分析化学第九章吸光光度法

1、 第九章第九章第九章第九章第九章第九章 吸吸吸吸吸吸 光光光光光光 光光光光光光 度度度度度度 法法法法法法第第 一一 节节 概述概述第第 二二 节节 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第第 三三 节节 光度计及其基本部件光度计及其基本部件第第 四四 节节 显色反应及显色条件的选择显色反应及显色条件的选择 第第 五五 节节 吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择第第 六六 节节 吸光光度法的应用吸光光度法的应用 概概 述述 基于物质光化学性质而建立起来基于物质光化学性质而建立起来的分析方法称之为光化学分析法。的分析方法称之为光化学分析法。 光谱分析法是指在光（或其它能光谱分析法是指在光

2、（或其它能量）的作用下，通过测量物质产生的量）的作用下，通过测量物质产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强发射光、吸收光或散射光的波长和强度来进行分析的方法。度来进行分析的方法。 吸收光谱分析吸收光谱分析 ( (吸光光度分析法吸光光度分析法) ) 发射光谱分析发射光谱分析概述概述: 在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法分析方法称为吸光光度法, ,主要有主要有: : 红外吸收光谱：红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围分子振动光谱，吸收光波长范围2.5 1000 m ,主要用于有机化合物结构鉴定。主要用于有

3、机化合物结构鉴定。 紫外吸收光谱：紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围电子跃迁光谱，吸收光波长范围200 400 nm（近紫外区）近紫外区） ，可用于结构鉴定和定量分析。，可用于结构鉴定和定量分析。 可见吸收光谱：可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围电子跃迁光谱，吸收光波长范围400 750 nm ，主要用于有色物质的定量分析。主要用于有色物质的定量分析。 本章主要讲授可见吸光光度法。本章主要讲授可见吸光光度法。例题例题: 含含FeFe量量0.001%0.001%的试样，称的试样，称WW试试1 1g g，仅含仅含0.010.01mgFemgFe，用用1.61.61010-3 -3m

4、olmolL L-1 -1K K2 2CrCr2 2O O7 7滴定滴定, ,用去用去 V VK K2 2CrCr2 2O O7 7? ? 0.010.01mg=1/6 mg=1/6 1.6 1.6 10 10-3 -3 V V MMfe fe V VK K2 2CrCr2 2O O7 7=0.02ml=0.02ml 滴定法误差大，可采用吸光光度法滴定法误差大，可采用吸光光度法. . 比较溶液颜色深浅来测定物质浓度的方法。比较溶液颜色深浅来测定物质浓度的方法。( (可见光区可见光区) )特点：灵敏度高特点：灵敏度高1010-5 -5 1010-6 -6 准确度高准确度高2 2 5%5% 操作方

5、便、快速、操作方便、快速、 价格便宜、应用广泛。价格便宜、应用广泛。 第第 一一 节节 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理 光的互补光的互补： 蓝蓝 黄黄物质颜色 吸收光颜色波长/nm黄绿紫400-450黄蓝450-480橙绿蓝480-490红蓝绿490-500紫红绿500-560紫黄绿560-580蓝黄580-600绿蓝橙600-650蓝绿红650-780吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理 1 1光的基本性质光的基本性质 光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用 波长波长 、频率、频率 、光速、光速c、波数（波数（cm-1）等参

6、数来描述：等参数来描述： = c ； 波数波数 = 1/ = /c 光是由光子流组成，光子的能量：光是由光子流组成，光子的能量： E = h = h c / （Planck常数常数：h=6.626 10 -34 J S ) 光的波长越短（频率越高），其能量越大。光的波长越短（频率越高），其能量越大。 白光白光(太阳光太阳光)：由各种单色光组成的复合光：由各种单色光组成的复合光 单色光单色光：单波长的光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成由具有相同能量的光子组成)2. 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收-吸收曲线吸收曲线M + 热热M + 荧光或磷光荧光或磷光 E = E2 - E1 =

