7 酶非水相催化

1、第七章 酶非水相催化观念的改变有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反响建立起来的。近年来，进行了非水介质的酶结构与功能、酶作用机制、酶作用动力学的研究，建立起非水酶学non-aqueous enzymology)。第一节 酶非水相催化的研究概况受非水介质的影响，其催化特性与在水相中不同。酶的非水相催化主要包括:一、有机介质中的酶催化；二、气相介质中的酶催化；三、超临界流体介质中的酶催化；四、离子液介质中的酶催化一、有机介质中的酶催化指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反响。适用范围:底物、产物两者或其一为疏水性物质的酶催化作用。原因:酶在有机介质中根本能保持结构的完整。特性:酶的底物特

2、异性、立体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定性等有所改变。应用：多肽、酯类、甾体转化、功能高分子合成、手性药物拆分的研究。二、气相介质中的酶催化指酶在气相介质中进行的催化反响。适用范围：底物是气体或能转化为气体的物质的酶催化反响。特性：气体介质的密度低，扩散容易，与在水相中明显不同。三、超临界流体介质中的酶催化酶在超临界流体中进行的催化反响。超临界流体是指温度和压力超过某物质的超临界点的流体。 要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良好化学稳定性；温度不可太高太低；压力不可太高；易获得等。常用的超临界流体有：CO2, SO2 C2H4, C2H6 C3H8 C4H10 等。四、离子液介质中的酶催

3、化指酶在离子液中进行的催化作用。离子液 (Ionic liquid )是由有机阳离子与有机无机阴离子构成的、在室温下呈液态的低熔点盐类，挥发性低，稳定性好。特性：酶在其中有良好的稳定性、区域选择性、立体选择性、键选择性。第二节有机介质中水和有机溶剂对酶催化反响的影响1、微水介质体系；2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系；3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系；4、正胶束体系；5、反胶束体系。一、有机介质反响体系1、微水介质体系是由有机溶剂和微量的水组成的反响体系。微量的水主要是酶分子的结合水,对维持酶分子空间构象和催化活性至关重要。另一局部水分配在有机溶剂中。酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于

4、有机介质中，是常见的有机反响体系。2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系由水与极性较大的有机溶剂互相混溶组成的反响体系。水与有机剂含量均较大。适用的酶较少。3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相或多相反响体系；游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机溶剂相。固定化酶在界面；催化反响在两相界面进行；适于底物或产物两者或其中一种属于疏水化合物的催化反响。4、正胶束体系 大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，参加外表活性剂后形成的水包油的微小液滴。 外表活性剂的极性端朝外,非极性端朝内,有机溶剂被包在液滴内部。 酶在胶束外面的水溶液中,

5、疏水性的底物或产物在胶束内部,反响在胶束的两相界面中进行。5、反胶束体系反胶束: 在与水不互溶的大量有机溶剂中,参加外表活性剂后形成的油包水的微小水滴；1997年首次报道酶在反相胶束中具有活性(已发现40多种酶)；酶分子处在反胶束内，稳定性好；反胶束与生物膜有相似之处，适用于处在生物膜外表或与膜结合的酶的结构、催化特性和动力学性质的研究。二、水对有机介质中酶催化的影响有机溶剂中酶的催化活力与反响系统的含水量密切相关。系统含水量:结合水(酶粉水合、固定载体和其他杂质)、游离水(溶于有机溶剂)与酶结合的水量是影响酶的活力、稳定性以及专一性的决定因素1、水对酶分子空间构象的影响无水下酶空间构象被破坏

6、,故需一层水化层;必需水:维持酶分子完整空间构象所必需的最低水量;不同的酶所需求的必需水的量差异较大;每分子凝乳蛋白酶只需50分子的水，每分子多酚氧化酶却需3.5102个水分子原因:必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等副键所必需的。2.水对酶催化反响速度的影响 典型的非水酶体系中水含量通常只占0.01%，但其微小差距会导致酶催化活力的较大改变。水影响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和稳定性。 三、有机溶剂对有机介质中酶催化的影响直接或间接影响酶的活性和稳定性。改变酶的特异性底物特异性、立体选择性、前手性选择性等。通过与水、酶、底物和产物的相互作用来影响酶的特性。1. 有机溶剂对酶结构与功能的

