第三章蛋白质研究技术

1、第三章第三章 蛋白质研究技术蛋白质研究技术第一节第一节 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化第二节第二节 蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定第三节第三节 蛋白质的检测蛋白质的检测第四节第四节 蛋白质的结构分析蛋白质的结构分析第一节第一节 蛋白质的分离与纯化蛋白质的分离与纯化 一、蛋白质分离纯化的基本原则一、蛋白质分离纯化的基本原则 二、蛋白质分离纯化的方法二、蛋白质分离纯化的方法蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化概图蛋白质分离纯化概图一、蛋白质分离纯化的基本原则一、蛋白质分离纯化的基本原则1 1、选择丰度高、便于提取的材料、选择丰度高、便于提取的材料 （磷酸单脂酶（磷酸单脂酶, ,肝、胰、脾丰富，但

2、选几乎不含磷酸二脂酶的前列腺）肝、胰、脾丰富，但选几乎不含磷酸二脂酶的前列腺）2 2、了解目的蛋白质的稳定性、了解目的蛋白质的稳定性 （肝素材料的冷冻和干燥）（肝素材料的冷冻和干燥）3 3、探索有效的抽提和浓缩方法、探索有效的抽提和浓缩方法 ( (包括细胞破碎，抽提系统，浓缩：沉淀、吸附、超滤、透析、冻干等包括细胞破碎，抽提系统，浓缩：沉淀、吸附、超滤、透析、冻干等) )4 4、建立一套层析组合方法和检测方法、建立一套层析组合方法和检测方法（如吸附、离子交换、亲和层析、凝胶过滤；纯化评价）（如吸附、离子交换、亲和层析、凝胶过滤；纯化评价）5 5、包装、包装、方法方法二、蛋白质分离纯化的方法二、

3、蛋白质分离纯化的方法粗提：粗提： 1.1.盐析盐析: : 固体加入法：固体加入法： 饱和溶液加入法饱和溶液加入法: : 2. 2.有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀: : 3. 3.结晶结晶（10-50mg/ml10-50mg/ml） 4.4.等电点沉淀等电点沉淀精提精提 ：1.1.离心（离心（centrifugationcentrifugation） 2.2.电泳（电泳（electrophoresiselectrophoresis） 3.3.层析（层析（chromatographychromatography）注：注：S1:S1:原饱和度；原饱和度；S2S2：预期饱和度；：预期饱和度；S3S3：加入液

4、饱和度。：加入液饱和度。V V：欲加入体积（：欲加入体积（mlml）；）；V V0 0：原液体积原液体积1.1.离心（离心（centrifugationcentrifugation）原理：原理：悬液中的悬液中的各种粒子（细胞，细胞器及大分子）各种粒子（细胞，细胞器及大分子）有不同有不同质量质量（massmass）或）或密度密度（densitydensity），故在离心场中有不同沉降速率。），故在离心场中有不同沉降速率。 蛋白质蛋白质分子量差别很大，密度差别很小分子量差别很大，密度差别很小（不超过（不超过15% 15% ）。蛋白）。蛋白质的质的平均密度是平均密度是 1.37 g/cm1.37 g

5、/cm3 3。结合蛋白密度差异较大。结合蛋白密度差异较大。沉降系数（沉降系数（sedimentation constantsedimentation constant）：）：颗粒在单位离心力场颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度（中粒子移动的速度（S S）。）。离心（离心（centrifugationcentrifugation）. .差速离心（差速离心（differential centrifugationdifferential centrifugation）. .速率区带离心（速率区带离心（rate-zonal centrifugationrate-zonal centrifugation

6、）. .差速离心（差速离心（differential centrifugationdifferential centrifugation）利用不同物质沉降速率的差异，通过离心速度差异分离不同质利用不同物质沉降速率的差异，通过离心速度差异分离不同质量颗粒的离心技术。量颗粒的离心技术。 从组织匀浆中将可溶性的蛋白质与不从组织匀浆中将可溶性的蛋白质与不溶性成分分开。溶性成分分开。离心后，蛋白质留在上清液离心后，蛋白质留在上清液（SupernatantSupernatant）中，其他成分形成）中，其他成分形成沉淀（沉淀（PelletPellet）细胞成份的细胞成份的差速离心分离差速离心分离离心力离心力

