新技术育种PPT学习教案

1、会计学1菌种选育菌种选育 应用微生物遗传和变异理论应用微生物遗传和变异理论，用人工方法，用人工方法(或自然或自然)造成变异造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程种的过程 。 菌种选育的菌种选育的目的目的是为了不断提高发酵工业产品的产是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。 菌种选育的菌种选育的方向方向是选育是选育“吃粗粮吃粗粮”、耐高温、生长快、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。第1页/共64页自然选育自然选育诱变育种诱

2、变育种杂交育种杂交育种 基因工程育种基因工程育种原生质体融合育种原生质体融合育种菌种选育方法菌种选育方法第2页/共64页（一）自然选育（一）自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。而进行菌种筛选的过程叫自然选育。 自发突变自发突变(spontaneous mutation)，也称自然突变，也称自然突变，指某些指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。着这种突变是没有原因的。 一般认为一般认为引起自然突变有两

3、个原因：引起自然突变有两个原因：（1）多因素低剂量的多因素低剂量的诱变效应；（诱变效应；（2）互变异构效应。）互变异构效应。 （1）多因素低剂量的诱变效应多因素低剂量的诱变效应是指自然突变实际上是由一些原因是指自然突变实际上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如例如充满宇宙空充满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质（如过氧化以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质（如过氧化氢等）氢等）一、遗传育种一、遗传育种第3

4、页/共64页第4页/共64页第5页/共64页自然突变两种情况：自然突变两种情况： 生产上所不希望的：生产上所不希望的：菌种的衰退和生产菌种的衰退和生产 对生产有益的：对生产有益的： 生产性能提高生产性能提高质量下质量下 降降第6页/共64页制备单孢子（单细胞）悬液制备单孢子（单细胞）悬液 适当稀释适当稀释在固体平板上分离在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株自然选育的一般程序：自然选育的一般程序：第7页/共64页 自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止自然选育

5、简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。 自然选育的最大自然选育的最大缺点缺点是效率低、进展慢，很难是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。使生产水平大幅度提高。 第8页/共64页（二）（二） 诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。 诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品诱变

6、育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺。质量、扩大品种和简化生产工艺。 目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，。以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为年开始生产时的效价仅为20U/ml，通过，通过多次诱变育种现已达多次诱变育种现已达50000-100000U/ml。 虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。前广泛使用的育种手段。第9页/共64页 原序列原序列 5-AUG CCU UCA AGA

7、 UGU GGG Met Pro Ser Arg Cys Gly(1)同义突变同义突变 5- AUG CCU UCA AGA UGU GGA Met Pro Ser Arg Cys Gly(2)错义突变错义突变 5- AUG CCU UCA GGA UGU GGA Met Pro Ser Gly Cys Gly(3)无义突变无义突变 5- AUG CCU UCA AGA UGA GGA Met Pro Ser Arg(4)移码突变移码突变 5-AUG CCU UCA AGU GUG GG Met Pro Ser Ser Val 第10页/共64页1 1、诱变育种的诱变剂、诱变育种的诱变剂凡能引

8、起生物体遗传物质发生变异的因素，统称凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂诱变剂。如紫外线、如紫外线、X-射线、射线、 -射线、快中子、超声射线、快中子、超声波等波等 诱变剂诱变剂物理诱变剂物理诱变剂化学诱变剂化学诱变剂生物诱变剂生物诱变剂噬菌体、转座子噬菌体、转座子第11页/共64页2、诱变育种的基本方法、诱变育种的基本方法原始菌株（出发菌株）原始菌株（出发菌株）细胞或孢子悬液制备细胞或孢子悬液制备活细胞计数活细胞计数诱变剂处理诱变剂处理活细胞计数活细胞计数中间培养中间培养突变株分离突变株分离初筛初筛复筛复筛生产性能试验生产性能试验诱变预备处理诱变预备处理诱诱 变变 育育 种种 的

9、的 工工 作作 程程 序序诱变部分诱变部分筛选部分筛选部分第12页/共64页（1 1）、出发菌株的选择）、出发菌株的选择选择时注意以下几点：选择时注意以下几点：1）选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株）选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株。2）最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。）最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。3）采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快，营）采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快，营养要求低等。养要求低等。4）由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏）由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高，故有时可考虑