7、 h 量子化量子化 ；选择性吸收；选择性吸收; M + h M *基态基态 激发态激发态E1 （E） E2 分子结构的复杂性使其对分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度；不同波长光的吸收程度； 用不同波长的单色光照用不同波长的单色光照射射 Ci ，测吸光度测吸光度 吸收曲吸收曲线与最大吸收波长线与最大吸收波长 max；吸收曲线的讨论：吸收曲线的讨论：（1） 吸光度最大处对应的波长吸光度最大处对应的波长 称为称为最大吸收波长最大吸收波长max（2）不同物质其吸收曲线形状和不同物质其吸收曲线形状和max各不相同，可以提供物质各不相同，可以提供物质 的结的结构信息构信息 定性分析的依据之一。定性

8、分析的依据之一。（3）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下不同浓度的同一种物质，在某一定波长下 A 有差异，有差异， 定量分析的依据。定量分析的依据。 在在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，测定最灵敏。处吸光度随浓度变化的幅度最大，测定最灵敏。 定量分析中选择入射光波长定量分析中选择入射光波长3、光的吸收定律、光的吸收定律 1).1).朗伯朗伯比耳定律比耳定律 布格布格( (BouguerBouguer) )和朗伯和朗伯( (Lambert)Lambert)先后于先后于17291729年和年和17601760年年 阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。

9、A A b b A= lg(I0/It) = k1b 18521852年比耳年比耳( (Beer)Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物又提出了光的吸收程度和吸收物 浓浓度之间也具有类似的关系。度之间也具有类似的关系。 A A c c A= lg(I0/It) = k2c 朗伯朗伯比耳定律为：比耳定律为： Alg（I0/It)= bc 朗伯朗伯比耳定律数学表达式比耳定律数学表达式 Alg（I0/It) = b c 式中式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；吸光度；描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度液层厚度(光程长度光程长度) cm； c：溶液的摩尔浓度溶液的摩尔浓度 molL； ：摩尔吸

10、光系数摩尔吸光系数 Lmolcm； 或或: Alg（I0/It) = a b c c：溶液的浓度溶液的浓度 gL a：吸光系数吸光系数 Lgcm a与与的关系为：的关系为： a =/M （M为摩尔质量）为摩尔质量） 透光度透光度(透光率透光率)T透过度透过度T : 入射光透过溶液的程度入射光透过溶液的程度: T = I t / I0吸光度吸光度A与透光度与透光度T的关系的关系: A lg T =Ig 1/T = b c 朗伯朗伯比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的 依据。应用于各种光度法的吸收测量；依据。应用于各种光度法的吸收测量； 摩尔吸光系数

11、摩尔吸光系数在数值上等于浓度为在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚液层厚 度为度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度；时该溶液在某一波长下的吸光度； 吸光系数吸光系数a(Lg-1cm-1）相当于浓度为相当于浓度为1 g/L、液层厚度为液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。时该溶液在某一波长下的吸光度。2).2).摩尔吸光系数摩尔吸光系数的讨论的讨论（1 1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数特征常数；（2 2）不随浓度不随浓度 c c 和光程长度和光程长度 b b 的改变而改变的改变而改变。温度和波长等。温度和波长等条件一定时，条件一定时， 仅

12、与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关度无关, ,可作为可作为定性鉴定的参数定性鉴定的参数；（3）同一吸收物质在不同波长下的同一吸收物质在不同波长下的值是不同的。值是不同的。max处的处的摩尔吸光系数，常以摩尔吸光系数，常以max表示。表示。max表明了该表明了该吸收物质最大限吸收物质最大限度的吸光能力度的吸光能力。（4 4）max越大，吸光能力越强，该物质的灵敏度越高。物质越大，吸光能力越强，该物质的灵敏度越高。物质吸光能力的量度。吸光能力的量度。 105：超高灵敏；：超高灵敏； 朗伯朗伯-比耳定律的物理意义：比耳定律的物理意义： A= b c(1)