7、时间时间. .速率区带离心（速率区带离心（rate-zonalrate-zonalcentrifugationcentrifugation）也称也称平衡密度梯度离心，根据颗粒在介质中的沉降速度平衡密度梯度离心，根据颗粒在介质中的沉降速度差异分离目标颗粒的方法。差异分离目标颗粒的方法。蔗糖、甘油或氯化铯形成密度梯度；蔗糖、甘油或氯化铯形成密度梯度；超速离心机（超速离心机（40,000 r/min40,000 r/min）离心后，离心后，分离物分布在相应的密度区分离物分布在相应的密度区带内；带内； 注意：注意：控制时间：太短，不能充分分离；太长，分离物沉淀到离心控制时间：太短，不能充分分离；太长，

8、分离物沉淀到离心管底部。管底部。不能精确测定分子量，因为蛋白质的不能精确测定分子量，因为蛋白质的 形状差异影响沉降率；形状差异影响沉降率；一次分离多种不同类型聚合物或颗粒一次分离多种不同类型聚合物或颗粒 的最有效方法的最有效方法多用于分离细胞器，多用于分离细胞器，2. 2. 电泳（电泳（electrophoresiselectrophoresis） 带电颗粒在电场中的移动速度的差异带电颗粒在电场中的移动速度的差异, ,从而将其分离。由电荷从而将其分离。由电荷质量比决定。质量比决定。按支持物按支持物: :移动界面电泳移动界面电泳, ,聚焦电泳聚焦电泳, ,区带电泳（凝胶、线丝）等区带电泳（凝胶、

9、线丝）等按电泳装置按电泳装置: :水平平板水平平板, ,垂直平板垂直平板, ,圆盘圆盘, ,双向电泳双向电泳, ,毛细管电泳，毛细管电泳， 脉冲电泳。脉冲电泳。SDS SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamideSDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel electrophoresis，SDS-PAGESDS-PAGE）等电聚焦（等电聚焦（isoelectric focusing isoelectric focusing ，IEF IEF ）双向电泳（双向电泳（two-dimensional gel electr

10、ophoresistwo-dimensional gel electrophoresis）脉冲电泳（脉冲电泳（pulsed-field gel electrophoresispulsed-field gel electrophoresis）常用的电泳方法常用的电泳方法.SDS .SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-SDS-polyacrylamide gel electrophoresispolyacrylamide gel electrophoresis，PAGEPAGE）凝胶凝胶丙烯酰胺（丙烯酰胺（acracrylamideylamide），甲叉双丙烯酰胺（），甲叉双丙

11、烯酰胺（methylenemethylenebisbisacrylamideacrylamide）聚合而成；）聚合而成；T%= (a:T%= (a:单体单体g;b:g;b:双体双体g;g; m: m:溶液体积溶液体积) )凝胶孔径：选择丙烯酰胺浓度，甲叉双丙烯酰胺胶联剂的浓凝胶孔径：选择丙烯酰胺浓度，甲叉双丙烯酰胺胶联剂的浓度；度；C%= (a:b=19:1)C%= (a:b=19:1)凝胶有分子筛效应。凝胶有分子筛效应。a+b m100% b a+b100%acrbisSDS -PAGESDSSDS（sodium dodecyl sulfatesodium dodecyl sulfate）阴

12、离子洗涤剂，几乎能破坏天然蛋白质中所有的非共价键阴离子洗涤剂，几乎能破坏天然蛋白质中所有的非共价键，使，使亚基解聚亚基解聚( (巯基乙醇巯基乙醇) )，使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质构，使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质构形对迁移率（形对迁移率（migration ratemigration rate）的影响；）的影响； SDS SDS以以1:2 1:2 的比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质的比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大量的净负电荷带上大量的净负电荷，而且电荷量与蛋白质分子量（即肽链长，而且电荷量与蛋白质分子量（即肽链长度）成正比。所以度）成正比。所以分子量成为决定