10、选择已发生其它变异的菌株作为出感性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。发菌株。例如，例如，在金霉素生产菌的诱变中，失去（黄色）色在金霉素生产菌的诱变中，失去（黄色）色素的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。素的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。第13页/共64页（2 2）、单细胞（或单孢子）悬液制备）、单细胞（或单孢子）悬液制备一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理。行诱变处理。？因为因为 1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂 2）可避免长出不纯的菌落。）可避免长出不纯的菌落

11、。 处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态 细胞菌龄一般在细胞菌龄一般在对数期对数期， 霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。用孢子悬浮液。第14页/共64页紫外线紫外线 (Uv) 使用历史较久、廉价、危险性小、效果好，应用较广使用历史较久、廉价、危险性小、效果好，应用较广 对诱变最有效的波长是对诱变最有效的波长是260nm左右左右( 253-265nm) 作用机制作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活生物活性性,造成菌体变异甚至死亡造成菌体变异甚

12、至死亡.诱变剂的选择与剂量确定？诱变剂的选择与剂量确定？（3）、诱变发生的比较）、诱变发生的比较第15页/共64页快中子快中子 中子是不带电荷的粒子，可由回旋加速器、静电减速器或中子是不带电荷的粒子，可由回旋加速器、静电减速器或原子反应堆产生。原子反应堆产生。 中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子，因而快中子的生物学效应几乎完全是由质子造成的出质子，因而快中子的生物学效应几乎完全是由质子造成的。 中子分为快中子和慢中子。快中子的能量为中子分为快中子和慢中子。快中子的能量为0.2-10百万电百万电子伏特，慢中子能量为子伏特，慢

13、中子能量为1/4至至100电子伏特。电子伏特。 慢中子的效应同慢中子的效应同 射线、射线、 射线和电子等照射时引起的基本射线和电子等照射时引起的基本相同，快中子较相同，快中子较X射线、射线、 射线具有较大的电离密度，因而能射线具有较大的电离密度，因而能更多地引起点突变和染色体畸变。更多地引起点突变和染色体畸变。第16页/共64页氮氮 芥芥 氮芥为极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，氮芥为极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一般使用的是其盐酸盐。一般使用的是其盐酸盐。 应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠其作用，释放出氮应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠其作用，释放出氮芥子气，再与细胞起作用而造成

14、变异。芥子气，再与细胞起作用而造成变异。 氮芥的诱变机制氮芥的诱变机制是它能引起染色体畸变。是被使用得是它能引起染色体畸变。是被使用得最早的一种诱变剂。最早的一种诱变剂。第17页/共64页亚硝酸亚硝酸 常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基脱去碱基中的氨基。 亚硝酸亚硝酸A H （次黄嘌呤）（次黄嘌呤）C UG X （黄嘌呤）（黄嘌呤） 亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐继续亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐继续分解放出分解放出NO和和NO2。所以，可在临用前将亚硝酸钠放在。所以，可在临用前将亚硝酸钠放在pH4.5的醋酸缓冲液中

15、，使先生成亚硝酸然后再使用。的醋酸缓冲液中，使先生成亚硝酸然后再使用。第18页/共64页亚硝基胍亚硝基胍 (NTG) 是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变，不经淘是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到汰便可直接得到12%至至80%的营养缺陷型菌株，有超级诱变的营养缺陷型菌株，有超级诱变剂之称。剂之称。 在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因此用在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因此用甲酰胺溶解，可以提高处理浓度。甲酰胺溶解，可以提高处理浓度。 通常在浓度为通常在浓度为30ug/ml、温度为、温度为28C和时间为和时间为60min的条件的条件下进

16、行处理，容易得到高产菌株下进行处理，容易得到高产菌株 。第19页/共64页3 3吖啶类诱变剂吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中可以造成生化代谢途径的完全中断。断。4 4紫外线紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。变。但它可能影响邻近基因的性能。第20页/共64页 剂剂 量量确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题。确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题。 对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增

17、高对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。 目前的处理剂量已从以前采用的死亡率目前的处理剂量已从以前采用的死亡率90-99.9%降低到降低到70-80%，甚至更低的剂量，特别是对于经过一再诱变的高产菌株，甚至更低的剂量，特别是对于经过一再诱变的高产菌株。 剂量似乎也不宜过低，因为在使用高剂量诱变时，除个别剂量似乎也不宜过低，因为在使用高剂量诱变时，除个别核被诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成核被诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成较纯的变异菌落；另外，高

