普通免疫学-8-2014-单克隆抗体

1、普通免疫学(Immunology) 抗体制备与抗原抗体反应及应用抗体制备与抗原抗体反应及应用 抗体的制备（多克隆与单克隆抗体）抗体的制备（多克隆与单克隆抗体）基因工程抗体的制备基因工程抗体的制备主要的抗原抗体反应主要的抗原抗体反应免疫学在生物学中的应用免疫学在生物学中的应用抗体的制备（多克隆与单克隆抗体）抗体的制备（多克隆与单克隆抗体）什么是多克隆抗体什么是多克隆抗体(polyclonal antibody，pAb)?抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做子结构，叫做抗原决定簇抗原决定簇。一个抗原上可。一个抗原上可以有以有许多不同的抗原决定簇许多不

2、同的抗原决定簇，因而使机体，因而使机体产生产生许多许多不同的抗体。不同的抗体。 用包含用包含多种抗原决定簇多种抗原决定簇的抗原物质免的抗原物质免疫动物，从而刺激多个疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。因此，所获得多种抗原表位的不同抗体。因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。物，称为多克隆抗体。 另一方面，即使是同一个抗原决定簇，另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由在机体内也可以由好几种克隆好几种克隆来产生抗体，来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，也称为多形成好几种单克隆

3、抗体混杂物，也称为多克隆抗体。克隆抗体。 The immune response to an antigen generally involves the activation of multiple B-cells all of which target a specific epitope on that antigen. As a result a large number of antibodies are produced with different specificities and epitope affinities these are known as polyclonal

4、 antibodies.可以制作可以制作“生物导弹生物导弹”。 多克隆抗体通常用兔制备的多克隆抗体通常用兔制备的多克隆抗体通常用什么制备的多克隆抗体通常用什么制备的?多克隆抗体具有多克隆抗体具有异质性异质性：如何表示？等：如何表示？等电聚焦实验能揭示多克隆抗体中的各种电聚焦实验能揭示多克隆抗体中的各种抗体具有不同的等电点。抗体具有不同的等电点。等电聚焦实验：等电聚焦实验： 蛋白质在蛋白质在pHpH梯度胶中电梯度胶中电泳，每个分子沿着泳，每个分子沿着pHpH梯度迁移至电荷为梯度迁移至电荷为中性的相应中性的相应pHpH位置，并在此点积聚。位置，并在此点积聚。抗血清的缺陷：抗血清的缺陷： 每一种抗血

5、清都不同于其他任何的每一种抗血清都不同于其他任何的抗血清，即使选用遗传背景完全相同的抗血清，即使选用遗传背景完全相同的动物，采用相同的抗原制剂和相同的免动物，采用相同的抗原制剂和相同的免疫程序。疫程序。 产生的抗血清只能是有限的数量，产生的抗血清只能是有限的数量，因此同一份血清制剂不可能长期使用或因此同一份血清制剂不可能长期使用或完成一系列复杂的实验或临床检测。完成一系列复杂的实验或临床检测。 即使是用亲和层析技术纯化的抗体即使是用亲和层析技术纯化的抗体也可能包含少量引起交叉反应的抗体，也可能包含少量引起交叉反应的抗体，干扰对实验的分析。干扰对实验的分析。怎么办怎么办? ? 发展一种无限量能产

6、生结构均一且已知发展一种无限量能产生结构均一且已知特异性的抗体分子方法。特异性的抗体分子方法。 1975年年Khler和和Milstein首先报道用细首先报道用细胞杂交技术使经绵羊红细胞（胞杂交技术使经绵羊红细胞（SRBC)免疫免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立起第建立起第一个一个B细胞杂交瘤细胞株细胞杂交瘤细胞株,并成功地制得抗并成功地制得抗SRBC的单克隆抗体（的单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）。迄今世界已研制成数以千计的）。迄今世界已研制成数以千计的McAb。for theories concerning the speci

7、ficity in development and control of the immune system and the discovery of the principle for production of monoclonal antibodiesJerne Khler MilsteinThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 由一种克隆产生的针对一种细胞表位由一种克隆产生的针对一种细胞表位的特异性抗体叫做单克隆抗体。的特异性抗体叫做单克隆抗体。Monoclonal antibodies represent a single B l