13、蛋白质迁移率的唯一因素。分子量成为决定蛋白质迁移率的唯一因素。SDS -PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE 分离的蛋白分离的蛋白质可以用质可以用 Coomassie Coomassie blue blue 染色，也可银染染色，也可银染（silver stainsilver stain） SDS-PAGE SDS-PAGE 能分离能分离分子分子量差异小于量差异小于 10%10% 的蛋白的蛋白质质用于用于蛋白质纯化和分子蛋白质纯化和分子量近似值测定量近似值测定. .等电聚焦（等电聚焦（isoelectric focusing,IEFisoelectric focusing,IEF）在凝胶

14、上加入一种两性电在凝胶上加入一种两性电解质（解质（ampholyteampholyte），电泳），电泳时会形成连续的时会形成连续的 pH pH 梯度梯度电泳后，各种电泳后，各种蛋白质停留蛋白质停留在与其等电点（在与其等电点（pIpI）相同）相同的位置的位置IEF IEF 能分离能分离 pI pI 值仅相差值仅相差 0.01 0.01 的蛋白质的蛋白质（即一个净（即一个净电单位）电单位）等电聚焦等电聚焦电泳过程中不连续电泳过程中不连续电泳的电泳的三种效应三种效应： 浓缩效应，浓缩效应， 分子筛效应分子筛效应 电荷效应电荷效应. .双向电泳（双向电泳（two-dimensional two-dim

15、ensional gel electrophoresis gel electrophoresis） 分离分子量差异很小的蛋白质分离分子量差异很小的蛋白质 双向电泳双向电泳 = IEF + SDS-PAGE= IEF + SDS-PAGE 第一向：根据电荷差异用第一向：根据电荷差异用IEFIEF分离分离 第二向：根据分子量差异用第二向：根据分子量差异用SDS-PAGESDS-PAGE分离分离双向电泳（双向电泳（two-dimensional gel two-dimensional gel electrophoresiselectrophoresis）IEFSDS-PAGE双向电泳（双向电泳（tw

16、o-dimensional gel two-dimensional gel electrophoresiselectrophoresis）蛋白质可用染色法（银染、考马斯蓝蛋白质可用染色法（银染、考马斯蓝 ）或放射自显影进行）或放射自显影进行检测；斑点挖取做质谱鉴定。检测；斑点挖取做质谱鉴定。. .脉冲电泳（脉冲电泳（pulsed-field gel pulsed-field gel electrophoresiselectrophoresis）用于分离大片段用于分离大片段 DNADNA（20 kb-10 Mb20 kb-10 Mb）在电场中，大片段在电场中，大片段 DNA DNA 以伸展的方式

17、以伸展的方式 进行移动进行移动断断电后，电后，DNA DNA 分子卷曲成不规则形状。分子卷曲成不规则形状。 DNA DNA 从伸展到卷曲所需要的时间与其长度成正比从伸展到卷曲所需要的时间与其长度成正比然后改变电泳方向然后改变电泳方向 9090或或 180180再次通电如此反复再次通电如此反复进行，逐步把不同大小的进行，逐步把不同大小的 DNA DNA 分开分开3.3.层析（层析（chromatographychromatography） 原理：原理：溶液中的分子能与固体表面进行结合及解离，但溶液中的分子能与固体表面进行结合及解离，但由于蛋白质在分子量、带电性和结合特异性方面的差异，由于蛋白质在

18、分子量、带电性和结合特异性方面的差异，导致与固体表面结合与解离的难易程度不一样，所以流动导致与固体表面结合与解离的难易程度不一样，所以流动的速度也不一样。的速度也不一样。 固定相的性质决定被分离固定相的性质决定被分离蛋白的分离效率蛋白的分离效率流动相流动相固定相固定相凝胶类型及型号与蛋白质分子量凝胶类型及型号与蛋白质分子量葡聚糖与多孔琼葡聚糖与多孔琼脂糖珠共价交联脂糖珠共价交联（吸水量是型号（吸水量是型号1/101/10）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 丙烯葡聚糖凝胶丙烯葡聚糖凝胶 层析（层析（chromatographychromatography）. .凝胶过滤层析（凝胶过滤层析（gel filtr