7、影响在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液中，较好地保持其构象；有机溶剂中酶分子不能直接溶解，因此根据酶分子特性与有机溶剂特性不同，其空间结构的保持也有不同。有些酶在有机溶剂作用下，其结构受到破坏；有的酶分子那么保持完整；1有机溶剂对结合水的影响一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶外表的必需水而导致酶失活。由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水量与酶的用量及底物浓度有关。提高酶分子的亲水性，可以限制酶在有机溶剂中的脱水作用。2. 有机溶剂对酶活性的影响、溶剂对底物和产物分配的影响溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度。有机溶剂极性小，疏水性强，那么疏水性底

8、物难于进入必需水层；有机溶剂极性过强，亲水性强，那么疏水性底物在有机溶剂中的溶解度低。应选择2lgp5的有机溶剂作为有机介质为宜。第三节 酶在有机介质中的催化特性有机溶剂的存在,改变了疏水相互作用的精细平衡,从而影响到酶的结合部位。有机溶剂会改变底物存在状态。结果影响酶的稳定性和酶的底物特异性,立体选择性,区域选择性和化学键选择性。2、底物特异性 酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性。例如：青霉脂肪酶 在正己烷中催化2-辛醇与不同链长的脂肪酸进行酯化反响时，该酶对短链脂肪酸具有较强的特异性。一、底物专一性(1)有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状态发生改变,致使酶的底

9、物特异性发生改变:水溶液中底物与酶活性中心结合靠疏水作用;有机介质中有机剂与底物的疏水作用更强;(2)不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样:极性较强的有机溶剂中,疏水性较强的底物易反响;极性较弱的有机溶剂中,疏水性较弱的底物易反响;3、对映体选择性 酶的对映体选择性是指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力。 有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲疏水性的变化而发生改变。 疏水性强的有机溶剂中酶的立体选择性差。例如：某些蛋白水解酶在有机溶剂中可以合成D氨基酸的肽，而在水溶液中酶只选择L-氨基酸。 二、对映体选择性enantioselectivity)对映体选择性意义：例如：某些蛋白水

10、解酶在有机溶剂中可以合成D氨基酸的肽，而在水溶液中酶只选择L-氨基酸。 三、区域选择性regioselectivity 酶能够选择性地催化底物分子中某个区域的基团优先发生反响；用区域选择系数的大小衡量。用1、2代表底物分子的区域位置；区域选择系数： K1，2=kcat/Km)1/ kcat/Km)2例：1,4-二丁酰基-2-辛基苯丁醇脂肪酶转脂反应+甲苯乙腈K4，120.5四、键选择性chemoselectivity)即同一个底物分子中有2种以上化学键可与酶反响，酶对其一优先反响。6-氨基-1-已醇黑曲霉脂肪酶毛霉脂肪酶羟基酰化氨基酰化占优五、热稳定性 有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水

11、溶液中高。例如： 猪胰脂肪酶PPL在苯中催化酯交换反响时，1酶活性随温度升高2070而增加，2在70连续反响7次每次96 h后酶活力仍保持 60，3在100时的半衰期可达数十小时，而在水中100几乎马上失活。 PPL的稳定性取决于有机溶剂中水的浓度， 1的水，会使PPL的稳定性降低到和水溶液中相同的水平。 六、pH值特性在有机介质中酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH值相同，称为pH印记或pH记忆pH-imprinting;现象：脂肪酶催化三丁酸甘油与正庚醇的转酯反响，酶的反响速度与其冷冻枯燥前水溶液的的PH密切相关，反响的最适PH接近于水溶液中的最适PH原因：当酶分