8、ymphocyte generating antibodies to one specific epitope. 单克隆抗体为单一种单克隆抗体为单一种B B细胞克隆所产细胞克隆所产生的一种均一的免疫球蛋白，是一种独特生的一种均一的免疫球蛋白，是一种独特型的抗体。它的特异性是针对一个抗原决型的抗体。它的特异性是针对一个抗原决定簇的。定簇的。 如何获得如何获得针对一种细胞表位针对一种细胞表位的特异性抗体的特异性抗体? ?问题一问题一: :有关有关单克隆抗体单克隆抗体生产的实际问题生产的实际问题? ?问题二问题二: :如何如何大量无限大量无限地生产地生产单克隆抗体单克隆抗体? ?选择什么样的细胞选择

9、什么样的细胞? ? 生产单克隆抗体的原理生产单克隆抗体的原理 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，因此能在体外长期培养，但不能分泌特异性因此能在体外长期培养，但不能分泌特异性抗体；抗体； B B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖，因此不能长期培养。外不能无限增殖，因此不能长期培养。 免疫动物的免疫动物的脾细胞脾细胞与与骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合后融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫性

10、，又具有免疫B B细胞合成和分泌特异性抗细胞合成和分泌特异性抗体的能力。体的能力。在制备杂交瘤过程中的一个问题是什么？在制备杂交瘤过程中的一个问题是什么？如何解决？如何解决？让未成杂交瘤的骨髓瘤细胞和脾脏细胞去死让未成杂交瘤的骨髓瘤细胞和脾脏细胞去死 HAT HAT培养基培养基 含有含有次黄嘌呤次黄嘌呤(H)(H)、氨基、氨基喋呤喋呤(A)(A)和胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶核苷(T)(T)中进行选择性中进行选择性培养。培养。 5-磷酸核糖磷酸核糖焦磷酸尿嘧焦磷酸尿嘧啶啶RNADNA 次黄嘌呤（次黄嘌呤（H） 胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T）氨基蝶呤氨基蝶呤 （A）合成主要途径合成主要途径 合成替代途径合成

11、替代途径 TKHPGRTHPGRT：次黄嘌呤鸟嘌呤核苷转移酶：次黄嘌呤鸟嘌呤核苷转移酶TK：胸腺嘧啶激酶：胸腺嘧啶激酶 未融合的脾细胞因不能在体外长期存未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成核酸活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成核酸的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又又因缺乏次黄嘌呤因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤鸟嘌呤-磷酸核糖转移磷酸核糖转移酶（酶（HGPRT），不能利用培养基中的次，不能利用培养基中的次黄嘌呤合成核酸而死亡。黄嘌呤合成核酸而死亡。 融合的杂交瘤细胞由于从脾脏细胞获融合的杂交瘤细胞由于从脾脏细胞获得了次黄嘌呤得了次黄嘌呤-

12、鸟嘌呤鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，磷酸核糖转移酶，因此能在因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。即可无限制地大量制备单克隆抗体。 未融合的亲代脾脏细胞寿命有未融合的亲代脾脏细胞寿命有限，不久就死亡了。限，不久就死亡了。问题一问题一 三、单克隆抗体的制备过程三、单克隆抗体的制备过程 杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：（1）抗原制备；）抗原制备；（2）免疫动物

13、；）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备； （4）细胞融合；）细胞融合； （5）杂交瘤细胞的选择培养；）杂交瘤细胞的选择培养； （6）杂交瘤细胞的筛选；）杂交瘤细胞的筛选； （7）杂交瘤细胞的克隆化；）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定；）单克隆抗体的检定； （9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立； （10）单克隆抗体的大量制备。）单克隆抗体的大量制备。1 1、免疫动物免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏使小鼠产生致敏B B淋巴细胞的过程。淋巴细胞的过程。 一般选

14、用一般选用6-6-8 8周龄雌性周龄雌性Balb/cBalb/c小鼠，按照预先制定的免疫方小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应进入外周免疫器官，刺激相应B B淋巴细胞克隆，使淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏其活化、增殖，并分化成为致敏B B淋巴细胞。淋巴细胞。 2 2、细胞融合细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细将