19、ation gel filtration chromatography chromatography ） . .离子交换层析（离子交换层析（ion-exchangeion-exchange chromatography chromatography）. .亲和层析（亲和层析（affinity affinity chromatography chromatography） . . 凝胶过滤层析（凝胶过滤层析（gel filtration gel filtration chromatography chromatography ） 分离分子量有差异的蛋白质；分离分子量有差异的蛋白质；多孔小珠由聚丙

20、烯酰胺（多孔小珠由聚丙烯酰胺（ polyacrylamidepolyacrylamide）、葡聚糖）、葡聚糖（dextrandextran）或琼脂糖（）或琼脂糖（agaroseagarose）组成；）组成；葡聚糖颗粒葡聚糖颗粒大分子大分子 小分子小分子凝胶过滤层析凝胶过滤层析小分子进入颗粒凝胶内部，而小分子进入颗粒凝胶内部，而大分子被排阻在外大分子被排阻在外，因此小分子，因此小分子在层析柱中流动速度慢，从而把在层析柱中流动速度慢，从而把混合物按不同分子量分开混合物按不同分子量分开可根据洗脱体积（可根据洗脱体积（elution elution volumevolume）估计蛋白质分子量估计蛋白质

21、分子量，分，分子量大子量大 洗脱体积小。洗脱体积小。 基本原理基本原理 凝胶上柱后，颗粒外的外水体积（凝胶上柱后，颗粒外的外水体积（VoVo），颗粒内体积称），颗粒内体积称内水体积（内水体积（ViVi），颗粒中胶的体积（），颗粒中胶的体积（VgVg），因而，总的柱），因而，总的柱床体积（床体积（VtVt），），Vt=Vo+Vi+VgVt=Vo+Vi+Vg，VgVg可忽略。可忽略。Vt=Vo+ViVt=Vo+Vi 。 当进行洗脱时，某一溶质当进行洗脱时，某一溶质的洗脱体积（的洗脱体积（VeVe）就取决于）就取决于VoVo，ViVi和在两相中的分配系和在两相中的分配系数（数（kdkd） Ve=Vo

22、+kdViVe=Vo+kdVi 当当kd=0kd=0时时, ,Ve=VoVe=Vo，溶质全从，溶质全从VoVo 出来，无分配。出来，无分配。当当kd=1kd=1时时, ,Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi, ,溶质全进溶质全进 筛子，各物质尽管有分配，但筛子，各物质尽管有分配，但 各物质不能分开。各物质不能分开。当当0kd10kdCMCCMC）时，与磷脂、膜蛋白一起）时，与磷脂、膜蛋白一起形成微团形成微团. . 低浓度低浓度（CMCCMC）时，虽然不形成微团，但仍能与大部）时，虽然不形成微团，但仍能与大部 分膜蛋白的疏水区结合，起分膜蛋白的疏水区结合，起增溶作用增溶作用. .大部分大部分膜周边蛋

23、白膜周边蛋白（peripheral proteinperipheral protein）是）是可溶性。可溶性。它们借离子键或其他弱键与特定的膜它们借离子键或其他弱键与特定的膜蛋白结合，因此可用高浓度的盐或能与二价阳蛋白结合，因此可用高浓度的盐或能与二价阳离子（如离子（如 C Ca a2+2+）结合的试剂进行分离。）结合的试剂进行分离。开发既保持开发既保持膜蛋白的天然结构，又高产和高纯膜蛋白的天然结构，又高产和高纯度纯化方法度纯化方法是人们的期待。（是人们的期待。（NovagenNovagen新开发新开发TM-PEK:TM-PEK:ProteoExtractProteoExtract膜蛋白抽提试

24、剂盒膜蛋白抽提试剂盒）第二节第二节 蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定一、分子量测定一、分子量测定二、等电点测定二、等电点测定三、末端氨基酸残基测定三、末端氨基酸残基测定四、蛋白质分子中的糖链四、蛋白质分子中的糖链五、蛋白质分子中的脂五、蛋白质分子中的脂一、分子量测定一、分子量测定. .渗透压（渗透压（osmotic pressureosmotic pressure）. .沉降平衡（沉降平衡（sedimentation equilibriumsedimentation equilibrium）. .凝胶过滤层析（凝胶过滤层析（gel fitration gel fitration chromatogra