18、剂量可能引起遗传物质的巨大损较纯的变异菌落；另外，高剂量可能引起遗传物质的巨大损伤，产生回复突变少，促使变异后菌株的稳定。伤，产生回复突变少，促使变异后菌株的稳定。 凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。剂量就是合适剂量。 第21页/共64页第22页/共64页第23页/共64页 处处 理理 方方 法法单一诱变剂处理单一诱变剂处理复合处理复合处理1）两种或多种诱变剂先后使用）两种或多种诱变剂先后使用2）同一诱变剂重复处理）同一诱变剂重复处理3）两种或多种诱变剂同时使用）两种或多种诱变剂同时使用第24页/共64页 菌种菌种

19、 单独处理单独处理 诱变剂诱变剂 突变率（突变率（%） 复合处理复合处理 诱变剂诱变剂 突变率（突变率（%）土曲霉土曲霉紫外线紫外线X-射线射线21.319.7紫外线紫外线+X-射线射线42.8黄曲霉黄曲霉氮芥（氮芥（0.1%）紫外线紫外线不明显不明显4.7氮芥氮芥+紫外线紫外线11.0链霉菌链霉菌紫外线紫外线 -射线射线31.035.0紫外线紫外线+ -射线射线43.6金色链霉菌金色链霉菌二乙烯三胺二乙烯三胺硫酸二乙酯硫酸二乙酯紫外线紫外线6.061.7812.5二乙烯三胺二乙烯三胺+紫外线紫外线硫酸二乙酯硫酸二乙酯+紫外线紫外线26.635.9 诱变剂的复合处理及其协同效应诱变剂的复合处理

20、及其协同效应第25页/共64页第26页/共64页3 3、诱变处理后的后培养、诱变处理后的后培养表型迟延现象表型迟延现象 生理性生理性 分离性分离性 遗传物质经诱变处理后发生的突变，必须经复制才能表现遗传物质经诱变处理后发生的突变，必须经复制才能表现出来。出来。 研究表明，诱变后的一小时内必须进行新的蛋白质合成，研究表明，诱变后的一小时内必须进行新的蛋白质合成，这个变异才有效。这个变异才有效。 方法：方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯

21、的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。果的不稳定和将来的菌株退化。第27页/共64页第28页/共64页 基因工程又叫做基因拼接技术或基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。这种技重组技术。这种技术是在生物体外，通过对术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和

22、“拼拼接接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。人类所需要的基因产物。基因工程的别名基因工程的别名基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因基因操作水平操作水平DNA分子水平分子水平基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物第29页/共64页第30页/共64页基因工程菌操作程序基因工程菌操作程序第31页

23、/共64页S底物底物P产物产物B1、B2副产物副产物第32页/共64页基因表基因表达系统达系统原核表达系统原核表达系统真核生物表达系统真核生物表达系统 有酵母、丝状真菌等有酵母、丝状真菌等目前常用大肠杆菌、枯草芽孢杆目前常用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等菌、链霉菌等第33页/共64页第34页/共64页原核生物基因表达的调控原核生物基因表达的调控乳糖代谢基因表达调控图解：乳糖代谢基因表达调控图解：(没有乳糖时没有乳糖时) lacZ lacY lacA 调节基因调节基因启动子启动子 操纵基因操纵基因结构基因结构基因RNA聚合酶聚合酶信使信使RNA转录转录翻译翻译阻抑物与阻抑物与操纵基因操纵基因结

24、合，结结合，结构基因转构基因转录受阻录受阻阻抑物阻抑物第35页/共64页原核生物基因表达的调控原核生物基因表达的调控乳糖代谢基因表达调控图解：乳糖代谢基因表达调控图解：(有乳糖时有乳糖时) lacZ lacY lacA 调节基因调节基因启动子启动子 操纵基因操纵基因结构基因结构基因信使信使RNA转录转录翻译翻译阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变，阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与操纵基因结合，使得结构因而不能与操纵基因结合，使得结构基因进行转录。基因进行转录。阻抑物阻抑物乳糖乳糖转录转录半乳糖苷酶半乳糖苷酶透过酶透过酶转乙酰酶转乙酰酶乳糖分解代乳糖分解代谢调控过程谢调控过程是一个自我是