15、准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 3 3、选择性培养选择性培养 选择性培养的目的是筛选选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用融合的杂交瘤细胞，一般采用HATHAT选择培选择培养基。在养基。在HATHAT培养基中，未融合的骨髓瘤培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤细胞因缺乏次黄嘌呤- -鸟嘌呤鸟嘌呤- -磷酸核糖转磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成核酸而死亡

16、。移酶，不能利用补救途径合成核酸而死亡。 未融合的脾细胞虽具有次黄嘌呤未融合的脾细胞虽具有次黄嘌呤- -鸟嘌呤鸟嘌呤- -磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在能无限增殖的特性，因此能在HATHAT培养基培养基中存活和增殖。中存活和增殖。 如何获得如何获得针对一种细胞表位针对一种细胞表位的特异性抗体的特异性抗体? ?问题一问题一:

17、:4 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在在HATHAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌数是分泌所需所需特异性单克隆抗体的细胞，特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体

18、的免疫球蛋白类型、亚所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。其分子量后，及时进行冻存。 5 5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备 单克隆抗单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。法和体外培养法。 （1 1）体内诱生法）体内诱生法 取取Balb/cBalb/c小鼠，首小鼠，首先腹腔注射先腹腔注射0.5ml0.5ml液体石腊或降植烷进液体石腊或降植烷进行预处理。行预处理。1-21-2周后，腹腔内接种杂交周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔

19、内增瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-21-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。取腹水，即可获得大量单克隆抗体。 （2）体外培养法）体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量

20、有限。近年来，各种新型培养技术和体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。 鼠单抗也具有一些缺陷，主要是小鼠鼠单抗也具有一些缺陷，主要是小鼠免疫系统不能识别某些免疫原。免疫系统不能识别某些免疫原。 另一方面，由于多克隆抗体识别的是另一方面，由于多克隆抗体识别的是抗原的多个抗原决定簇，同时抗体的亲和抗原的多个抗原决定簇，同时抗体的亲和性要远远高于鼠来源的抗体，再加上技术性要远远高于鼠来源的抗体，再加上技术环节的简单性，所以一直具有不可取代的环节的简单性，所以一直具有不可取代的优势，也广泛应用于科研及诊断。优势，也广泛应用于科研

21、及诊断。 如何得到高亲和性、强特异性、如何得到高亲和性、强特异性、广谱识别性的抗体？广谱识别性的抗体？ 实验动物的选择：实验动物的选择： 做单抗的动物最开做单抗的动物最开始是小鼠，后来又有像始是小鼠，后来又有像Epitomics这样的公这样的公司用兔子的司用兔子的(有特殊的专利有特殊的专利)，还有一些人用，还有一些人用大鼠的，当然其它的动物的也有，据不完全大鼠的，当然其它的动物的也有，据不完全统计，现在能用传统方法制备单抗的动物已统计，现在能用传统方法制备单抗的动物已经有二三十种了。经有二三十种了。 但是最主流的还是小鼠但是最主流的还是小鼠和兔子了。和兔子了。 虽然兔子能产生虽然兔子能产生高亲

22、和性、强特异性、高亲和性、强特异性、广谱识别性的抗体广谱识别性的抗体, ,但但不存在兔的骨髓瘤样不存在兔的骨髓瘤样肿瘤肿瘤). 怎么办怎么办? 1995年，年，Dr. Katherine Knight在在Loyola University of Chicago成功地在在转基因兔中成功地在在转基因兔中获得骨髓瘤样肿瘤获得骨髓瘤样肿瘤(plasmacytoma)。其后几。其后几年里，年里，Dr. Robert Pytela 和和 Mr. Weimin Zhu在在UCSF将此技术进行了改进，使之能高产将此技术进行了改进，使之能高产量的生产兔单克隆抗体。量的生产兔单克隆抗体。兔单克隆抗体兔单克隆抗体