25、phychromatography）.SDS-PAGE.SDS-PAGE. .激光解吸电离飞行时间质谱（激光解吸电离飞行时间质谱（LDI-TOF-MSLDI-TOF-MS）1.1.渗透压（渗透压（osmotic pressureosmotic pressure）同时测定几个不同浓度的渗透压，以同时测定几个不同浓度的渗透压，以/c/c对对c c作图并外推到蛋白作图并外推到蛋白质浓度为零质浓度为零, ,得截距得截距, ,从而求出从而求出M M。为为避免避免pHpH值的影响值的影响, ,在溶解度允许的范围内在溶解度允许的范围内, ,尽量尽量采用等电点或采用等电点或接近等电点的缓冲液接近等电点的缓冲液

26、，并增加溶液中无机盐的浓度。，并增加溶液中无机盐的浓度。可以测分子量在可以测分子量在1 11010万范围的蛋白质万范围的蛋白质。实验装置简单，准确度高。但实验装置简单，准确度高。但不能区别溶液中蛋白质分子是否不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。均一。2. 2. 沉降平衡（沉降平衡（sedimentation sedimentation equilibriumequilibrium）用较低的速度离心（用较低的速度离心（8,000-20,000 r/min8,000-20,000 r/min）离心开始后，颗粒发生沉降，造成浓度梯度，同时产生离心开始后，颗粒发生沉降，造成浓度梯度，同时产生扩散作用。扩

27、散作用。扩散力与离心力作用方向相反，相互平衡扩散力与离心力作用方向相反，相互平衡公式公式：3.3.凝胶过滤层析（凝胶过滤层析（gel fitration gel fitration chromatographychromatography） 公式：公式：log log M M = = K K1 1- -K K2 2V Ve e V Ve e：洗脱体积：洗脱体积先测出先测出几种标准蛋白质的几种标准蛋白质的V Ve e ，以它，以它们的们的 log log M M 对对 V Ve e 作图作图得一直线，得一直线，再测出待测样品的再测出待测样品的 V Ve e ，即可从图，即可从图中确定蛋白质的分子

28、量中确定蛋白质的分子量. .样品可以是不纯的。只要它具有专样品可以是不纯的。只要它具有专一的生物活性（或标准样），借助一的生物活性（或标准样），借助活性找出洗脱峰位置，确定它的洗活性找出洗脱峰位置，确定它的洗脱体积就能测定它的分子量脱体积就能测定它的分子量. .4. SDS-PAGE公式：公式：loglogM M = = K K1 1- -K K2 2 R R 以几种以几种标准单体蛋白质标准单体蛋白质分子量的分子量的loglogM M 对其对其R R值作图值作图，根据待测样品的根据待测样品的R R ，从标准曲线上查出它的分子量。，从标准曲线上查出它的分子量。SDS-PAGESDS-PAGE用以

29、分析蛋白质的分子量用以分析蛋白质的分子量5. 5. 激光解吸电离飞行时间质谱（激光解吸电离飞行时间质谱（laserlaser desorption ionization-time of flight- desorption ionization-time of flight-massmass spectrometry ,LDI-TOF-MS spectrometry ,LDI-TOF-MS ）高纯度蛋白质与有机酸混合，在高纯度蛋白质与有机酸混合，在靶金属表面干燥靶金属表面干燥. .激光射线使蛋白质离子化，激光射线使蛋白质离子化，离子经加速后，飞入自由漂移区，离子经加速后，飞入自由漂移区，最后到

30、达检测器。最后到达检测器。飞行时间与分子量成反比，与电量成正比飞行时间与分子量成反比，与电量成正比。可测定可测定1010-15 -15 -2-210105 5 的蛋白质，误差仅为的蛋白质，误差仅为 0.00010.0001。二、等电点测定二、等电点测定溶解度法溶解度法 等电聚焦（等电聚焦（IEFIEF） IEF IEF 原理原理IEF IEF 测测 pIpI三、末端氨基酸残基测定三、末端氨基酸残基测定 用于未知蛋白质一级结构研究和基因工用于未知蛋白质一级结构研究和基因工程表达产物的末端分析程表达产物的末端分析 N-terminus N-terminus 氨基酸残基测定氨基酸残基测定 C-ter