12、子从水溶液转移到有机介质时，原有的解离状态不变，被保持在有机介质中；有机介质中酶催化反响的最适ph通常与在水溶液的pH接近；但有些有机溶剂中酶的最PH与水溶液中相差较大，还与缓冲液种类和离子强度有关;第四节 有机介质中酶催化反响的条件及其控制酶在有机介质中的催化反响受各种因素影响，主要有酶、底物、有机溶剂种类、水含量、温度、pH值和离子强度等。一、有机介质中酶催化反响的类型1、合成反响2、转移反响3、醇解反响4、氨解反响5、异构反响6、氧化复原反响7、裂合反响1、合成反响有机介质中水含量极微，可催化水解反响的逆反响；1脂肪酶或酯酶催化有机酸和醇进行酯的合成反响：意义:酶催化酯合成可合成手性化合

13、物,且酶的立体选择性主要是选择立体异构的醇。2蛋白酶可在有机介质中催化氨基酸进行合成反响，生成多肽2、转移反响如脂肪酸催化酯与有机酸反响生成另一种酯与有机酸,即转酯反响：3、醇解反响假单胞脂肪酶催化酸酐醇生成二酸单酯化合物即酸酐水解反响,例:4、氨解反响如脂肪酶催化酯类进行不对称氨解反响：R-苯丙氨酸甲酯酰胺叔丁醇5、异构反响如消旋酶催化一种异构体为另一种异构体例6、氧化复原反响1单加氧2双加氧3催化醛类或酮类复原成醇类1单加氧2双加氧3催化醛类或酮类复原成醇类7、裂合反响如醇腈酶催化醛与氢氰酸的反响二、酶的选择1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差异；2、酶反响速

14、度与酶浓度成正比；3、另注意酶的稳定性、底物专一性,对映体选择性、区域选择性、键选择性等三、底物的选择和浓度控制1、有机剂与水中酶的底物专一性不同；2、底物浓度对酶催化速度有明显的影响；3、有机介质中要考虑底物在有机溶剂和必需水层中的分配情况；4、高浓度底物会对反响产生不利影响。四、有机溶剂的选择1、有机剂的极性要选择恰当：极性过强,夺取较多酶外表水分子,使疏水性底物溶解度降低;极性过弱,底物难以进入必需水层;故取中间: 2lgP52、与水混溶的有机介质其含量对酶催化有影响。与水混溶的二氧六环介质,辣根过氧化酶(HRP)催化对苯基苯酚的聚合反响,随着二氧六环的含量增加,酶催化得到的聚合物的分子

15、量也增加,80%时最大。二氧六环含量/%聚合物相对分子质量五、含水量的控制当其它因素不变时，系统含水量对酶活性有影响，只有在最适含水量时酶才有最高活力；最适水含量通常随溶剂极性增大lgP减小而增大；1水含量反应速度21341-已烷2-四氯甲烷3-甲苯4-苯六、温度的控制1、微水有机介质中含水量低，酶的热稳定性增强，其最适温度高于水溶液中催化的最适温度；2、温度低，酶的立体选择性高。Lam和Keinan的实验结果支持此结论；七、pH值的控制酶在有机介质中的最适PH值通常与在水溶液中催化的最适pH相同或接近；可通过调节缓冲液pH的方法调节有机介质中酶催化的pH值；酶在冷冻枯燥过程中，pH状态有变化

16、；希令hilling)发现缓冲液对冷冻枯燥过程中pH值和酶活力有影响，故参加一定量的蔗糖、甘露醇等冷冻枯燥保护剂；在酶液冻干之前或催化过程采取保护措施；加有机相缓冲液可对有机介质中酶反响的pH调节。第五节酶非水相催化的应用 酶 催化反应 应用脂肪酶 肽合成 青霉素G前体肽合成 酯合成 醇与有机酸合成酯类 聚合 二酯的选择性聚合蛋白酶 肽合成 合成多肽 酰基化 糖类的酰基化羟基化酶 氧化 甾体转化过氧化物酶 聚合 酚类、胺类聚合多酚氧化酶 氧化 芳香化合物羟基化胆固醇氧化酶 氧化 胆固醇测定醇脱氢酶 酯化 有机硅醇的酯化酶非水相催化应用一、手性药物的拆分手性化合物指化学组成相同而立体结构互为对映

