医学基础免疫学实验指导

1、医学基础免疫学实验指导主编金伯泉 李恩善免疫血清的制备淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术免疫球蛋白纯化技术盐析法纯化免疫球蛋白DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白SPA-Sepharose CL-4B 亲和层析纯化IgG及IgG亚类高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体单克隆抗体亲和层析柱纯化重组人2a干扰素(rHuIFN-2a)免疫球蛋白标记技术酶标记抗体荧光素标记抗体技术125I标记单克隆抗体技术标记抗体的应用ELISABA-ELISA免疫斑点试验化学发光免疫分析125I标记单克隆抗体竞争结合试验细胞分离纯化技术Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞Percoll不连续

2、密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞溶血空斑形成试验细胞表面标记的检测技术碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)免疫组化染色技术检测淋巴细胞表面标记活细胞免疫荧光技术流式细胞仪标本的制备淋巴细胞增殖功能的测定人脐带静脉内皮细胞的分离培养与增殖试验杀伤细胞功能的检测自然杀伤细胞(NK)和淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的杀伤功能混合淋巴细胞培养细胞因子生物学活性的检测白细胞介素-1生物学活性检测Con A 刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性应用EL-4、CTLL检测IL-1生物学活性白细胞介素-2生物学活性检测白细胞介素-6生物学活性检测干扰素生物学活性检测肿瘤坏死因子-生物学活性检测细

3、胞因子及其受体的免疫学方法检测夹心法ELISA检测人可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)夹心法ELISA检测人白细胞介素8(IL-8)夹心法ELISA检测人2a、2b干扰素(IFN-2a、2b)免疫血清的制备撰稿李恩善免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂(如用于制备免疫标记抗体等)，也可供特异性免疫治疗用。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯

4、度。因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。原理免疫方法放血分离血清结果鉴定材料注意事项一、原理具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物(即多克隆抗体)。另外，抗体的产生具有回忆应答的规律性，牨m现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。二、免疫方法根据抗原的性质不

5、同而异。下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。3.第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧 窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧窝及鼠蹊部皮下。4.间隔7-10天后，从耳静脉采血0.51.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到116以上时才

6、能放血。5.若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。三、放血(一)心脏采用血法1.家兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；2.剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；3.用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的

7、部位；4.用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死；5.将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。(二)颈动脉放血法1.家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤；2.沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌；3.分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离；4.于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住；5.用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱

8、；6.松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80100ml。四、分离血清将三角烧瓶的血置37温箱1小时，再置4冰箱内34小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01硫柳汞或0.02叠氮钠，最终浓度)，分装后置4冰箱中保存备用。五、结果鉴定以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关部分。六、材料(一)动物：健康成年家兔，雄性，体重23公斤。(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml

9、)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。(三)试剂1.灭菌生理盐水；2.纯化人IgG(10mgml)；3.消毒酒精及碘酒；4.羊毛脂；5.石蜡油；6.活卡价苗(BCG)(75mgml)；7.弗氏不完全佐剂(FIA)制备：称羊毛脂10克，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中(每瓶10ml)，高压灭菌(8磅20分钟)后保存备用。8.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：将FIA予温(6030分钟)，吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG(75mgml)0.5ml及纯化人IgG2.5ml(2.4mgml)牨_滴入边研磨直至

10、形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。七、注意事项1.免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。2.免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡(频率2900转分，振幅6mm)；后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。3.佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果

11、获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物(0.005mgN)产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠其次是家兔，当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。4.抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下，一次注入的总剂量以0.5mgkg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10倍。另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少

12、次注射。5.免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，同时于两侧肩部(或臂部)和鼠蹊部各注一处。每点注0.2ml，间隔2周后再于上述部位选不同点同上注射，也可产生高效价的免疫血清。淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术撰写刘雪松1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、

13、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。细胞融合前准备细胞融合，选择杂交瘤抗体的检测杂交瘤的克隆化和冻存单克隆抗体的大量生产单克隆抗体的鉴定影响因素、失败原因分析一、细胞融合前准备(一)免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×100.5ml ip (腹腔内注射)23周后第二次免疫1