23、(RabMAbs)： 新一代单新一代单克隆抗体用于科研、诊断和治疗克隆抗体用于科研、诊断和治疗 如何获得骨髓瘤样肿瘤如何获得骨髓瘤样肿瘤?在在c-myc/v-abl转基因兔身上成功地转基因兔身上成功地获得了兔浆细胞瘤细胞系获得了兔浆细胞瘤细胞系 proto-oncogenes (原癌基因原癌基因) 调控细胞生长和增殖的正常细胞基因。突调控细胞生长和增殖的正常细胞基因。突变后转化成为致癌的癌基因变后转化成为致癌的癌基因myc 转录因子转录因子 Burkitt 淋巴瘤、肺癌、早淋巴瘤、肺癌、早幼粒白血病幼粒白血病 Abl-1: 非受体酪氨酸激酶非受体酪氨酸激酶 慢性髓性白血慢性髓性白血病病 美国美

24、国Epitomics公司成立于公司成立于2001年年9月，月，与加州大学旧金山分校与加州大学旧金山分校(UCSF)及芝加哥及芝加哥 LOYOLA 大学联手开发出新型杂交瘤技术，大学联手开发出新型杂交瘤技术，拥有兔单克隆抗体拥有兔单克隆抗体(RabMabs)技术的全球专技术的全球专利，是国际上唯一一家拥有兔类单抗技术的利，是国际上唯一一家拥有兔类单抗技术的生物技术公司。生物技术公司。 2012年年3月月6日英国上市公司日英国上市公司Abcam宣宣布将以布将以1.7亿美元收购全球唯一兔单株抗亿美元收购全球唯一兔单株抗体蛋白生物技术公司体蛋白生物技术公司Epitomics(F-宜佰宜佰) Epito

25、mics 由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。预期后预期后10年数百种治疗性抗体将被开发用年数百种治疗性抗体将被开发用于许多疾病的治疗。于许多疾病的治疗。鼠单克隆抗体与兔单克隆抗体的比较鼠单克隆抗体与兔单克隆抗体的比较亲和力更高亲和力更高:可以比鼠抗血清识别更多种类的可以比鼠抗血清识别更多种类的表位表位识别表位更多识别表位更多: 能够识别许多小鼠中不产生免能够识别许多小鼠中不产生免疫的抗原疫的抗原特异性更高、检测灵敏度更高、应用范围更特异性更高、检测灵敏度更高、应用范围更广、背景本底更低

26、广、背景本底更低浆细胞肿瘤浆细胞肿瘤 基因工程抗体的制备基因工程抗体的制备生物导弹的原理生物导弹的原理: : 生物导弹是免疫导向药物的形象称呼，生物导弹是免疫导向药物的形象称呼，它由单克隆抗体与药物、酶或放射性同位它由单克隆抗体与药物、酶或放射性同位素配合而成，因带有单克隆抗体而能自动素配合而成，因带有单克隆抗体而能自动导向，在生物体内与特定目标细胞或组织导向，在生物体内与特定目标细胞或组织结合，并由其携带的药物产生治疗作用。结合，并由其携带的药物产生治疗作用。 单克隆抗体具有高度专一性，能够识单克隆抗体具有高度专一性，能够识别细胞表面抗原、各种受体、各种体液成别细胞表面抗原、各种受体、各种体

27、液成分及细胞内和组织内的各种成分，能精确分及细胞内和组织内的各种成分，能精确地瞄准和捕获靶细胞，特异性地与靶目标地瞄准和捕获靶细胞，特异性地与靶目标发生反应，因而有发生反应，因而有“生物导弹生物导弹”之称。之称。 单抗体引导药物或毒素到达抗原存在部单抗体引导药物或毒素到达抗原存在部位使药物或使毒素发挥更有效的作用位使药物或使毒素发挥更有效的作用.从而从而减少药物、毒素、同位素和酶在肿瘤治疗减少药物、毒素、同位素和酶在肿瘤治疗过程中引起严重的副作用过程中引起严重的副作用,大大提高治疗肿大大提高治疗肿瘤的效果。瘤的效果。用鼠单克隆抗体制备的生物导弹有什么问题？用鼠单克隆抗体制备的生物导弹有什么问题

