，剧烈颠倒混匀30s；1.4.712 12000rpm, 2min;1.4.713 上清液(上层)移

12、入新离心管，加1/10体积3M NaAc (pH5.2)和2倍体积乙醇,室温放置2min;1.4.714 12000rpm, 2min;1.4.715用1ml 70%乙醇洗涤沉淀后, 沉淀于室温或37干燥;1.4.716 溶于50ml TE, -20保存。注: 提取少量质粒用于检查时，也可直接取200ml细菌，接着做步骤3，步骤4中在溶液加入5min后加等体积氯仿/异戊醇，混匀，接着做下面步骤。14.8低蛋白低DNase质粒的提取(该法无需酚/氯仿抽提)14.81取1ml细菌，12000rpm, 15s；14.82用150ml SET重悬浮细菌，室温放置5min;14.83加入350ml So

13、lution II，轻轻颠倒混匀， 冰上放置5min；14.84加入250ml Solution III，轻轻颠倒混匀， 冰上放置5min；14.85 12000rpm, 10min;14.86 上清液移入新离心管，加等体积异丙醇, 颠倒混匀, 室温放置2min;14.87 12000rpm, 5min，吸干残液；14.88溶于50ml 含10mg/ml RNase的TE，37保温20min，然后-20保存。2.植物表达载体构建与目的基因的转化（以烟草为例）2.1实验目的2.1.1进行分子设计构建植物表达载体。2.1.2通过农杆菌介导等基因转化方法获得转基因烟草植株。2.2实验原理根癌农杆菌介

14、导的外源基因转移，整合型的根癌农杆菌Ti质粒是最常用的一种载体。研究最多的是章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒。在Ti质粒上有一段T区，T-DNA能从该质粒转移到敏感植物的核基因组中。T-DNA边界有25bp正向序列可能接受某种酶识别切割，进而形成环状中间体。此外，Ti质粒上还有一个约50bp的Virlence区，简称Vir区，约有十几个基因，Vir区不在T-DNA内，Vir基因产物是一种跨膜蛋白。可以接受植物信号的诱导而发生构象的改变，成为活性蛋白。其中VirA基因可能是决定Ti宿主范围的基因。根据Vir质粒的基本构造，通常认为由根癌农杆菌介导的外源DNA转移和转化要具备三个因素：位于农杆菌染色体上

15、的Chra和Chrb基因，这两个基因细菌细胞对植物细胞的识别和吸附有关；T-DNA边界序列对于T-DNA整合到植物染色体的过程是必要的；Vir基因的活化可以启动DNA向植物细胞的转移。农杆菌介导的基因转移是双子叶植物中最为广泛而有效的遗传转化体系。23药品试剂MS母液（大量元素，微量元素，铁盐，有机母液）6-BA，IBA（0.1mg/ml）LB（蛋白胨，酵母提取物，氯化钠）卡那霉素（50mg/ml）、头孢霉素（250mg/ml）、羧苄青霉素母液（50mg/ml）琼脂（5g/L）砂糖（20-30g/L）定性滤纸限制性内切酶T4 DNA连接酶凝胶DNA回收试剂盒2.4仪器设备-20冰箱培养皿剪刀镊

16、子三角瓶接种针枪头PCR仪天平研钵和杵子37、65水浴移液枪移液管离心机（转速至少可达5000g）4冰箱水浴锅等2.5植物材料：室外烟草或烟草无菌苗2.6质粒与菌株pBI121, pBS, pUC19，或外源目的基因质粒等。大肠杆菌TG1、DH5等，农杆菌LBA4404、GV3101等2.7实验程序：2.7.1表达载体的构建：将含外源目的基因的质粒与pBS或pUC19用相同的内切酶进行双酶切， 双酶切产物进行电泳， 用试剂盒回收目的条带 目的条带用T4 DNA连接酶，在16下进行连接。连接体系如下: 目的基因片段 5LpBS或pUC19 3.5LT4 DNA ligase buffer(10)

