色谱分析分离原理实用教案

1、2.1 概述(i sh)色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当(shdng)的检测手段，就成为色谱分析法。第1页/共112页第一页，共112页。 色谱法的最早应用是用于分离植物(zhw)色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物(zhw)色素（植物(zhw)叶的提取液）的石油醚倒入管中。第2页/共112页第二页，共112页。 此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断(bdun)地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。

2、第3页/共112页第三页，共112页。第4页/共112页第四页，共112页。 现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样(yyng)的。我们仍然叫它色谱分析。第5页/共112页第五页，共112页。一、色谱分离一、色谱分离(fnl)(fnl)基本原理：基本原理： 由以上方法可知，在色谱法中存在由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。我们把它叫做流动相。第6页/共112页第六页，共112页。 色谱法的分离(

3、fnl)原理 利用待分离(fnl)的各种物质(混合物质)在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离(fnl)的。第7页/共112页第七页，共112页。使用(shyng)外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。第8页/共112页第八页，共112页。 由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序(cx)由固定相中先后流出。

4、与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 第9页/共112页第九页，共112页。二、色谱分类方法： 色谱分析法有很多种类(zhngli)，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。 第10页/共112页第十页，共112页。（一）以两相的状态(zhungti)分类： 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、液-液色谱。分类情况如下：第11页/共112页第十一页，共112页。色谱法色谱法液相色谱法液相色谱法气相色谱法

5、气-液色谱法气-固色谱法液-固色谱法液-液色谱法第12页/共112页第十二页，共112页。 （二）按固定相的形式可分为：（二）按固定相的形式可分为： 柱色谱：固定相装在色谱柱中；柱色谱：固定相装在色谱柱中； 纸色谱：利用滤纸作载体，吸纸色谱：利用滤纸作载体，吸附附(xf)(xf)在纸上的水作固定相；在纸上的水作固定相； 薄层色谱：将固体吸附薄层色谱：将固体吸附(xf)(xf)剂在玻璃板或塑料板上制成薄层剂在玻璃板或塑料板上制成薄层作固定相。作固定相。 第13页/共112页第十三页，共112页。第14页/共112页第十四页，共112页。（三）按分离原理分类可分为：（三）按分离原理分类可分为： 吸

6、附色谱法：利用吸附剂（固定相吸附色谱法：利用吸附剂（固定相一般是固体）表面对不同组分吸附能力一般是固体）表面对不同组分吸附能力的差别的差别(chbi)(chbi)进行分离的方法；进行分离的方法；第15页/共112页第十五页，共112页。 分配色谱法：利用不同组分在两相间(xingjin)的分配系数的差别进行分离的方法。第16页/共112页第十六页，共112页。 离子交换色谱：利用(lyng)溶液中不同离子与离子交换剂间的交换能力的不同而进行分离的方法。 空间排斥（阻）色谱法：利用(lyng)多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行分离的方法。第17页/共112页第十七页，共112页。2.2 色

7、谱流出曲线(qxin)（色谱图）及有关术语（一）气相色谱法分离(fnl)的过程： 分离(fnl)过程（以分离(fnl)A、B两组分为例）为：第18页/共112页第十八页，共112页。混合组分分离过程及检测器对各组份在不同阶段(jidun)的响应第19页/共112页第十九页，共112页。024681012024681002468101202468100246810120246810第20页/共112页第二十页，共112页。（二）色谱流出曲线： 从载气带着组分进入色谱柱起就用检测器检测流出柱后的气体，并用记录器记录信号随时间变化(binhu)的曲线，此曲线就叫色谱流出曲线，当待测组分流出色谱柱时，

8、检测器就可检测到其组分的浓度，在流出曲线上表现为峰状，叫色谱峰。第21页/共112页第二十一页，共112页。如图所示为一色谱(s p)流出曲线：第22页/共112页第二十二页，共112页。色谱术语：色谱术语：1）基线：在实验条件下，色谱柱后仅）基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。基线在稳定的条件下应是称为基线。基线在稳定的条件下应是一条水平的直线一条水平的直线(zhxin)。它的平直与。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。否可反应出实验条件的稳定情况。第23页/共112页第二十三页，共112页。 2）峰高（h）和峰面积 ：

9、色谱(s p)峰顶点与基线的距离叫峰高。色谱(s p)峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。第24页/共112页第二十四页，共112页。3）保留值 a. 死时间(t0) ：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于(yuy)该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据 t0 可求出流动相平均流速 0tLu 柱长死时间u第25页/共112页第二十五页，共112页。b. 保留时间tr：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过(tnggu)柱子的时间t0和组份在固定相中滞留的时间。第26页/共112页第二十六页，共112页。 c.