13、(1) 当一束平行单色光通过单一均匀、非散射的吸光物质溶液时当一束平行单色光通过单一均匀、非散射的吸光物质溶液时，溶液的，溶液的 A与与 C 成正比；成正比；(2)(2)此定律适用于溶液，也适用于其它均匀、非散射的吸此定律适用于溶液，也适用于其它均匀、非散射的吸 光物质光物质( (气体和固体气体和固体) )是各类吸光光度法定量的依据。是各类吸光光度法定量的依据。(3)(3)多组分体系中，各种吸光物质之间没有相互作用时，体系的多组分体系中，各种吸光物质之间没有相互作用时，体系的吸光度具有加和性。吸光度具有加和性。A A总总= =A A1 1+ +A A2 2+ +A A3 3+ +A+An n

14、= =1b c1+ 2b c2+ +nb cn3).3).偏离朗伯偏离朗伯比耳定律的原因比耳定律的原因 标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯为对朗伯比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。 引起这种偏离的因素（两大类）：引起这种偏离的因素（两大类）： 物理性因素物理性因素 化学性因素化学性因素（1）物理性因素物理性因素朗朗伯伯比耳定律的前提条件之一比耳定律的前提条件之一： 平行单色光平行单色光 难以获得真正的纯单色光难以获得真正的纯单色光分光光度计

15、只能获得近乎单色的狭窄光带。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯复合光可导致对朗伯比耳定律的正或负偏离。比耳定律的正或负偏离。 非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯比耳比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。 非单色光作为入射光引起的偏离非单色光作为入射光引起的偏离 假设由波长为假设由波长为1和和2的两单色光的两单色光组成的入射光通过浓度为组成的入射光通过浓度为c的溶液，则：的溶液，则： A 1lg（o1 /t1 ）1bc A 2lg(o2 /t2 ）2bc

16、故：故：式中：式中：o1、o2分别为分别为1、2 的入射光强度；的入射光强度； t1、t2分别为分别为1、2 的透射光强度；的透射光强度； 1、2分别为分别为1、2的摩尔吸光系数；的摩尔吸光系数；因实际上只能测总吸光度因实际上只能测总吸光度A总总，并不能分别测得，并不能分别测得A1和和A2，故故cbcbIIII 212111OtOt10;10 I0总总= I01+I02 It= It1+It2 A总总 A1 +A2=lg（o总总/t总总 ) lg(Io1+o2)/(t1+t2) lg(Io1+o2)/(o110-1bc +o210-2bc ) 讨论讨论: 1 A1= lg (I01/It1)

17、It1= I0110- 1bc 2 A2= lg (I02/It2) It2= I0210- 2bc)10I10I()II(LgAbc 0bc 0021 讨论讨论: :1) = 0； 即：即： 1= 2 = 则则: A总总 lg（o/t） bc A与与C成成直线关系直线关系2) 很小时，即很小时，即12： 可近似认为是单色光。可近似认为是单色光。 在低浓度范围内，不发生偏离。在低浓度范围内，不发生偏离。 若浓度较高，即使若浓度较高，即使 很小，很小， A总总 1 ， 且随着且随着c值增大，值增大， A总总 与与A 1的差异愈大。的差异愈大。 故朗伯故朗伯比耳定律只适用于稀溶液比耳定律只适用于稀

18、溶液)10I10I()II(LgAbc 0bc 0021 讨论讨论: : 3) 0 若若 0 , 即即 20, 则标准曲线偏离直线则标准曲线偏离直线 4) 为克服非单色光引起的偏离，为克服非单色光引起的偏离， 首先应首先应选择比较好的单色器。选择比较好的单色器。 此外还应将入射波长选定在待测物质的此外还应将入射波长选定在待测物质的 最大吸收波长且吸收曲线最大吸收波长且吸收曲线 较平坦处。较平坦处。)10I10I()II(LgAbc 0bc 0021 (2) (2) 化学性因素化学性因素a. a. 朗朗比定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；比定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用

19、； 当当c 10 2 mol/L 时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用, 直接影响了对光的吸收。直接影响了对光的吸收。 故：朗伯故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液比耳定律只适用于稀溶液。b. 化学体系化学体系 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。 例：例： 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡： CrO42- 2H = Cr2O72- H2O 溶液中溶液中CrO42-、

