Weastern Blot 操作方法 图文

1、 为什么要作蛋白质印迹实验？为什么要作蛋白质印迹实验？ 目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析 单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 原理：在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。l1、蛋白样品的制备、蛋白样品的制备2、SDS-PAGE3、转膜、转膜4、封闭、封闭5、一抗杂交、一抗杂交6、二抗杂交、二抗杂交7、底物显色、底物显色 2SDS-PAGE上样缓冲液：上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH6.8)10 m

2、l1M DTT20 mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚蓝溴酚蓝0.2 g总体积总体积100mlSDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入是在蛋白质样品中加入SDSSDS和含有巯基乙醇的和含有巯基乙醇的样品处理液，样品处理液，是一种很强的是一种很强的，它可，它可以以，破坏蛋白质分子的二级，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。和三级结构。强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTTDTT）可以可以断开二硫断开二硫键破坏蛋白质的四级结构键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与形成单链分子。解聚后的侧链

3、与SDSSDS充分结合形成带负电充分结合形成带负电荷的蛋白质荷的蛋白质-SDS-SDS复合物。复合物。蛋白质分子结合蛋白质分子结合SDSSDS阴离子后，所带负电荷的量远远超阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。，而与其所带电荷的性质无关。 PAGE： 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)(polyacrylamide g

4、el)是由单体丙烯酰是由单体丙烯酰胺胺(acrylamide(acrylamide，简称，简称Acr)Acr)和交联剂和交联剂(crosslinker)(crosslinker)N,NN,N- -亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺(N,N(N,N-methylenebisacylamide-methylenebisacylamide，简称简称Bis)Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。度。是良好的电泳介质。2.2 2.2

5、 凝胶成分凝胶成分M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵MTris-甘氨酸电泳缓冲液单体：丙烯酰胺（单体：丙烯酰胺（Acr）；）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；）；加速剂：四甲基乙二胺（加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；）；产物：三维网状结构凝胶产物：三维网状结构凝胶2.3 SDS-PAGE浓缩胶浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方表：及分离胶配方表：http:/ 作用作用缓冲液缓冲液PHPH凝胶浓度凝胶浓度浓缩浓缩胶胶使蛋白样品浓缩pH

6、6.8Tris-Cl低，2-5%分离分离胶胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小灌制分离胶灌制分离胶 隔绝空气隔绝空气灌制积层胶灌制积层胶 插入梳子插入梳子 Staking gelSeparating gel电泳条件：推荐：浓缩胶 80V 1525min 分离胶 120V 6080min2.3 预混分子量标准 高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准 预染分子量标准 单色预染 多色预染 修饰分子量标准 原因：校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差 种类：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin 用法： 二抗孵育时加入HRP标记内参抗体 分子量大小相差比较明

7、显 2.4 要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹毛细管印迹法和电泳印迹法法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。3.1 湿转湿转半干转半干转半干式转膜速度快，适合与小分子量蛋白湿式成功率高并特别适合用于分子量大于 100KD的蛋白两种方法的转膜液不同！方法方法仪器仪器特点特点为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，常用的封闭液：脱脂奶粉（5） 封闭条件： 室温封闭1 hour，再用 TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。

8、 把PVDF膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，按照抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释抗体；摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次15min。 加入TBST配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次15min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。显色方法显色方法代表类型代表类型特点特点酶促底物发光法 DAB显色法稳定性好，灵敏度较高（250pg），背景一般，成像性较差，药品疑有一定致癌性。 化学发光法 （推荐使用）ECL发光法稳定性好，灵敏度高（10-12g），背景可以很低，成像性好

9、，且可以重复标记，暗室操作！A液B液11: 膜混合ECL工作液滴加ECL工作液 显影、定影目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。？ 转移到膜上的蛋白很少1.1.蛋白分子量蛋白分子量 10KD10KD2.2.SDSSDS浓度不合适浓度不合适3.3.凝胶太厚凝胶太厚 原因原因对对策策1.1.蛋白分子量蛋白分子量10KD10KD时，减时，减少转膜时间；使用小孔径少转膜时间；使用小孔径的膜的膜2.2.在阴极在阴极bufferbuffer中加入中加入0.005 - 0.01% SDS 0.005 - 0.01% SDS 可提可提高转膜效率高转膜效率3.3.延长

10、转膜时间延长转膜时间1.1.膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿2.2.膜或者缓冲液污染膜或者缓冲液污染3.3.封闭不充分封闭不充分4.4.抗体与封闭剂出现交抗体与封闭剂出现交叉反应叉反应5.5.抗体浓度过高抗体浓度过高 原因原因对对策策1.1.转膜前用转膜前用100%100%甲醇将膜完甲醇将膜完全浸湿全浸湿2.2.拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液3.3.检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应4.4.杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度背景太高杂交信号很弱1.1.抗体保存不当抗体保存不当2.2.抗原不充足抗原不充足3.3.膜的漂洗过度膜的漂洗过度 原因原因对对策策1.1.抗体长期保存应在抗体长期保存应在7070，使用前做效价检测，使用前做效价检测2.2.增加蛋白上样量，做已知增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照标准量蛋白的对照3.3.减少漂洗的时间和次数减少漂洗的时间和次数1.1.一抗不是唯一特一抗不是唯一特异的异的2.2.二抗出现非特异二抗出现非特异结合结合 原因原因对对策策1.1.制备单克隆抗体或者重新选制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点取合成抗原多肽的位点2.2.设立不加一抗，只加二抗的设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有平行对照来检测二抗