10、调整保留时间tr ：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即 由于保留时间为色谱定性依据(yj)。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。 0rrttt 第27页/共112页第二十七页，共112页。d. 死体积V0：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和(zngh)。忽略后两项可得到：00coVt F第28页/共112页第二十八页，共112页。000cwcorTppFFTpn其中，Fco为柱出口(ch ku)的载气流速n（mL/min)，其值为：nF0-检测器出口(ch ku)流速；Tr-室温；Tc-柱温

11、；p0-大气压；pw-室温时水蒸汽压。第29页/共112页第二十九页，共112页。 e. 保留体积保留体积Vr：指从进样到待：指从进样到待测物在柱后出现测物在柱后出现(chxin)浓度极浓度极大点时所通过的流动相的体积。大点时所通过的流动相的体积。 0rcoVtF 第30页/共112页第三十页，共112页。f. 调整(tiozhng)保留体积：某组份的保留体积扣除死体积后的体积rV0rrrcoVVVtF第31页/共112页第三十一页，共112页。g. 相对(xingdu)保留值r2,1：组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。222,111rrrrtVrtV第32页/共112页第三十二页，

12、共112页。n意义：意义：r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动、填充情况及流动相流速相流速(li s)无关，因此，在色谱分析中，尤其是无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！中广泛用于定性的依据！第33页/共112页第三十三页，共112页。具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰 i 对标准峰的相对保留值，此时(c sh)以 表示：( )( )rst it sn1, 又称选择(xunz)因子第34页/共112页第三十四页，共112页。 h. h. 区域宽度：色谱峰的区域宽区域宽度：色谱峰的区域宽

13、度是色谱流出曲线的重要参数之一，度是色谱流出曲线的重要参数之一，可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件操作条件(tiojin)(tiojin)下的动力学因素下的动力学因素。宽度越窄，其效率越高，分离的效。宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。果也越好。第35页/共112页第三十五页，共112页。 区域宽度通常有三种表示方法： 标准偏差：峰高0.607 倍处峰宽处的一半。 半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354 峰底宽W：色谱峰两侧拐点(ui din)上切线与基线的交点间的距离。W= 4第36页/共112页第三十六页，共112页。色谱流出曲线的

14、意义： 色谱峰数-样品中单组份的最少个数； 色谱保留值-定性(dng xng)依据； 色谱峰高或峰面积-定量依据； 色谱保留值或区域宽度-色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距-固定相或流动相选择是否合适的依据。第37页/共112页第三十七页，共112页。2.3 色谱法基本原理 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配(fnpi)系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。第38页/共112页第三十八页，共112页。 但当两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传

15、质(chun zh)和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。 第39页/共112页第三十九页，共112页。一、描述分配过程的参数1、分配系数(K)： 如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分子(fnz)在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数。第40页/共112页第四十页，共112页。 定义：它是指在一定(ydng)温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即 smccK 溶质在固定相中的浓度溶质

16、在流动相中的浓度K 只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用(su yn)仪器无关。第41页/共112页第四十一页，共112页。第42页/共112页第四十二页，共112页。分配系数(xsh)K 的讨论n样品一定时，K主要取决于固定相性质一定温度下,组分的分配系数 K越大，出峰越慢；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样(sh yn)中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。第43页/共112页第四十三页，共112页。 在一定条件下，各种物质(wzh)的K是不同的。K较小的组分在色谱分析中每次分配后在气相

17、中的浓度较大，因此较早流出色谱柱。K较大的组分每次分配后在气相中浓度较小，因此较晚流出色谱柱。第44页/共112页第四十四页，共112页。当分配次数足够多时(dush)，就能将具有不同K的组分分开。所以，我们可以认为，气相色谱法是利用不同的物质具有不同的K而进行分离的。而K的不同则是由于各组分在固定相中的溶解度（对气-液色谱）或吸附能力（对气-固色谱）不同而造成的。 第45页/共112页第四十五页，共112页。2. 分配(fnpi)比： 在一定温度和压力下，组份在两相间的 分 配 ( f n p i ) 达 平 衡 时 ， 分 配(fnpi)在固定相和流动相中的质量比，称为分配(fnpi)比。