25、一个自我调控过程调控过程 RNA聚合酶聚合酶第36页/共64页第37页/共64页含低拷贝数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率高，因含低拷贝数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率高，因此，增加工程菌中质粒拷贝数有利于提高质粒稳定性。此，增加工程菌中质粒拷贝数有利于提高质粒稳定性。含高拷贝数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是含高拷贝数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的产生，造成含质粒菌比生长速率明显低于不大量外源质粒的产生，造成含质粒菌比生长速率明显低于不含质粒菌，所以一旦产生了不含质粒菌，能很快地取代质粒含质粒菌，所以一旦产生了不含质粒菌，能很快地取代质粒菌，因此进一步提

26、质粒拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负菌，因此进一步提质粒拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负势，影响质粒的稳定性。势，影响质粒的稳定性。第38页/共64页以增加菌体的生长达到一定密度为目的，以增加菌体的生长达到一定密度为目的，外源基因不表达，从而使工程菌与质粒丢外源基因不表达，从而使工程菌与质粒丢失菌的比生长速的差异减小，增加质粒的失菌的比生长速的差异减小，增加质粒的稳定性稳定性诱导外源基因的表达，可以在培养基中加诱导外源基因的表达，可以在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。失菌的生长。第39页/共64页第40页/共64页第41页/共64页

27、体的中性位点体的中性位点插入正调节基因插入正调节基因使其重复来增加产量。使其重复来增加产量。利用转座方法增加目标产物的方法第42页/共64页第43页/共64页第44页/共64页（三）原生质体融合育种（三）原生质体融合育种原生质体融合（原生质体融合（protoplast fusionprotoplast fusion）育种是杂交育种育种是杂交育种（基因重组）育种的一种特殊方式（基因重组）育种的一种特殊方式 通过基因重组可以使基因组成发生较大的改变，随之通过基因重组可以使基因组成发生较大的改变，随之使生物的性状发生变化。使生物的性状发生变化。 但对微生物育种来说，有性重组的局限性很大。因为迄但对微

28、生物育种来说，有性重组的局限性很大。因为迄今发现有性杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的今发现有性杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的微生物中则更少；而且即使发生杂交，遗传重组的频率也微生物中则更少；而且即使发生杂交，遗传重组的频率也不高，这就妨碍了基因重组在微生物育种中作用；另外，不高，这就妨碍了基因重组在微生物育种中作用；另外，转化、转导等现象在微生物中亦不普遍。转化、转导等现象在微生物中亦不普遍。 原生质体融合技术打破了这种不能充分利用遗原生质体融合技术打破了这种不能充分利用遗传重组的局面传重组的局面第45页/共64页1、原生质体融合的概念、原生质体融合的概念 就是把两个亲本的细

29、胞分别去掉细胞壁，就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁，获得原生质体，将两亲本的原生质体在高渗条件获得原生质体，将两亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇（下混合，由聚乙二醇（PEGPEG）作为助融剂，使它）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞质融合，接着两亲本基因们互相凝集，发生细胞质融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。组由接触到交换，从而实现遗传重组。第46页/共64页1） 、大幅度提高亲本之间重组频率。、大幅度提高亲本之间重组频率。原生质体剥离了细胞壁，去除了细胞间物质交换的主要障碍，也避免了修复系统的制约；再加上促融剂的诱导作用，重组频率显著提高。2）、扩大重组的亲

30、本范围。）、扩大重组的亲本范围。2、原生质体融合育种的优点、原生质体融合育种的优点 如天蓝色链霉菌的种内重组频率可达如天蓝色链霉菌的种内重组频率可达20%去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统。实现重组，不需要有已知的遗传系统。3）、原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物）、原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大。质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大。4）、可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到）、可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得

31、到的优良形状通过原生质体融合再组合到一个单株中。的优良形状通过原生质体融合再组合到一个单株中。第47页/共64页原生质体融合的基本过程原生质体融合的基本过程3、一般步骤、一般步骤第48页/共64页4、原生质体的制备与再生、原生质体的制备与再生多用酶解法多用酶解法 细菌、放线菌细菌、放线菌 溶菌酶溶菌酶 酵母菌酵母菌 蜗牛酶蜗牛酶 霉菌霉菌 纤维素酶等纤维素酶等第49页/共64页5、影响原生质体制备的因素：、影响原生质体制备的因素：1）菌体的预处理）菌体的预处理在使用脱壁酶处理以前，先用某些化合物对菌体进在使用脱壁酶处理以前，先用某些化合物对菌体进行预处理，有利于原生质体制备。行预处理，有利于原