14、5;100.5ml ip3周后加强免疫(融合前三天)1×100.5ml ip或iv(静脉内注射)取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。初次免疫 Ag150g加福氏完全佐剂皮下多点注射(一般0.81ml0.2ml点)3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip(ip剂量不宜超过0.5ml)3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip (57天后采血测其效价，检测免

15、疫效果)23周后加强免疫，剂量50500g为宜，ip或iv3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。(二)饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作

16、为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLbc小鼠610周龄拉颈处死浸泡于75酒精，消毒35分钟用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌注射器注入68ml培养液反复冲洗，吸出冲洗液放入10ml离心管，1200转分离心56分钟用20小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10ml加入96孔板，100l孔放入37CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得58×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106ml，小鼠脾细胞为

17、1×106ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105ml，均为100l孔。(三)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 Ag8.653等。骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在1020，细胞的最大密度不得超10ml，一般扩大培养以110稀释传代，每35天传代一次。细胞的倍增时间为1620小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在准备融合前的两周就

18、应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每36月应用8AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95，也是决定细胞融合的关键。(四)免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的倍，细胞数为×10左右。二、细胞融合，选择杂交瘤(一)细

19、胞融合流程(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP20，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按110或15的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。(6)在室温下融合:30秒内加入预热的1ml45PEG(Merek,分子量4000)含5DMSO，边加边搅拌。作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。加预热的

20、不完全培养液，终止PEG作用，每隔分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。(7)离心，800rpm，6分钟。(8)弃上清，先用6ml左右20小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。(9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。(10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100l孔，37、5CO2孵箱培养。一般一块96孔板含有1×107脾细胞。(二)HAT选择杂交瘤应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。一般

21、在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20小牛血清完全培养液中。因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200l孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的23进行选择，可得到满意的筛选结果。50×HATH:5×10-3MA:2×10-5MT:8×10-4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般

22、在杂交瘤细胞布满孔底110面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。3.FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。4.IFA用于细胞和病毒McAb的检测。上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指

23、将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。(一)克隆化方案用克隆化的方法很

24、多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。1.有限稀释法的程序制备饲养细胞悬液(同融合前准备)阳性孔细胞的计数，并调细胞数在15×10ml取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞ml，100l孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个ml，100l孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个ml，100l孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。培养45天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200l孔。第89天时，肉眼可见细胞

25、克隆，及时进行抗体检测。注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。2.软琼脂法软琼脂的配制含20FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI16401琼脂水溶液：高压灭菌，42预热。0.5琼脂：由1份1琼脂加1份含20小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42保温。用上述0.5琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。按100ml，500ml或5000ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。1ml 0.5琼脂液(42预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37，5C

26、O2孵箱中。45天后即可见针尖大小白色克隆，710天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。(二)杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。细胞冻存液

27、:50小牛血清40不完全培养液10DMSO(二甲亚砜)冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0，再降温时一般按每分钟降温23，待降至-70可放入液氮中。或细胞管降至0 后放-70超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。五、单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为1060gml，如果大量生产，费用较高。2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。实体瘤法对数生长期

28、的杂交瘤细胞按13×107ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml, 共24点。待肿瘤达到一定大小后(一般1020天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mgml。但采血量有限。腹水的制备常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLbc鼠，12周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目

29、前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。六、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:1.抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。2.McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般

30、在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG(3)，将有利于沉淀线的形成。3.McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。4.McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原

31、位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。5.McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。七、影响因素、失败原因分析由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。其主要失败原因和影响因素有:1.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理

32、。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALBc小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。2.融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素PEG有毒性或作用时间过长。牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。骨髓瘤细胞污染了支原体。HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，

33、或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。三要:要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要定期进行再克隆。三不要:不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。4.杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆

34、化，应在培养液加HT。免疫球蛋白纯化技术撰稿金伯泉朱勇欧阳笑梅在大多数情况下，免疫血清、杂交瘤细胞培养上清以及腹水中的抗体需经纯化后再用于各种免疫学检测中去。免疫球蛋白常用的纯化方法有盐析法、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析以及高效液相色谱等方法。这些方法各有优缺点，应根据抗体的特点、纯度要求和实验室具体条件加以选择。盐析法纯化免疫球蛋白DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白SPA-Sepharose CL-4B 亲和层析纯化IgG及IgG亚类高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体单克隆抗体亲和层析柱纯化重组人2a干扰素(rHuIFN-2a)盐析法纯化免疫球蛋白撰稿欧阳笑梅原理

35、主要材料盐析的操作步骤影响盐析的因素(一)原理蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。(二)主要材料1.试剂:(1)正常人混合血清；灭菌生理盐水。(2)饱和硫酸铵溶液的配制:称(NH4)2SO4(AR)400425克，以5080之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水(15NNH4

36、OH)调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。(3)萘氏试剂配制：称HgI11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20NaOH 50ml。(4)0.02M, PH7.4磷酸盐缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline PBS)配制:贮存液:A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml；B液: 0.2M NaH2P4：NaH2P4·2HO 3.12克，加蒸馏水至1000ml；应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。(5)0.1M, PH7.4

37、磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer PB)配制:将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。(6)20磺基水杨酸。2.器材:普通冰箱、离心机、电磁搅拌器，751桮型紫外分光光度计、扭力天平，粗天平。透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密PH试纸(PH5.59.0)、眼科镊子、小剪刀。烧杯、量筒、吸管、滴管、灭菌小瓶、试管等。(三)盐析的操作步骤取正常人混合血清加等量生理盐水，于搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和硫酸铵终浓度为50饱和(NH4)2SO44，3小时以上，使其充分沉淀离心(3000rpm), 20分钟，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至Xml。再逐滴加饱和硫酸铵/ml

38、置4，3小时以上此时(NH4）2SO4的饱和度为33)重复上述第二步过程1?次。将末次离心后所得沉淀物以0.02M PH7.4 PBS溶解至Xml装入透析袋。对PBS充分透析、除盐换液3次，至萘氏试剂测透析外液为无黄色将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以751-G紫外分光光计测蛋白含量。方法如下:蛋白含量(mgml)(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×样品稀释度。注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。(四)影响盐析的因素1.蛋白质的浓度：盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋

39、白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。2.离子强度:各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33时球蛋白析出。3.盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。4.PH值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。5.温度：盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于25时较0更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。6.蛋白质沉淀后宜在4放

40、3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白撰稿欧阳笑梅原理试剂和器材操作步骤注意事项(一)原理DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH将CL-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的球蛋白属于中性蛋白(等电点为PH6.857.5)，其余均属酸性蛋白。在PH7.27.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。DEAE-sephadexA

41、-50柱层析是离子交换层析的一种。(二)试剂和器材1、试剂:(1)盐析提取的人球蛋白；(2)0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10NaN3；(3)DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇(PEG)；(4)0.1M, PH7.4 PB(配制见盐析部分)；2、器材:(1)层析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定铁架，自由夹，螺旋夹，尼龙纱(200目)；(2)普通冰箱，751桮型紫外分光光度计，电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶)，PH计；(3)透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸；(4)量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等。(三) 操

42、作步骤1、DEAE-Sephadex A-50预处理称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5克，悬于500ml蒸馏水，1小时后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5N NaOH中，搅匀，静置30分钟，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性；再以0.5N HCl同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB中过夜。2、装柱(1)将层析柱垂直固定于滴定铁架上，柱底垫一园尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。(2)将0.1M，PH7.4 PB

43、沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。待A-50凝胶沉降2-3cm厚时，启开出水口螺旋夹，控制流速1ml/分钟，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。(3)关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一园形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。3、平衡:启开出水口螺旋夹，控制流速12-14滴/分钟，使约2倍床体积的洗脱液流出。并以PH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH值与离子强度是否相同。达到一致时关闭出水口，停止平衡。4、加样及洗脱:启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱

44、面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积的2，蛋白浓度以<100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2-3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数ml洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速1214滴分钟。5.收集：开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集35ml。共收集1015管。6.测蛋白：以751-G型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm，与OD260nm，按前述公式计算各管蛋白含量。并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。7.