18、它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。也叫容量因子或容量比。 第46页/共112页第四十六页，共112页。smmmssmmc Vkc V组分在固定相中的质量组分在流动相中的质量n其式中VmV0 Vs为固定(gdng)相体积第47页/共112页第四十七页，共112页。分配比分配比 k k 的求算：的求算：k k也等于组分的校正也等于组分的校正(jiozhng)(jiozhng)保留时间与死时间的比值保留时间与死时间的比值( (计算时多用此公式计算时多用此公式) )0Rtkt因此，k可通过实验测得。由此也可知道，k可表示出组分在柱中停留时间的长短(chngdun)。k越大，停留时间也就越长。

19、 第48页/共112页第四十八页，共112页。 称为相比率，它也是反映色谱(s p)柱柱型特点的参数。对填充柱，=635；对毛细管柱， =60600。/sssmmmmscmVVKkkcmVV3. K 3. K 与与 k k 的关系的关系(gun x)(gun x)：第49页/共112页第四十九页，共112页。4. 4. 选择因子选择因子(ynz)(ynz) ：色谱柱对：色谱柱对A A、B B两组分的选择因子两组分的选择因子(ynz)(ynz) 定义如定义如下：下：( )( )rBBrAAt BkKtAkKA为先流出的组分，B 为后流出的组分。 和 k 是计算色谱柱分离效能的重要(zhngyo)

20、参数！第50页/共112页第五十页，共112页。 注意：K 或 k 反映的是某一组分在两相间的分配；而 是反映两组分间的分离情况！当两组分 K 或 k 相同(xin tn)时， =1 时，两组分不能分开；当两组分 K 或 k 相差越大时， 越大，分离得越好。也就是说，两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。第51页/共112页第五十一页，共112页。二、二、 塔板理论塔板理论 塔板理论是描述色谱柱中组分在两相塔板理论是描述色谱柱中组分在两相间的分配状况及评价色谱柱的分离效能的间的分配状况及评价色谱柱的分离效能的一种半经验式的理论。塔板理论将一根色一种半经验式的理论。塔板理论将一根色

21、谱柱当作一个由许多谱柱当作一个由许多(xdu)(xdu)塔板组成的塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。出曲线呈正态分布。 第52页/共112页第五十二页，共112页。第53页/共112页第五十三页，共112页。 塔板理论假定(jidng)： 1）塔板之间不连续； 2）塔板之间无分子扩散； 3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H； 4）某组分在所有塔板上

22、的分配系数相同； 5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。 第54页/共112页第五十四页，共112页。(一）、色谱分离过程： 塔板理论是把色谱柱假想为一个精馏塔，塔内存在许多塔板，组分在每个塔板的气相和液相间进行分配，达成一次分配平衡。然后随着流动相按一个塔板、一个塔板的方式(fngsh)向前移动。经过多次分配平衡后，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔（色谱柱），分配系数大的组分后离开蒸馏塔（色谱柱），从而使分配系数不同的组分彼此得到分离。 第55页/共112页第五十五页，共112页。当塔板数 n=0，1，2，3，4，5；某组分的分配比 k=1色谱分离过程如下：红点：不被固定相保

23、留的分子(fnz)黑点：样品分子(fnz)第56页/共112页第五十六页，共112页。分离分离(fnl)(fnl)过程如下图所示过程如下图所示第57页/共112页第五十七页，共112页。第58页/共112页第五十八页，共112页。 下面我们再举一个例子说明组分在色谱(s p)柱中的分配情况。 为简单起见，设色谱(s p)柱由5块塔板（n=5，n为柱子的塔板数）组成，并以r表示塔板编号r=0，1，2，3，4，5；某组分的分配比k=1。 根据上述假定在色谱(s p)分离过程中。该组分的分布可计算如下：第59页/共112页第五十九页，共112页。 开始时，将单位质量（即 m=1）的该组分进入0号塔板