17、 1LT4 DNA ligase 0.5LTotal volume 10L连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR筛选出阳性重组质粒。 阳性重组质粒与pBI121用相同的内切酶进行双酶切； 电泳回收相应的目的片段； 目的条带用T4 DNA连接酶，在16下进行连接。连接体系同上。 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR筛选出阳性重组质粒。 提取重组质粒DNA，转化农杆菌感受态细胞(液氮冻融直接转入法)，PCR检测获得重组子。 重组子可直接用于基因转化研究，也可加入30%40%无菌甘油于-76保存备用2.7.2无菌材料的准备：叶片、茎段等均可作受体材料，有两种来源。 取自无菌试管苗(本实验采

18、用无菌苗) 取自田间或温室栽培植株(需消毒处理，同组织培养) 2.7.3受体材料的预培养： 再生培养基的配制: 烟草叶片再生培养基的配制MS+6-BA1.0mg/l+IBA 0.1mg，铺板。准备灭过菌的培养皿、剪刀镊子等。 预培养：取烟草无菌苗的幼嫩叶片用剪刀间隔0.5 cm结果叶片中脉(保持剪后叶片不断裂以便下一步侵染)，在再生培养基中预培养1-2天，待切口处刚刚开始膨大时即可进行能杆菌侵染。 2.7.4 农杆菌培养： 农杆菌的活化：从-20度冰箱里取出保存的农杆菌，在无菌操作台上吸取少量放入LB液体培养基中或者划线培养，挑取单菌落接种到液体LB培养基中，加入50mg/l的Kan，200r

19、pm，28摇菌过夜。需准备的物品及试剂：LB液体培养基、灭菌的三角瓶(50-100ml)、灭菌的枪头。 农杆菌的稀释及二次摇菌：农杆菌培养物稀释到液体MS培养基中；二次摇菌需6-10小时, OD600为0.20.5时可用于转化。需准备的物品及试剂：灭菌的三角瓶、枪头、2ml的离心管。 2.7.5 侵染： 于超净台上将经预培养的烟草叶片在农杆菌稀释液中浸3 min, 用灭菌的滤纸吸去多余菌液后, 继续放置在原来的培养基中。2.7.6共培养(暗培养)： 9 25条件下暗培养，共培养2-4天，待叶片周围有白色菌产生.。 2.7.7选择培养： 将共培养的叶片转移至烟草再生培养基并附加500 mg/L羧

20、苄青霉素或者250mg/L头孢霉素、50 mg/L卡那霉素。转移至光下在16 h白天、8 h黑夜的光周期和25条件下选择培养。(观察拍照) 2.7.8继代培养: 选择培养23周后，将分化的抗性不定芽转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养。2.7.9生根培养： 将生长至长1 cm以上的小苗转移到含300 mg/L羧苄青霉素、30 mg/L卡那霉素的固体MS培养基上诱导生根. 约2-3周后可见根的形成, 从而得到再生完整植株.筛选。生根培养基为1/2MS无激素培养基附加500mg/l的头孢霉素+ 100mg/l 卡那霉素。(观察拍照) 27.10移栽： 待这些完整植株生长到大约5 cm时，并具有完

21、整的根系后，移栽到花盆中， 使之在温室中继续生长。Part III 转基因植株的检测 一、 gus (- 葡萄糖苷酸酶基因)的检测(组织化学定位染色法) 实验目的： 通过组织化学定位染色对转基因植株进行GUS活性检测。 实验原理： gus来源于大肠杆菌染色体的uidA位点。在一定条件下与X-glucuionic acid (5-bromo -4chloro-3indoyl-D-glucuronic acid)底物发生作用，发生蓝色沉淀反应，可以直接观察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点。试剂: n X-Gluc染色液的配制： 母液浓度 加入体积 终浓度 0.2M Na2HPO4/NaH2PO4(p