32、生质体制备。如 EDTA（乙二胺四乙酸）、甘氨酸、青霉素、D-环丝氨酸等2）菌体的培养时间）菌体的培养时间一般选择对数期后期的菌体进行酶处理一般选择对数期后期的菌体进行酶处理3）酶浓度）酶浓度一般来说，酶浓度增加，原生质体的形成率增大；超过一般来说，酶浓度增加，原生质体的形成率增大；超过一定范围，则原生质体形成率提高不明显。一定范围，则原生质体形成率提高不明显。酶浓度过高，往往导致原生质体再生率降低酶浓度过高，往往导致原生质体再生率降低建议以使原生质体形成率和再生率的乘积达到最大时的酶浓度作为最适酶浓度。4）酶解温度）酶解温度 温度对酶解作用有双重影响 一般20405）酶解时间）酶解时间充足的

33、酶解时间是原生质体制备的必要条件；充足的酶解时间是原生质体制备的必要条件；但太长会使再生率显著降低但太长会使再生率显著降低6）渗透压稳定剂）渗透压稳定剂必须在高渗或等渗溶液中必须在高渗或等渗溶液中对不同菌种，应采用不同的稳定剂对不同菌种，应采用不同的稳定剂 细菌、放线菌细菌、放线菌 一般采用蔗糖、丁二酸钠一般采用蔗糖、丁二酸钠 酵母酵母 采用山梨醇、甘露醇采用山梨醇、甘露醇 霉菌霉菌 采用采用KCl和和NaCl浓度浓度 一般一般0.30.30.8mol/L0.8mol/L第50页/共64页6、亲本原生质体融合（和再生）、亲本原生质体融合（和再生） 促融剂促融剂常用常用 聚乙二醇聚乙二醇 (po

34、lyethyleneglycol; PEG) 4000 和和 6000 PEG可使原生质体的膜电位下降，然后原生质体通可使原生质体的膜电位下降，然后原生质体通过过Ca2+交换而促进凝集交换而促进凝集 PEG渗透压的脱水作用，扰乱了分散在原生质体膜渗透压的脱水作用，扰乱了分散在原生质体膜表面的蛋白质和脂质的排列，提高了脂质胶粒的流动表面的蛋白质和脂质的排列，提高了脂质胶粒的流动性，从而促进了原生质体的相互融合。性，从而促进了原生质体的相互融合。 电场诱导也可促进原生质体融合电场诱导也可促进原生质体融合重组能将不同来源的菌株的优点集于一身，创造出性重组能将不同来源的菌株的优点集于一身，创造出性状优

35、异的重组菌来生产重要的生物产品。状优异的重组菌来生产重要的生物产品。第51页/共64页7、 原生质体融合技术在微生物育种中的应用原生质体融合技术在微生物育种中的应用已得到较好的应用，例如已得到较好的应用，例如二二生素链霉菌通过原生质体制备后再生，提高了螺旋霉生素链霉菌通过原生质体制备后再生，提高了螺旋霉素产量素产量 酿酒酵母：酿酒酵母：可利用葡萄糖生产酒精，但不能利用淀粉和可利用葡萄糖生产酒精，但不能利用淀粉和糊精糊精 糖化酵母：糖化酵母：能利用淀粉和糊精，但产酒精能力很差能利用淀粉和糊精，但产酒精能力很差 二者融合，获得了可利用淀粉和糊精生产酒精的融合子二者融合，获得了可利用淀粉和糊精生产酒

36、精的融合子第52页/共64页第53页/共64页的残存菌株中获得所需的突变株的残存菌株中获得所需的突变株成为菌种改良成功与否的关键。成为菌种改良成功与否的关键。第54页/共64页由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，所以必须经过大量的筛选工作，才能得到需要的所以必须经过大量的筛选工作，才能得到需要的菌株。菌株。通常有两种方法用于筛选改良的微生物菌株：通常有两种方法用于筛选改良的微生物菌株： 随机筛选随机筛选和和理化性选择理化性选择此外突变株的筛选可以是此外突变株的筛选可以是手工操作手工操作也可以是也可以是高度高度自动化。自动化。主要优点是前期主要优点是前期投入资金较少，投入资金较少，缺点是需花费大缺点是需花费大量的劳动力和时量的劳动力和时间。间。优点节约劳优点节约劳动力和时间动力和时间。缺点仪器昂缺点仪器昂贵贵第55页/共64页第56页/共64页第57页/共64页第58页/共64页随机筛选方法：随机筛选方法： 菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，从中筛选高产菌株。为了提高筛选效率，发展了一些快，从中筛选高产菌株。为了提