24、上，然后将流动相以一个板体积（V）一个板体积的脉动(midng)形式进入色谱柱；此时组分将按下表所示在固定相和流动相之间进行分配：第60页/共112页第六十页，共112页。 板号板号r r 载气体积载气体积0 01 12 23 3进进样样m mM M0.50.5m mS S0.50.5V Vm mM M50.25m mS S50.252 2V Vm mM M0.1250.1250.125+0.1250.125+0.1250.1250.125m mS S0.1250.1250.125+0.1250.125+0.1250.1250.1253 3V Vm

25、mM M0.0630.0630.063+0.1250.063+0.1250.063+0.1250.063+0.1250.0630.063m mS S0.0630.0630.063+0.1250.063+0.1250.063+0.1250.063+0.1250.0630.063第61页/共112页第六十一页，共112页。 按上述分配过程，对于n=5，k=1，m=1的体系，随着进入柱中板体积载气的增加，组分(zfn)分布在柱内任一板上的总量（气相和液相的总质量）见下表：第62页/共112页第六十二页，共112页。 r nr n0 01 12 23 34 4出出 口口0 01 10 0 0 0 0

26、0 0 0 0 01 0.50 00 00 00 02 50 00 00 03 30.1250.1250.3750.3750.3750.3750.1250.1250 00 04 40.0630.06750.37630.0630 05 50.0320.0320.1570.1570.3130.3130.3130.3130.1570.1570.0320.032第63页/共112页第六十三页，共112页。6 60.0160.0160.0950.0950.2350.2350.3130.3130

27、.2350.2350.0790.0797 70.0080.0080.0560.0560.1160.1160.2740.2740.2740.2740.1180.1188 80.0040.0040.0320.0320.0860.0860.1960.1960.2740.2740.1330.1339 90.0020.0020.0180.0180.0590.0590.1410.1410.2360.2360.1380.13810100.0010.0010.0100.0100.0380.0380.1000.1000.1890.1890.1180.118第64页/共112页第六十四页，共112页。 n n r

28、 r0 01 12 23 34 4出口出口11110 00.0050.0050.0240.0240.0690.0690.1450.1450.0950.09512120 00.0020.0020.0160.0160.0460.0460.1070.1070.0730.07313130 00.0010.0010.0080.0080.0300.0300.0760.0760.0540.05414140 00 00.0040.0040.0190.0190.0530.0530.0380.03815150 00 00.0020.0020.0120.0120.0360.0360.0280.02816160 00

29、 00.0010.0010.0080.0080.0240.0240.0180.018第65页/共112页第六十五页，共112页。 由表中可见，当n=5时，即5个塔板体积的流动相进入(jnr)柱中时，组分就开始从柱口流出。并且呈现先小后大的情况。第66页/共112页第六十六页，共112页。 以上是当塔板数为5时的情况，出现的峰形不对称 ，这是由于塔板数太少的原因。当塔板数大于50时，峰形就是对称的。在实际色谱柱中，n值很大（约为106 109 ）。所以(suy)色谱峰一般为正态分布。第67页/共112页第六十七页，共112页。 （二）柱效能指标：对于一个色谱柱来说，其分离(fnl)能力（叫柱效能

30、）的大小主要与塔板的数目有关，塔板数越多，柱效能越高。 色谱柱的塔板数可以用理论塔板数和有效塔板数来表示。第68页/共112页第六十八页，共112页。式中：tR为某组分的保留时间； W1/2为某组分色谱峰的半宽度； W为色谱峰的峰底宽度。由式可见，柱子的理论塔板数与峰宽和保留时间有关(yugun)。保留时间越大，峰越窄，理论塔板数就越多。柱效能也就越高。221/25.54()16()RRttnww1理论塔板数n：一个柱子(zh zi)，其理论塔板数可由下式计算：第69页/共112页第六十九页，共112页。 对于一个柱长固定为L的柱子，其理论塔板高度H为 每一个塔板的高度，即组分在柱内每达成一次

31、分配平衡(pnghng)所需要的柱长叫理论塔板高度。它越小，也表示柱效能越高。LHn第70页/共112页第七十页，共112页。2有效塔板数n有效：在以上计算理论塔板数的式子中使用的是保留时间(shjin)，它包括了死时间(shjin)，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。为此，引入了有效塔板数的概念。221/25.54()16()RRttnww第71页/共112页第七十一页，共112页。同理有效(yuxio)塔板高度为：LHn有效有效第72页/共112页第七十二页，共112页。 (1) (1)当色谱柱长度一定时，塔板数当色谱柱长度一定时，塔板数 n n 越大越大( (塔板高