22、H7.0) 50ml 100mM 0.5M EDTA(pH7.0) 0.2ml 1mM 铁氰化钾 0.0164g 0.05mM 亚铁氰化钾 0.0212g 0.05mM Triton X-100 0.1ml 0.1% 无菌水 49.7ml 总体积 100ml 注：121灭菌，母液两周内使用有效，最好现用现配 n X-Gluc反应液： 1mg X-Gluc用20l DMSO（二甲基亚砜）或N，N-二甲酰氨（DMF）溶解后，加4ml染色液母液，所得X-Gluc的浓度为2mM n 一般固定液： 1甲醛，50mM磷酸钠缓冲液，0.05 Triton X-100(Tween-20)n 原生质体固定液 1

23、甲醛，0.30.6M甘露醇， 10mM MES(甲基乙烷磺酸)pH5.6 n FAA固定液： 5%甲醛， 5%乙酸， 5%乙醇二、实验程序： 2.1材料的准备： n 瞬时表达检测取侵染后15 d的材料，稳定表达检测取转化后处理6周后的材料 n 叶片、幼根等制成徒手切片(小块、小片) n 悬浮细胞、原生质体低速离心收集，用无菌水等渗液洗涤 n 清洁的愈伤组织可直接使用 2.2染色： n 直接染色法： 将准备好的试材浸泡在染液中，于2537 C 保温1hr至过夜； 叶片等绿色材料转入70乙醇中脱色23次，至阴性对照材料呈白色； 肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。实验结果拍

24、照记录。 n 固定染色法： 将材料浸入固定液，必要时抽真空1min, 室温下轻摇3060min; 取出材料，用磷酸钠缓冲液漂洗34次； 将试材放入1.5ml无菌离心管中，加入染色液，浸没材料，盖上管盖，于37 C 水浴中保温几分钟至过夜; 取出材料，用75的乙醇漂洗，或放入FAA固定液中处理20min; 先后用20、50乙醇各浸泡20min以上； 显微镜下观察，白色背景上的蓝色斑点即为GUS表 显微镜下观察，白色背景上的蓝色斑点即为GUS表达位点；实验结果拍照记录。 染色后的材料可浸入含80乙醇的FAA固定液中保存。 2.3注意事项： 实验要设阴性对照，阴性对照应无蓝色出现，如产生蓝色即为本底

25、。其原因可能有：a.试材或试剂的污染，尤其是材料的内生菌；b染色时间过长，时间越长，假阳性率增加。 在需要进行较长时间染色时染色液中应加入0.02NaN3或100 mg/ml的氯霉素，以便抑制细菌生长，减少本底。 叶绿素含量高的试材染色后一定要进行脱色 含多酚、木质素多的试材染色过程中会发生褐化，样品呈现褐色而掩盖GUS着色。可将染色后的材料放到75乳酸水溶液中，在1磅压力下加热15min，此法对烟草、马铃薯有效。三、转基因植株的PCR检测 3.1实验目的： 3.1.1快速提取转基因植株的基因组DNA。 3.1.2通过PCR反应对基因转化植株进行快速检测。 实验原理: 依据PCR原理，通过基因

26、特异引物对转基因植株中外源目的基因进行特异扩增，从而判断是否为转基因植株。 实验试剂、药品: 液氮 1CTAB缓冲液：50mmol/L Tris-HCl pH8,0.7mol/L NaCl,10mmol/L EDTA pH8 ,1% CTAB,20mmol/L 2 巯基乙醇（用前加入） 氯仿/异戊醇 （24：1）RNase A ：2000 U/ml，用0.15mol/L NaCl，0.015mol/L 柠檬酸三钠配成10mg/ml；使用前100热处理15min除去残留的DNase活性 异丙醇 无水乙醇，3mol/L乙酸钠 70%乙醇 TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA pH8 PCR引物及反应试剂等。 仪器设备： PCR仪 电泳设备 离心机 凝胶摄像仪 水浴锅 天平 研钵和杵子37、65水浴移液枪 离心管、枪头等各种耗材 植物材料： 转基因植株、对照植株 实验程序： 1.转化植株的DNA的分离(CTAB法) 取0