31、minus C-terminus 氨基酸残基测定氨基酸残基测定N-terminus N-terminus 氨基酸残基测定氨基酸残基测定化学法化学法二硝基氟苯法二硝基氟苯法（Sanger reaction） （DNFB+DNFB+肽肽DNP-DNP-肽肽 ）丹磺酰氯法（丹磺酰氯法（DNS-ClDNS-Cl）异硫氰酸苯酯法（异硫氰酸苯酯法（EdmanEdman降解法）（氨基末端（氨基末端苯乙内酰硫脲衍生物苯乙内酰硫脲衍生物 ）酶法酶法氨肽酶法（氨肽酶法（amino peptidaseamino peptidase）氨基酸层析图谱氨基酸层析图谱C-terminus C-terminus 氨基酸残基测

32、定氨基酸残基测定 化学法化学法 肼解法肼解法（hydrazinolysishydrazinolysis） 无水肼无水肼 100 100 处理，释放处理，释放C C端端aaaa 酶法酶法 羧肽酶法羧肽酶法（carboxypeptidasecarboxypeptidase）选择合适的酶浓度及反应时间选择合适的酶浓度及反应时间, ,得单个得单个C C端端aaaa 四、蛋白质分子中的糖链四、蛋白质分子中的糖链血球凝集反应（植物凝结素）血球凝集反应（植物凝结素）糖蛋白电泳（甲苯胺兰、糖蛋白电泳（甲苯胺兰、R R山兰、山兰、schiffschiff试剂）试剂）糖组分分析（薄层层析、液相色谱、红外分析）糖组

33、分分析（薄层层析、液相色谱、红外分析）五、蛋白质分子中的脂五、蛋白质分子中的脂苏丹黑预染、电泳苏丹黑预染、电泳第三节第三节 蛋白质的检测蛋白质的检测一、一、 抗体检测抗体检测二、二、Western BlottingWestern Blotting三、放射性同位素标记法三、放射性同位素标记法 一、抗体检测一、抗体检测 多抗（多抗（polyclonal antibodiespolyclonal antibodies, , 通常以抗血清的形式存在）是通常以抗血清的形式存在）是指不同种类抗体的混合物，能指不同种类抗体的混合物，能识别抗原分子中的多个抗原决定识别抗原分子中的多个抗原决定簇簇（epitop

34、esepitopes）。）。单抗（单抗（monoclonal antibodiesmonoclonal antibodies）指的是同种抗体，）指的是同种抗体，识别抗原分识别抗原分子中的特定抗原决定簇。子中的特定抗原决定簇。单抗由一定数量的相同细胞产生单抗由一定数量的相同细胞产生。这。这些细胞来源于同一杂交瘤细胞（些细胞来源于同一杂交瘤细胞（hybridoma;hybridoma;脾脾: :瘤细胞融合）。瘤细胞融合）。抗体可以检测抗体可以检测表面只相差一个残基表面只相差一个残基的蛋白质。的蛋白质。借助借助特殊的分析试剂可对蛋白质进行特殊的分析试剂可对蛋白质进行精确定量或定位精确定量或定位（免疫

35、细免疫细胞化学、染色质免疫共沉淀、胞化学、染色质免疫共沉淀、 Western BlotWestern Blot ）。）。抗体检测抗体检测两级抗体：一抗和二抗。两级抗体：一抗和二抗。一抗一抗特异的与抗原结合，特异的与抗原结合，二二抗抗除了与一抗结合外，还带有除了与一抗结合外，还带有检测标记检测标记。检测标记：检测标记：如荧光、放射性、化学发光、显色基团及如荧光、放射性、化学发光、显色基团及酶（如酶（如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶，催化无色物质碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶，催化无色物质生成有色物质）。生成有色物质）。ELISA- enzyme-linked immunosorbent assay EL

36、ISAELISAELISA 结果结果二、二、Western BlottingWestern Blotting 灵敏度高，用于检测极微量的蛋白质灵敏度高，用于检测极微量的蛋白质（Find a needle in a hastack .Find a needle in a hastack .大海捞针）大海捞针） 与与SDS-PAGESDS-PAGE、antibodyantibody、enzymeenzyme联合使用联合使用 Western Blotting三、放射性同位素标记法三、放射性同位素标记法放射性同位素的掺入放射性同位素的掺入不影响分子的性质不影响分子的性质。选择合适的同位素：选择合适的同