28、？ 杂交瘤是杂交瘤是鼠来源鼠来源的，因此产生的抗体的，因此产生的抗体也是也是鼠源的蛋白鼠源的蛋白，对于人体而言是一种异，对于人体而言是一种异种蛋白。种蛋白。异种蛋白在人体内可能会引起免疫反异种蛋白在人体内可能会引起免疫反应（哮喘、荨麻疹应（哮喘、荨麻疹/ /风疹块，产生抗体等）风疹块，产生抗体等）或被排斥，有时会引起严重的致死性反应，或被排斥，有时会引起严重的致死性反应，因此自因此自19801980年代以来，如何解决生物导弹年代以来，如何解决生物导弹的这个问题，一直是生物导弹在人体内应的这个问题，一直是生物导弹在人体内应用的重要问题。用的重要问题。 FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3

29、CDR3 FR4V区区抗体基因的改造抗体基因的改造 将鼠源抗体的将鼠源抗体的V区与人源抗体区与人源抗体C区区基因重组，获得的嵌合体（基因重组，获得的嵌合体（chimerical antibody),可保留鼠抗体对抗原的高亲可保留鼠抗体对抗原的高亲和性，又减弱鼠抗原对人的免疫原和性，又减弱鼠抗原对人的免疫原性，提高治疗性抗体的效果。性，提高治疗性抗体的效果。解决方法解决方法鼠单抗恒定区人源化 鼠单抗恒定鼠单抗恒定区人源化区人源化 如何得到亲和力高、特异性强的抗体克隆？如何得到亲和力高、特异性强的抗体克隆？ 通过遗传工程技术改造与生产抗体通过遗传工程技术改造与生产抗体抗体基因文库抗体基因文库 将不

30、同的重链和轻链基因随机组合，将不同的重链和轻链基因随机组合，克隆到合适的表达载体（噬菌体）中，在克隆到合适的表达载体（噬菌体）中，在原核细胞表达不同的抗体，形成一个抗体原核细胞表达不同的抗体，形成一个抗体库。库。 从这个抗体库中，从这个抗体库中， 用抗原可以筛选用抗原可以筛选到相应的抗体基因。到相应的抗体基因。 优点：优点： 一是从不适合进行人工免疫的一是从不适合进行人工免疫的物种获得单克隆抗体，如人源单克隆抗体；物种获得单克隆抗体，如人源单克隆抗体；二是可快速方便获得二是可快速方便获得亲和力高、特异性强亲和力高、特异性强的的克隆抗体。克隆抗体。主要的抗原抗体反应主要的抗原抗体反应 抗体效价的

31、测定抗体效价的测定血清：血清：血液凝固析出的淡黄色透明液体血液凝固析出的淡黄色透明液体 ，在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原。白块，所以血清中无纤维蛋白原。抗体效价抗体效价( (滴度，滴度，titer)titer)：通过通过血清学方法血清学方法能显示一定反应的抗血清能显示一定反应的抗血清(或抗体或抗体)的的最高稀最高稀释倍数释倍数(或或稀释度的倒数稀释度的倒数) )。如终点稀释度为如终点稀释度为1/100，则血清的效价，则血清的效价(每每1ml的血清中抗体的血清中抗体效价效价)为为100抗体单位抗体单位的高低是衡量血清中的高低是

32、衡量血清中抗体水平的一项检测指标。抗体水平的一项检测指标。 试管凝集实验（试管凝集实验（tube agglutination test）原理：大分子颗粒性抗原（细菌、红细胞）原理：大分子颗粒性抗原（细菌、红细胞）与其相应的抗体相结合，在适量的电解质存与其相应的抗体相结合，在适量的电解质存在及一定的温度下，经过一定的时间可出现在及一定的温度下，经过一定的时间可出现肉眼可见的凝聚团块。一般以标准抗原测得肉眼可见的凝聚团块。一般以标准抗原测得免疫血清或患者血清中抗体的效价。免疫血清或患者血清中抗体的效价。不加免疫血清不加免疫血清、：凝聚强度、：凝聚强度：出现凝聚：出现凝聚：无凝聚：无凝聚抗体稀释度应

33、根据：抗体稀释度应根据：抗体效价高，溶液中特异性抗体浓度越抗体效价高，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；高，工作稀释度越高；一般讲，应用的一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间越长。抗体稀释度越大，温育时间越长。抗体抗体中非特异性蛋白含量、只有高稀释度时才中非特异性蛋白含量、只有高稀释度时才能防止非特异性背景染色；抗体的稀释主能防止非特异性背景染色；抗体的稀释主要是指第一抗体，因为第一抗体中特异性要是指第一抗体，因为第一抗体中特异性抗体合适的尝试是关键抗体合适的尝试是关键, ,应用高稀释度第应用高稀释度第一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应, ,减少