17、体的两种异构化合物；手性药物指只含单一对映体的药物；已经发现很多手性药物的对映体具有不同的药理作用。过去手性药物多较是以消旋体形式出售。1961年欧洲出现了孕妇服用多消旋体的“反响停后，产生多起畸形胎事件。1992年美国食品与药物管理局FDA明确要求含手性因素的化学药物，必须说明其二个对映体在体内的不同生理活性，药理作用和药物代谢动力学情况。1994年以来，手性药物世界销售额以年20以上的速度增长。目前，世界上批准上市约61种。手性药物两种对映体的药理作用药物名称 有效对映体作用 另一种对映体作用普萘洛尔 S构型，治疗心脏病，-受体阻断剂 R构型，钠通道阻滞剂青霉素胺 S构型，消炎、解热、镇痛

18、 R构型，突变剂反应停 S构型，镇静剂 R构型，致畸胎1、手性药物两种对映体的药效差异1一种有疗效，另一种很弱；2一种有效，另一种有不良反响；3两种相反；4两种各有不同药效；5两种消旋体作用具互补性分5种类型：2、酶在手性化合物拆分方面的应用酶催化在单一对映体手性药物的开发中潜力颇大。 1、阻断剂类手性药物 2、非甾体抗炎剂类手性药物 3、5羟色胺拮抗物和摄取抑制剂类手性药物脂肪酶在拆分中起重要作用。其他种类酶如酯酶、过氧化物酶、醇脱氢酶等也能进行拆分反响，但因这些酶不易获得，价格昂贵或需要辅酶而较少研究。1、阻断剂类手性药物拆分(1)普萘洛尔的酶法拆分Berinakatti在有机剂中用PSL

19、(假单胞菌脂肪酶对外消旋萘氧氯丙醇酯水解,得到-酯的ee值大于95%PSL对外消旋萘氧氯丙醇酯水解反响路线图(2)环氧丙醇酶法拆分在阻断剂类手性药物中,环氧丙醇是很重要的3碳手性中间体,还可合成治艾滋病的HIV蛋白酶抑制剂,抗病毒药(S)-HMPA等手性甘油磷脂;Vantol对2,3-环氧丙醇的丁酸酯在有机剂中与两相体系中用PPL(猪胰脂肪酶)进行酶促拆分.*脂肪酶水解反响拆分丁酸环氧丙酯，*手性碳位置2、非甾体抗炎剂类手性药物拆分非甾体抗炎剂类手性药物广泛用于人联结组织疾病如关节炎,活性成分是2-芳基丙酸的衍生物(CH3CHArCOOH),如萘普生,布洛芬等。台湾的Tsai证实在80%异辛烷

20、与20%甲苯中酶反响获得较高ee值光学活性物。布洛芬酶法拆分示意3、羟色胺拮抗物和摄取抑制剂5-羟色胺(5-HT)是涉及到精神病、神经系统紊乱的一种神经递质；一些药物的毒性在于其不能选择性地与5-HT受体反响；一种新的5-HT拮抗物MDL那么显示了极好的选择性，R型活力是S型的100倍；手性拆分如下，脂肪酶选择性催化生成(R,R)酯，残留为S，S醇二、手性高分子聚合物的制备光学活性化合物：具有旋光性质的化合物，也称手性化合物。意义：构成生物体的根本物质，如氨基酸、蛋白质、核酸、糖类等生物大分子都是手性化合物，手性对生物体的新陈代谢有重要意义。与此相关的药物、生理活性物质、农药合除草剂也都是光学

21、活性化合物，其药理和生理作用多与它们生物体内靶分子之间的手性匹配合分子识别能力有关。光学活性化合物的制备是有机合成的难题。酶可用于光活性物质的合成拆分。一光学活性化合物的制备随着具有光、电、磁性聚合物的发现，旋光性聚合物正受青睐。旋光性聚合物广泛存在于自然界中，多由蛋白质、核酸、多糖等构成。聚合物的旋光性来源于单体单元中含有的手性元素或聚合物的手性构象，或这两者的共同作用。影响高分子材料物理性能及加工性能，不仅在于其一级结构，其二三级高级结构也是重要因素，聚合物旋光性手性也是一个重要因素；利用酶催化获得高的立体选择性，化学催化提供高产率，特性合成手性聚合物是一条很有应用潜力的新途径。旋光性高分