37、位素：根据实验目的和放射性同位素的特征根据实验目的和放射性同位素的特征（如半衰期、放射产生的能量及能否进入细胞等）进行选择。（如半衰期、放射产生的能量及能否进入细胞等）进行选择。放射自显影：放射自显影：用感光材料进行感光，用感光材料进行感光， 如如 X X光胶片，液体乳胶。然后肉眼光胶片，液体乳胶。然后肉眼 或显微镜观察，可半定量。或显微镜观察，可半定量。定量测定：定量测定：用计数器（用计数器（countercounter），如盖革计数器（），如盖革计数器（Geiger Geiger countercounter）、液闪计数器（）、液闪计数器（scintillation counterscin

38、tillation counter）。）。分析分析生物大分子在细胞内的定位及运动生物大分子在细胞内的定位及运动。第四节第四节 蛋白质的结构分析蛋白质的结构分析一、蛋白质一级结构的测定一、蛋白质一级结构的测定二、已知序列肽链的人工合成二、已知序列肽链的人工合成三、蛋白质构象的确定三、蛋白质构象的确定一、一、 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 Edmam Edmam 降解法（降解法（PTHPTH法）法）N N末端氨基末端氨基与与苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯(PITC)(PITC)在弱碱性条件下在弱碱性条件下, ,形成相应形成相应的的苯氨基硫甲酰衍生物苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用

39、，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环发生环化化，生成相应的，生成相应的苯乙内酰硫脲苯乙内酰硫脲(PTH)(PTH)AA,AA,而从肽链上降解而从肽链上降解, ,产产物可用气物可用气- -液色谱法进行分离鉴定。液色谱法进行分离鉴定。 HPLC HPLC 分析氨基酸分析氨基酸二、已知序列肽链的人工合成二、已知序列肽链的人工合成人工合成肽：人工合成肽：结构分析、抗体制备、活性肽功能、新蛋白研究。结构分析、抗体制备、活性肽功能、新蛋白研究。 抗体制备：抗体制备：在动物体内，在动物体内，10-15 10-15 个残基的小肽能刺激机体产生抗个残基的小肽能刺激机体产生抗 体。从而对蛋白质进行分离、检测及细胞内定

40、位。体。从而对蛋白质进行分离、检测及细胞内定位。新蛋白研究：新蛋白研究：分析末端分析末端AA,AA,反推核苷酸反推核苷酸, ,合成引物合成引物,PCR,PCR获得基因或获得基因或 ORF,BLASTORF,BLAST分析分析, ,同源性比对同源性比对; ;蛋白质特征及功能分析蛋白质特征及功能分析 。tBOC: tBOC: 叔丁氧羰基，叔丁氧羰基，保护氨基酸保护氨基酸 氨基端氨基端. .CFCF3 3COOH: COOH: 三氟乙酸，三氟乙酸，去保护去保护DCC: DCC: 二环己基碳二亚胺，二环己基碳二亚胺，缩合剂缩合剂HF:HF:氢氟酸，氢氟酸，把肽链从聚苯乙烯小把肽链从聚苯乙烯小 株上断裂

41、下来株上断裂下来挂接挂接去保护去保护缩合缩合去保护去保护断裂断裂肽链人工合成肽链人工合成三、三、 蛋白质构象的确定蛋白质构象的确定1.X1.X射线结晶（射线结晶（X-Ray CrystallographyX-Ray Crystallography）2.2.冷冻电镜术（冷冻电镜术（Cryoelectron MicroscopyCryoelectron Microscopy）3.3.核磁共振（核磁共振（Nuclear magnetic resonance, NMRNuclear magnetic resonance, NMR）1.X1.X射线结晶学（射线结晶学（X-Ray CrystallographyX-Ray Crystallography）X X射线波长很短（射线波长很短（0.01-10nm0.01-10nm）。）。单色单色X X射线用于结构分析射线用于结构分析; ;2.2.冷冻电镜术（冷冻电镜术（Cryoelectron Microscop