34、或消除其中交叉抗体反应。减少或消除其中交叉抗体反应。 三、常见免疫分析方法三、常见免疫分析方法 利用抗原与抗体特异利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗性反应的特性对抗原或抗体进行量和质的测定分析。体进行量和质的测定分析。这类分析方法具有特异、这类分析方法具有特异、灵敏和快速的特点。灵敏和快速的特点。免疫沉淀免疫沉淀1. 环状沉淀实验：是溶环状沉淀实验：是溶液中的沉淀反应。在体液中的沉淀反应。在体外当抗体与相应抗原二外当抗体与相应抗原二者浓度比例恰当时，会者浓度比例恰当时，会发生免疫沉淀。发生免疫沉淀。抗体与多价抗原结合的浓度带现象抗体与多价抗原结合的浓度带现象2.免疫双扩散免疫双扩散抗原抗

35、体在半透明的半固抗原抗体在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。相介质中进行沉淀实验。双扩散是在琼脂板中抗原双扩散是在琼脂板中抗原和抗体分别从相邻的孔中和抗体分别从相邻的孔中向四周扩散，在抗原孔和向四周扩散，在抗原孔和抗体孔之间二者比例合适抗体孔之间二者比例合适的部位形成沉淀线。的部位形成沉淀线。当两个抗原完全一致时，当两个抗原完全一致时，两条沉淀线完全融合；如两条沉淀线完全融合；如果两个抗原无共同抗原决果两个抗原无共同抗原决定簇时，沉淀线互不干扰；定簇时，沉淀线互不干扰；当两个抗原只是部分抗原当两个抗原只是部分抗原决定簇相同，还有其他不决定簇相同，还有其他不同的抗原决定簇，则沉淀同的抗原决定簇，

36、则沉淀线在后者一方形成突出的线在后者一方形成突出的小刺小刺3. 免疫电泳免疫电泳 利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离开来的特点与免疫扩散结合一起能被分离开来的特点与免疫扩散结合一起进行分析的方法。进行分析的方法。1 1、 血清免疫电泳血清免疫电泳: :双扩散双扩散2 2、火箭电泳：为、火箭电泳：为加速度的加速度的单向免疫扩散单向免疫扩散( (抗原扩散抗原扩散, ,抗体不扩散抗体不扩散) )与电泳结合的一与电泳结合的一种方法种方法 在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，抗原泳向阳极

37、，在抗原抗体比例恰当处发生将抗原置阴极端，抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比，用标本中的抗原含量。正比，用标本中的抗原含量。 酶联免疫分析法酶联免疫分析法 广泛使用广泛使用, ,因酶促反应使测定的结果因酶促反应使测定的结果被放大被放大, ,反应灵敏度高。反应灵敏度高。 酶标酶标方法方法直接酶标直接酶标间接酶标间接酶标用于标记抗体的酶用于标记抗体的酶:辣根过氧化物酶辣根过氧化

38、物酶 (horseradish peroxidase)化学发光剂化学发光剂:荧光醇（荧光醇（luminol） 利用利用化学发光化学发光(chemiluminescent)检测抗检测抗原和抗体相互作用原和抗体相互作用.化学发光化学发光(chemiluminescent) 原理原理 化学发光剂如荧光醇（化学发光剂如荧光醇（luminol） ，在辣根，在辣根过氧化物酶（过氧化物酶（HRP）的催化作用下）的催化作用下,荧光醇荧光醇与过氧与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体即分解，形成一种能发光的电子激发中间体,当后当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。者由激发态返回至基态，就会产生荧光。Lumigen PS3:化学发光检测中与辣根过氧化物酶结合的底物化学发光检测中与辣根过氧化物酶结合的底物 , produces a more intense light emission of linger duration如果发光剂是如果发光剂是Lumigen PS3免疫荧光分析免疫荧光分析: : 将荧光化合物标记抗体