22、子旋光性聚合物与具有相应结构的非旋光聚合物相比，在分子识别和组装上具明显区别，在熔点、溶解性、结晶特性上有较大差异，在光、电、磁上也有差异。利用水解酶可合成多种手性聚合物；酶法可获得较高立体选择性，化学催化法有较高产率，两者结合较有前景。二酶催化合成可生物降解高分子可生物降解高分子是指在一定条件下能被生物体侵蚀或代谢而降解的材料，应用广泛：领域应用领域应用医疗外科手术缝合线；伤口涂料；人造血管；药物释放体系；骨骼替代品工业无污染可生物降解包装材料；除锈剂、抗真菌载体农业农用地膜；肥料、杀虫剂除草剂释放体系1.聚酯类可生物降解高分子的酶促合成A、B各代表一种具有反响性的功能基因，如羟基和羧基、羧

23、基和酰氯等；Gaonkar等认为：极性太强的溶剂对聚合反响不利，因为随着聚合反响的进行，聚合物的聚合程度逐渐增加，聚合物的极性逐渐降低，它在强极性溶剂中的溶解度液随之降低，不利于聚合的进行。(1)利用线性单体的缩合反响合成聚酯近两年开展的新方法MacDonald认为：水分子在链增长的过程中起到了活化作用，聚合反响过程先是一个快速的起始反响，然后是缓慢的链增长过程。2利用内酯的开环聚合反响合成聚酯糖和类固醇的选择性酰化糖酯作为一种生物功能分子和化工原料具有重要价值。1991年Planehon发现一些糖酯衍生物具有抗肿瘤作用。对糖的多羟基位置选择性酯化是有机合成化学中的难题，利用生物催化剂的高度选

24、择性易于解决。1986年Klibanov小组首先开展了有机相中酶结合成糖酯的研究。利用糖的特殊的分子结构合成糖基聚酯或高交联度的聚酯是研究热点之一酰基对于糖酯的合成至关重要。2、聚糖酯类可生物降解高分子的酶促合成酶法合成该性天然多糖的主要途径大多是在聚酯链上引入糖基，以增强聚合物的生物可降解性能。如果用化学方法聚合，需要将有些羟基保护起来，防止副反响，聚合后，再脱保护，反响过程复杂，还有异构体产生，酶法聚合那么不必保护基团，反响条件温和。三、 酚树脂的合成辣根过氧化物酶horseradish peroxidase,HRP能以H2O2为电子受体，专一催化酚及苯胺类物质的过氧化反响；起始阶段，酶催

25、化酚类物氧化成酚氧自由基；然后是自由基聚合阶段；然后是单体自由基与二体自由基发生传递，使聚合物链增长辣根过氧化物酶催化酚类物质的合成酚树脂通常是在甲醛存在下缩合酚类物质而获得的。辣根过氧化物酶HRP催化产生的酚类聚合物无甲醛污染。HRP可催化酚类物质与天然的树脂材料木质素混聚形成酚树脂。back四、导电有机聚合物的合成1977美国，Macdiarmid打破聚合物系绝缘体观念，获得碘掺杂的聚乙炔；酶法合成的聚酚胺类物质具有电子共轭结构，通过掺杂表现出一定的导电性。有机酶合成用于研制有机导电聚合物，如聚苯胺，抗雷电袭击、抗静电、抗磁干扰、雷达微波吸收。HRP在催化合成聚合物方面是一种应用较多，潜力较大的酶，HRP能够以过氧化氢为电子受体，专一地催化酚及苯胺类物质的过氧化反响。辣根过氧化物酶催化酚及芳香胺类物质的聚合1在混合溶液中聚合：HRP可以在含水量不同的与水混溶的有机介质中进行催化反响，可以获得高质量的聚合物。2在胶束中进行催化反响，酶能够保持极高的反响活力。合成方法五、发光有机聚合物的合成非线性光学材料是激光技术的重要物质根底，在激光倍频、混频、参量放大与振荡、集成光学、光信息处理与光信号控制、光电子计算机等方面有重要应用；有机非线性光学材料其倍频效应较无机材料