32、塔板高度度 H H 越小越小) )，被测组分在柱内被分配的次数越多，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 (2) (2)不同不同(b tn)(b tn)物质在同一色谱柱上的分配系物质在同一色谱柱上的分配系数不同数不同(b tn)(b tn)，用有效塔板数和有效塔板高度作，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。 (3) (3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数两组分的分配系数 K K 相同时，无论该色谱柱的塔板相同

33、时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。数多大，都无法分离。 (4) (4)塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。的途径。第73页/共112页第七十三页，共112页。三速率理论三速率理论范弟姆特方程式：范弟姆特方程式： 塔板理论是一个半经验性的理论。它塔板理论是一个半经验性的理论。它定性的给出了板高的概念，但不能指出影定性的给出了板高的概念，但不能指出影响板高的因素。速率理论就是在塔板理论响板高的因素。速率理论就是在塔板理论的基础的基础(jch)(jch)上，给出了影响塔板高度上，给出了影响塔板高度的因素：的因素： BHACuu第74页/共1

34、12页第七十四页，共112页。u 为流动相线速度； A，B，C为常数，其中 A分别表示涡流扩散系数(xsh)； B分子扩散系数(xsh)； C传质阻力系数(xsh)（包括液相和固相传质阻力系数(xsh)）。 该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。BHACuu第75页/共112页第七十五页，共112页。1 1）涡流）涡流(wli)(wli)扩散项扩散项(A)(A) 在填充柱中，由于受到固定相颗粒的在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的方

35、向，形成紊乱的“涡流涡流(wli)”(wli)”：从图：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性性同一组分运行路线长短不同同一组分运行路线长短不同流出流出时间不同时间不同峰形展宽。展宽程度以峰形展宽。展宽程度以A A表示表示：A=2A=2 dpdp其中其中dpdp填充物平均直径；填充物平均直径； 填充不规则填充不规则因子。因子。 可见，使用细粒的固定可见，使用细粒的固定(gdng)(gdng)相并填充均匀可减小相并填充均匀可减小A A，提高，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0A=0。流动流动(lidn

36、g)方向方向第76页/共112页第七十六页，共112页。第77页/共112页第七十七页，共112页。2 2）分子扩散项）分子扩散项(B/u)(B/u) 纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈注入色谱柱时，它呈“塞子塞子”状分布。随着状分布。随着(su (su zhe)zhe)流动相的推进，流动相的推进， “ “塞子塞子”因浓度梯度而向前后因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为B=2B=2 D D 称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的

37、阻碍情况；子扩散的阻碍情况；DD组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以，分别以DgDg或或DmDm表示；表示；第78页/共112页第七十八页，共112页。讨论： 分子量大的组分，Dg小，即B小Dg 随柱温升高而增加，随柱压降低而减小； 流动(lidng)相分子量大，Dg 小，即 B 小； u 增加，组份停留时间短，纵向扩散小；（B/u） 对于液相色谱，因Dm 较小，B 项可勿略。球状颗粒；大分子量流动相；适当增加流速(li s)；短柱；低温。第79页/共112页第七十九页，共112页。3 3）传质）传质(chun zh)(chun zh

38、)阻力项阻力项(Cu)(Cu) 因传质因传质(chun zh)(chun zh)阻力的存在，使分配不能阻力的存在，使分配不能“瞬间瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质(chun zh)(chun zh)过程不完全相同。下面分别作讨论。过程不完全相同。下面分别作讨论。a a）气液色谱：传质）气液色谱：传质(chun zh)(chun zh)阻力项阻力项C C包括气相传包括气相传质质(chun zh)(chun zh)阻力系数阻力系数CsCs和液相传质和液相传质

39、(chun zh)(chun zh)阻阻力系数力系数ClCl。222220.012 (1)3(1)pfglglddkkCCCkDkD第80页/共112页第八十页，共112页。流动相流动相固液界面固液界面固定液固定液组分分子组分分子ClCg第81页/共112页第八十一页，共112页。讨论：讨论： 减小填充颗粒直径减小填充颗粒直径dpdp； 采用分子量小的流动相，使采用分子量小的流动相，使DgDg增加；增加； 减小液膜厚度减小液膜厚度dfdf，ClCl下降。但此时下降。但此时k k又减小。又减小。 因此，当保持固定液含量不变时，可通过因此，当保持固定液含量不变时，可通过 增加固定液载体的比表面来降