20、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同的颜色不同，吸光性质也不相同故此时溶液故此时溶液pH 对测定有重要影响。对测定有重要影响。c. 其它（吸收池尺寸，其它（吸收池尺寸， 参比液等）参比液等） 第二节、光度计及其基本部件第二节、光度计及其基本部件 一、 目视比色法：目视比色法： 用眼睛比较溶液颜色的深浅用眼睛比较溶液颜色的深浅 一套一套比色管各加入不等量的标准溶液及待测溶液、比色管各加入不等量的标准溶液及待测溶液、等量的显色剂、其他试剂，稀释到刻度。比色。等量的显色剂、其他试剂，稀释到刻度。比色。 C C1 1 C C2 2 C Cn n C Cx x 优点：优点：设备简单、方便；设备简单

21、、方便； 缺点：缺点：准确度不高准确度不高二、光度计的基本部件二、光度计的基本部件 优点：优点： a. a.仪器代替人眼，准确度高；仪器代替人眼，准确度高； b. b.有色物质共存时，可提高选择性；有色物质共存时，可提高选择性； c. c.分析大批试样时速度快。分析大批试样时速度快。仪器仪器 可见分光光度计仪器仪器 紫外-可见分光光度计一、基本组成一、基本组成光源单色器样品室检测器显示1.1. 光源光源 （钨灯钨灯 、氢、氘灯氢、氘灯） 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性。够的辐射强度、较好的稳定性。

22、光强度随灯丝温度变化光强度随灯丝温度变化而变，温度高，光强度增而变，温度高，光强度增大，灯寿命短。大，灯寿命短。 灯温度取决于电压，要灯温度取决于电压，要保持光强不变，必须使用保持光强不变，必须使用稳压电源。稳压电源。 （动画动画） 2.2.单色器单色器 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。单色光的光学系统。 入射狭缝：光源的光由此进入单色器；入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 准光装置：透镜或反射镜使入射光成为平行光束；准光装置：透镜或反射镜使入射光成为平行光束； 色散元件：将复合光分解成单色光；色散元件：将复

23、合光分解成单色光；棱镜或光栅棱镜或光栅；( (光学光学 部件应保持清洁部件应保持清洁) ) 聚焦装置：透镜或凹面反聚焦装置：透镜或凹面反 射镜，将分光后所得单色射镜，将分光后所得单色 光聚焦至出射狭缝；光聚焦至出射狭缝； 出射狭缝。出射狭缝。3. 3. 样品室样品室 各种类型的吸收各种类型的吸收池池（比色皿）和相（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。池和玻璃池两种。 紫外区须采用石英池，紫外区须采用石英池， 可见区一般用玻璃池。可见区一般用玻璃池。4. 4. 检测器检测器 利用光电效应将光信号变成可利用光电效应将光信号变成可测的电信号测的电信

24、号. . 常用的有光电池、光电管或光常用的有光电池、光电管或光电倍增管。电倍增管。特点：特点：a a. .对透过光响应时间短；对透过光响应时间短； b b. .光电流与照射到检测器上的光强度成正比；光电流与照射到检测器上的光强度成正比； c c. .灵敏度高。灵敏度高。光电管或光电倍增管。光电管或光电倍增管。5. 5. 结果显示记录系结果显示记录系统统 检流计、数字显示、检流计、数字显示、 微机进行仪器自动控制微机进行仪器自动控制 和结果处理和结果处理 光光光敏阴极上光敏阴极上光电子光电子e ee e射向光敏阴极射向光敏阴极1 1更多的更多的e e. .依依次倍增，在最后放出的光电子次倍增，在

25、最后放出的光电子比最初多到比最初多到10106 6倍以上倍以上; ; 最大电流可达最大电流可达 10 10AA，电流经电流经负载电阻转变为电压信号送入负载电阻转变为电压信号送入放大器。放大器。第三节第三节、显色反应、显色反应及及显色显色条件条件的选择的选择一一、显色反应的选择、显色反应的选择 待测组份待测组份 + + 显色剂显色剂 = = 有色有色配配合物合物 1 1、显色反应的显色反应的要求要求 灵敏度高灵敏度高 ( =104105) ; 选择性好、选择性好、 生成物稳定生成物稳定; (至少在测定过程中吸光度不变至少在测定过程中吸光度不变) 显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明