45、合并、浓缩：将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG(MW6000)洗缩至所需体积，加入0.02NaN防腐剂，于4保存备用。8.A-50凝胶的再生:在柱上先以2M NaCl洗柱上的杂蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中保存；近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50温箱烘干，装瓶内保存。(四)注意事项1.柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就得获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使液体流动的不均匀性增加，分辨率明显

46、下降。2.纯化过程必须严格控制脱缓冲液的PH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。3.所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。4.洗脱过程中应严格控制流速，且勿过快。5.上样的体积要小，浓度不宜过高。6.加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。Sepharose CL-4B亲和柱层析纯化IgG及IgG亚类撰稿金伯泉欧阳笑梅原理操作步骤试剂器材注意事项 (一)原理葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变PH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B柱上的

47、IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。(二)操作步骤用0.1M PH8.0 磷酸缓冲液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)装柱后用0.1M PH8.0磷酸缓冲液平衡标本可用硫酸铵粗提物，先10,000g离心除去杂质，必要时用0.22m滤膜过滤。上样前用1M PH9.0 Tris液调整标本液PH至8.1或对平衡液透析过夜加样，一般按2530mgIgGg湿胶比例加样，室温作用15min,0.1M PH8.0磷酸缓冲液充分淋洗至淋洗液OD值为<0.02。用不同PH的枸椽

48、酸洗脱液洗脱，流速20mlh。如纯化小鼠IgG1一般用PH6.0；纯化IgG2a用PH4.0；纯化IgG2b用0.1M PH3.0醋酸盐缓冲液或0.1M PH3.0 Glycine-HCl缓冲液洗脱。用PH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定(三)试剂器材1.SPA-Sepharose CL-4B(pharmacia)2.磷酸缓冲液0.1M PH8.00.02 NaN3.枸椽酸缓冲液0.1M PH6.00.1M PH4.00.02 NaN30.1M PH3.04.1M PH9.0 Tris溶液

49、5.再生缓冲液(1) 0.1M Tris含0.5M NaCl调正PH至8.50.02NaN3；(2) 0.1M醋酸钠含0.5M NaCl调正PH至4.50.02NaN3。6.110ml柱体积的玻璃柱或塑料柱(四)注意事项1.SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用1020次左右。方法:先用10倍柱体积0.1M PH8.5 Tris含0.5M NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1M PH4.5醋酸钠缓冲液含0.5M NaCl液洗脱柱上残存的杂蛋白；0.1M PH8.0磷酸缓冲液平衡，4贮存。2.SPA-Sepharose CL-4B亲和层析法还可用

50、于:(1)除去抗体液中IgG，检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性；(2)除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段； (3)回收或纯化免疫复合物。3.、狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体撰稿金伯泉从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等。应用TSKDEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物学活性。原理操作步骤试剂和器材注意事项(一)原理根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAb球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗

51、脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。(二)操作步骤腹水10,000g离心10min，除去细胞和杂质，在4条件下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40饱和硫酸铵搅拌2030min离心，沉淀用40饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A(PH8.5 20mM Tris缓冲液)透析除盐4过夜用带有1000l样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK DEAE SPW离子交换层析柱洗脱流速1mlmin01min：05缓冲液B(20mM Tris, PH8.5, 含2.0M醋酸钠)120min(线性梯度洗脱)：520缓冲液B2022min：200缓冲液B洗脱液用紫外280nm进行监测收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定(三)试剂和器材1. TSK DEAE SPW离子交换层析柱(75×7.5mm, Bio Rad)2.高效液相色谱仪(包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统)。3.PBS，缓冲液A和B(四)注意事项1.所用缓冲液和加样粗提物均需0.22m滤膜过滤。2.在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始1112min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb的存留时间(retention time)有所差异。单克隆抗体(McAb)亲和层析柱纯化重组人2a干扰素(rHuIFN-2a)