工程菌的高效表达

1、工程菌的高效表达与稳定性工程菌的高效表达与稳定性工程菌的概念： 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”。 工程菌是采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点。 应用：治理海洋石油泄漏 ；生产基因工程药物工程菌的高效表达 高效表达的概念：高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。一、最佳的基因表达体系： 目的基因的表达产量高; 表达产物稳定; 生物活性高; 表达产物容易分离纯化。二、宿主细胞的选择 （一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求

2、: 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。 （二）宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 原核生物基因表达的特点：（1） 原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原核的启动子，催化所有RNA合成。（2） 原核生物的基因表达是以操纵子为单位。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。（

3、3） 由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，二者也是连续进行的。原核生物染色体DNA是裸露的环型DNA，转录成mRNA后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻译成蛋白质。每个核糖体可独立完成一条链的合成，多核糖体可同时在1条mRNA合成多条肽链，大大提高了翻译效率。（4） 原核基因不含内含子（intron），没有转录后加工过程。（5） 原核生物基因表达的控制主要是在转录水平。对RNA合成的调控有两种方式：启始控制（启动子控制）和终止控制（衰减子控制）。（6） 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，有一个转译启始密码子及同16S核糖体RNA3末端碱基互补的序列，即SD序列，真核基因则无此序列。外源

4、基因在原核中表达的关键：（1） 通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；（2） 外源基因不能带有内含子；（3） 利用原核细胞的强启动子和SD序列等控制外源基因的表达；（4） 外援基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架；（5） 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止表达的外源基因产物对宿主菌的毒害。大肠杆菌体系中的基因表达 目前，大肠杆菌是应用最广泛、最成功的高效表达体系，并常常作为高效表达研究的首选体系。 大肠杆菌作为外源基因的表达宿主，遗传背景清楚，技术操作简便，培养条件简单，大规模发酵经济，因此备受遗传工程专家的重视。 优越性： 对大肠杆菌的基

5、础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 有各类菌株和载体系列。 目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。 易培养，成本低。 缺点： 大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。 因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。 蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。 其内毒素很难除去。外源基因在真核细胞中的表达哺乳动物细胞做宿主表达体系的优点：（1） 能识别和除去外源基因中的内含子，剪切加工成成熟的mRNA；（2） 表达的蛋白质在翻译

6、后被加工的机会多（如糖基化），更接近于体内构型；（3） 易被重组DNA转染，具有遗传稳定性和可重复性；（4） 经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物分泌到培养基中，提纯工艺简单，成本低。酵母体系中的基因表达 酵母菌是最简单的真核表达体系，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便，具有元和细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统优势： 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率； 培养条件简单，容易进行高密度发酵；4.能将外源基因表达产物分泌到培养基中；1.5.有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。缺陷在于： 表达效

7、率相对低2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工修正。工程菌的稳定性 工程菌的不稳定性大多数是由于质粒不稳定造成的一、工程菌的稳定性 质粒分裂的不稳定 :工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象 质粒结构的不稳定 : 指外源基因从质粒上丢失或者碱基重排、缺失而导致的工程菌性能的改变 （1）分离的不稳定性 （2）结构的不稳定性DN的缺失、插入和重排影响了质粒稳定区的结构 。质粒稳定性的分析方法样品样品不含抗性标记抗生素不含抗性标记抗生素 平平 板板 培培 养基养基10-12h10-12h100100个菌落个菌落含抗性标记抗生素含抗性标记抗生素平平 板板 培培 养养 基基 10-

8、12h10-12h统计生长菌落数统计生长菌落数重复三次重复三次, ,计算比值计算比值 ( (稳定性稳定性stability)stability) 1.选择合适的宿主菌. 宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒的稳定性。 2.选择合适的载体 改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环。相对而言，Kan抗性的质粒一般比Amp抗性稳定 3.选择压力 从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。 4.分阶段控制培养 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒

9、往往越不稳定。 可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。 5.控制培养条件 在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率3个方面尤其重要。 6.固定化 固定化技术包括固定化酶技术与固定化微生物技术。固定化微生物技术是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域,以提高微生物细胞的浓度,使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。 工程菌的国际动态：美国哈佛大学的研究小组在PLoS ONE杂志上发表了合成生物学研究的最新成果。他们通过三种不同的方式，分别将光合细菌细长集球藻导入哺乳动物细胞和斑马鱼胚胎细胞，成功构建了双种群内共生系统