26、显吸收， 两种有色物质最大吸收波长之差：两种有色物质最大吸收波长之差： “对比度对比度”， 要求要求 60nm。2 2、显色反应显色反应类型类型 配位显色反应配位显色反应 M + R = MRM + R = MR 当金属离子与有机显色剂形成配合物时，当金属离子与有机显色剂形成配合物时， 通常会发生电通常会发生电 荷转移跃迁，产生很强的紫外荷转移跃迁，产生很强的紫外可见吸收光谱。可见吸收光谱。 氧化还原显色反应氧化还原显色反应 某些元素的氧化态，如某些元素的氧化态，如Mn（）、）、Cr（）在紫外或可在紫外或可见光区能强烈吸收，可利用氧化还原反应对待测离子进行显色见光区能强烈吸收，可利用氧化还原反

27、应对待测离子进行显色后测定。后测定。 例如：钢中微量锰的测定，例如：钢中微量锰的测定，Mn2不能直接进行光度测定不能直接进行光度测定 2 Mn2 5 S2O82-8 H2O =2 MnO4-1 + 10 SO42- 16H+ 在在525 nm处进行测定。处进行测定。3.3.显色剂显色剂 无机显色剂：无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。 有机显色剂：有机显色剂：种类繁多种类繁多 偶氮类显色剂偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成配合物后，颜色本身是有色物质，生成配合物后，颜色发生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择发生明显变化；具有性质稳定、显色

28、反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂、PARPAR等等。 三苯甲烷类三苯甲烷类：铬天青铬天青S S、二甲酚橙等、二甲酚橙等二、显色反应条件的选择二、显色反应条件的选择 X+ X+ nRnR = = XRnXRn1.1.显色剂用量显色剂用量 固定待测组分的浓度、固定待测组分的浓度、PHPH， 改变显色剂的浓度。改变显色剂的浓度。 作作A-CA-CR R曲线曲线 选择曲线变化平坦处。选择曲线变化平坦处。2.2.反应体系的酸度反应体系的酸度 显色显色剂剂 HR HR H H+ + + R+ R- - 在相同实验条件下，在相同实验条件下，

29、作作A-pH A-pH 曲线曲线 3.3.显色时间与温度显色时间与温度 实验确定实验确定4.4.溶剂溶剂 一般尽量采用水相测定一般尽量采用水相测定三、共存离子干扰的消除三、共存离子干扰的消除 共存离子本身有颜色或能与显色剂生成有色共存离子本身有颜色或能与显色剂生成有色配配合物合物1.1.加入掩蔽剂加入掩蔽剂 配位、氧化还原配位、氧化还原掩蔽掩蔽 选择掩蔽剂的原则：选择掩蔽剂的原则： 掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂不与待测组分反应； 掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定的测定。例：测定例：测定TiTi4 4，可加入可加入H

30、 H3 3POPO4 4掩蔽剂使掩蔽剂使FeFe3+3+( (黄色黄色) )成为成为 Fe(PO Fe(PO) )2 23- 3-( (无色无色) )，消除，消除FeFe3+3+的干扰；的干扰； 又如用铬天菁又如用铬天菁S S光度法测定光度法测定AlAl3+3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将FeFe3+3+还原为还原为FeFe2+2+，消除消除FeFe3+3+的干扰。的干扰。2. 2.选择适当的显色反应条件选择适当的显色反应条件3. 3.分离干扰离子分离干扰离子 沉淀，离子交换，溶剂萃取沉淀，离子交换，溶剂萃取 第第四四节节 测定条件的选择测定条件的选择1.1.选择适当的入射波长选择适当的入射波长 一般应该选择一般应该选择 maxmax为入射光波长。为入射光波长。 如果如果 maxmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。低