40、低增加固定液载体的比表面来降低dfdf。但比。但比 表面过大又会因吸附表面过大又会因吸附(xf)(xf)过强使峰拖尾。过强使峰拖尾。 增加柱温，可增加增加柱温，可增加DlDl，但，但k k值也减小，为保值也减小，为保 持合适持合适ClCl值，应控制柱温。值，应控制柱温。第82页/共112页第八十二页，共112页。b b）液液色谱）液液色谱(s p)(s p)：传质阻力项：传质阻力项C C 包括流动相包括流动相传质阻力系数传质阻力系数Cm Cm 和固定相传质阻力系数和固定相传质阻力系数 Cs Cs。22m()msmpsfsmsddCCCDD sm第83页/共112页第八十三页，共112页。 讨论

41、： 流动相传质阻力包括两方面：流动相中的传质阻力Cm、滞留的流动相传 质阻力Cs 。分别与填充物大小 dp、扩散系数(Dm)、微孔大小及其数量等 有关。 因此，降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分(zfn)在 固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。 固定相传质阻力与液膜厚度df、保留因子 k 和扩散系数Ds等有关。 因此，降低固定相传质阻力的方法有：与气液色谱中液相传质阻力的表述相同。第84页/共112页第八十四页，共112页。 4）流速u 由方程 H = A + B/u + Cu知道： 当u一定时，仅在A、B、C 较小时，H 较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰

42、将展宽。 以 u 对 H 作 图 ， 可 得 H - u 曲 线( q x i n ) （ 如 图 ） ， 从 该 曲 线(qxin)得到：第85页/共112页第八十五页，共112页。板高，板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/u第86页/共112页第八十六页，共112页。涡流扩散项涡流扩散项A与流速与流速(li s)u无关；无关；低流速低流速(li s)区区(u小小)，B/u大，分子扩散项占主导，大，分子扩散项占主导， 此时选择分子量大的气体如此时选择分子量大的气体如N2和和Ar为载气，可为载气，可 减小扩散，提高柱效；减小扩散，提高柱效；高流速高流速(li s)区区(u

43、大大)，Cu大，传质阻力项占主导，大，传质阻力项占主导， 此时选择分子量小的气体如此时选择分子量小的气体如H2和和He为载气，为载气， 可增加扩散系数，提高柱效；可增加扩散系数，提高柱效； LC的的Hmin和和uopt均比均比GC的小一个的小一个(y )数量级数量级，即在，即在 LC中，较低流速可获得较大的柱效。中，较低流速可获得较大的柱效。 曲线的最低点对应最佳线速曲线的最低点对应最佳线速uopt( ) 下的下的 最小板高最小板高Hmin( )；/B C2ABC第87页/共112页第八十七页，共112页。5 5）固定相颗粒大小对板高的影响）固定相颗粒大小对板高的影响 实验表明，颗粒越细，板高

44、越小，受线速影响实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响越小。即，在越小。即，在HPLCHPLC分析中采用细粒作固定相的理论分析中采用细粒作固定相的理论(lln)(lln)根据！根据！ 但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现能实现HPLCHPLC的分析要求。的分析要求。第88页/共112页第八十八页，共112页。板高, H(cm)固定(gdng)相颗粒大小对板高的影响第89页/共112页第八十九页，共112页。 上面分别介绍了影响色谱分离的基本原理以及影响柱效的各种因素， 但 是 如 何 从 总 体 上 定 量(dngling)描述色谱分离效能？

45、如何将各种影响因素对分离的影响定量(dngling)地表述出来呢？第90页/共112页第九十页，共112页。2.4 分离度及色谱(s p)分离方程一、分离度(Resolution, R) 同 时 反 映 色 谱 柱 效 能 和 选 择 性 的 一 个 综 合(zngh)指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：第91页/共112页第九十一页，共112页。21212112122()()1()2rrrrrrttttttRWWWWW用此式，可直接从用此式，可直接从色谱色谱(s p)(s p)流出曲线上求出分离度流出曲线上求出分离度R R。第92页/共112页第九十二页，共112页。色谱分离中的四种

46、色谱分离中的四种(s zhn)典型典型情况情况 分离效果分离效果(xiogu)(xiogu)差，柱效差，柱效低，选择性（低，选择性（ ）低）低 完全分离，柱效高，峰窄，完全分离，柱效高，峰窄，选择性（选择性（ ）低）低 ；完全分离，选择性（完全分离，选择性（ ）增）增加，柱效低，峰宽加，柱效低，峰宽完全分离，柱效高，选择性完全分离，柱效高，选择性（）好）好第93页/共112页第九十三页，共112页。R 越 大 ， 相 邻 组 分 分 离 越 好 。 当R=1.5 时，分离程度可达99.7%，因此R=1.5 通常用作是否分开(fn ki)的判据。第94页/共112页第九十四页，共112页。R=1

47、.5R=0.75R=1.0响应信号响应信号保留时间保留时间 t, min第95页/共112页第九十五页，共112页。eff1()()41n1()4nkRkR或二、色谱分离方程二、色谱分离方程 R 的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，R 未与影响其大小的因素：柱效未与影响其大小的因素：柱效n、选择、选择(xunz)因子因子 和保留和保留因子因子 k 联系起来。联系起来。 对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数 K 相差小，相差小，可合理假设可合理假设k1 k2=k，W1 W2=W。因此可导出。因此可

48、导出R与与n、 和和 k 的关系：的关系：第96页/共112页第九十六页，共112页。有关色谱方程的讨论：有关色谱方程的讨论：1 1）分离度）分离度R R 与柱效的关系与柱效的关系 分离度分离度R R与理论塔板数与理论塔板数n n 有关，即有关，即R R 受热力学性质的受热力学性质的影响。影响。 对具一定相对保留值对具一定相对保留值 的物质对，的物质对，R R与有效塔板数与有效塔板数neffneff有关，说明有关，说明neffneff可正确可正确(zhngqu)(zhngqu)代表柱效能。代表柱效能。 由色谱方程可得：由色谱方程可得：2111222()RnLRnL因此可通过增加柱长提高分离度。

49、然而，分析时间也相应因此可通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度 H H 的的方法方法(fngf)(fngf)比增加柱长更有效。比增加柱长更有效。第97页/共112页第九十七页，共112页。2 2）分离度）分离度R R与保留因子与保留因子 的关系的关系(gun x)(gun x) 越大，柱选择性越好，对分离有利。越大，柱选择性越好，对分离有利。 的微的微小变化可引起小变化可引起 R R 较大改变。如，当较大改变。如，当 从从1.011.01增加增加至至1.10(1.10(增加增加9% )9% )时

50、，时，R R 则增加则增加 9 9 倍倍( (但但 1.5, R1.5, R增加不大增加不大) ) 。 改变改变 的方法有：降低柱温、改变流动相及固的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。定相的性质和组成。 第98页/共112页第九十八页，共112页。3）分离度R 分配比 k 的关系 k 增加(zngji)，分离度R 增加(zngji)，但当k10，则R的增加(zngji)不明显。通常k在210之间。 改 变 k 的 方 法 有 ： 适 当 增 加(zngji)柱温(GC)、改变流动相性质和组成(LC)以及固定相含量。第99页/共112页第九十九页，共112页。70%CH3OH+3

51、0H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂溶剂( (流动相流动相) )组成对色谱分离的影响组成对色谱分离的影响( (液相色谱梯度淋洗液相色谱梯度淋洗) )1 1：9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；2 2：2-2-甲基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；3 3：2-2-乙基乙基-9,10-9,10-蒽醌蒽醌4 4：1,4-1,4-二甲基二甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；5 5：2-2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；改变组成使 k 最佳第100页/共112页第一百页，共112页。色谱分离中的问题色谱分离中的问题 由于分析物组成复杂，某一组成的流动由于分析物组成复杂，某一组成的流动(lidng)相可能相可能使部分待测物得到好的分离，但同时又使其它待测物的分使部分待测物得到好的分离，但同时又使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温（离不令人满意！实际工作中采用程序升温（GC）和梯度淋）和梯度淋洗（洗（LC）来解决这个问题。）来解决这个问题。第101页/共112页第一百零一页，共112页。三、分析三、分析(f