药物分析教学课件：第十六章抗生素类药物的分析

1、1第十六章 抗生素类药物的分析 2学习要求掌握：抗生素类药物的类型、结构、质量和稳定性特点、以及分析方法。熟悉：各类抗生素药物的有关物质来源、特点和检查方法。 了解：抗生素药物的体内样品分析方法和临床监测应用。3第一节 概述第二节 -内酰胺类抗生素第三节 氨基糖苷类抗生素 第四节 四环素类抗生素第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查 4四环素牙是怎么形成的?为什么特别强调抗生素的合理用药?为什么抗生素要做过敏试验？思考题5抗生素定义 在低浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。主要由生物发酵、经化学纯化、精制和化学修饰等过程，最后制成适当制剂。 抗生素是细菌、放线菌和真菌

2、等微生物的代谢产物，对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用。6 抗生素(Antibiotics)类药物是临床上常用的一类重要药物，临床使用的抗生素的主要是生物合成，经过发酵和提纯两步制得；也有少数是利用化学合成或半合成方法制得。ChP2010共收载抗生素类原料药及其各种制剂近300个品种。 7一、抗生素药物的作用特点化学纯度较低：同系物多、异构体多、降解物多如四环素类存在脱水、差向异构体。 头孢他定 95 0%；头孢拉定90.0%； 头孢曲松钠84.0%活性组分易发生变异：微生物菌株改变、发酵条件变化稳定性差：结构中含活泼基团 内酰胺环 链霉素结构中的醛基8二、抗生素类药物的分类 1.根据产生

3、抗生素的生物来源分类 细菌产生的抗生素、真菌产生的抗生素、放线菌产生的抗生素、高等植物产生的抗生素(穿心莲内酯、小檗碱）、动物产生的抗生素（抗菌肽)； 2. 根据抗生素的作用对象分类 抗革兰氏阳性菌的抗生素、抗革兰氏阴性菌的抗生素、广谱抗生素、抗真菌的抗生素、抗肿瘤的抗生素、抗病毒及抗原虫系昆虫的抗生素、抗结核分枝杆菌的抗生素； 3. 根据抗生素的作用机制分类 抑制细胞壁合成的抗生素、影响细胞膜功能的抗生素、抑制和干扰细胞蛋白质合成的抗生素、抑制细胞核酸合成的抗生素、抑制细菌生物能作用的抗生素； 4. 根据抗生素的化学结构分类 其中以作用对象、化学结构不同进行分类是较常用的，前者对于临床选用抗

4、生素带来一定方便，后者有利于抗生素工业生产和质量分析研究。按照化学结构分类共分为以下九大类。 9 (1) -内酰胺类抗生素 (2) 四环类抗生素-米诺环素、多烯四环素、金霉素 、美他环素 (3) 氨基糖苷类抗生素 链霉素、庆大、妥布、阿米卡星、 (4) 大环内酯类抗生素 克拉霉素、阿奇霉素、琥乙红霉素 (5) 多烯大环类抗生素 两性霉素B、制霉菌素 (6) 多肽类抗生素-盐酸万古霉素、硫酸多粘菌素 (7) 酰胺醇类抗生素-氯霉素、甲砜霉素、 (8) 抗肿瘤类抗生素-丝裂霉素 、多柔比星、柔红霉素 (9) 其它抗生素 克林霉素、磷霉素、美洛西林钠等根据抗生素的化学结构分类 10恩拉霉素A：R=C

5、H3 恩拉霉素B：R=C2H511 本章主要讨论-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类抗生素物理化学性质鉴别反应杂质检查含量测定方法与原理。关于生物学方法(如异常毒性、热原、降压物质、无菌、生物效价测定法等)，根据专业要求，在此不赘述(需要进一步了解，参考ChP2010二部附录)。 12 在长期的抗生素选择之后出现的对相应抗生素产生耐受能力的微生物，统称耐药菌。所谓细菌耐药性(bacterial resistance)又称抗药性，是指细菌产生的对抗菌药不敏感的现象，是细菌自身生存过程的一种特殊表现形式。 1. 耐药性的种类 2. 耐药的机制三、抗生素类药物的细菌耐药性13 抗生素类药物的质量控制方法

6、与一般化学药品一样，通过鉴别、检查、含量(效价)测定三个主要方面来判断其质量的优劣。由于抗生素类药物的特点，其分析方法可分为理化方法和生物学法两大类。 四、抗生素药物的质量分析14抗生素类药物的鉴别试验主要为理化方法，常用方法有： 1. 官能团的显色反应 如-内酰胺环的羟肟酸铁反应；链霉素的麦芽酚反应、坂口反应。对于抗生素盐类，通常鉴别酸根或金属离子或有机碱。 2. 光谱法 包括红外光谱与紫外吸收光谱的鉴别。抗生素的红外光谱分析时需注意，由于抗生素存在多晶现象，有时对照品与供试品图谱或对照图谱不一致，最好用相同溶剂同时重结晶供试品和对照品，使处于相同晶型情况下再进行测定，若多晶效应是由于研磨和

7、压片过程中的晶相转变所致，则应采用溶液法试验。 3. 色谱法 包括TLC和HPLC法，采用对照品或标准品对照法。 4. 生物学法 是检查抗生素灭活前后的抑菌能力，并与已知含量的对照品对照后进行鉴别，此法已很少应用。 (一) 鉴别试验15 1. 影响产品稳定性的检查项目 结晶性、酸碱度、水分或干燥失重等； 2. 控制有机和无机杂质的检查项目 溶液的澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等； 3. 与临床安全性密切相关的检查项目 异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌等； 4. 其他检查项目 对于多组分抗生素还要进行组分分析等(如硫酸庆大霉素的“庆大霉素C组分的测定”)。此外，有些

8、抗生素还规定 “悬浮时间与抽针试验”(如注射用普鲁卡因青霉素)、 “聚合物”(如-内酰胺类抗生素)、“杂质吸光度”(如四环素类抗生素)等。 (二) 检查16 1. 微生物检定法 本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性(效价)的方法。测定方法可分为管碟法和浊度法：管碟法是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。浊度法是利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法

9、。 (三) 含量或效价测定17（三）含量测定1、微生物检定法定义：以抗生素对微生物的杀伤或抑菌程度为指标来衡量抗生素效价。测定方法：分为稀释法、比浊法和管碟琼脂扩散法。优点：灵敏度高、需用量少，测定结果较直观。测定原理与临床应用一致，适用范围广。是抗生素测定的基本方法。缺点：操作步骤多，测定时间长，误差大。常用于多组分或结构复杂抗生素。18管碟法抗生素效价测量-实验 1.1 实验器材的选择1.2 实验器材的清洗2.1 样品与标准品溶液的配制 2.2 培养基与缓冲液的配制 3.1 加注底层培养基3.2 加注培养基菌层 4. 放置小钢管 5. 滴加抗生素溶液 6. 双碟中菌株的培养 7. 抑菌圈测

10、量 19管碟法又称管碟琼脂扩散法 是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品二者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。在一定范围内，抗生素溶液的对数浓度（剂量）与抑菌圈面积或直径成正比，根据抑菌圈的大小计算出抗生素溶液的浓度。 20T2S1S2T1管碟法21Size of Cylinder CupT2S1S2T1管碟法222、理化方法根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学性质及反应而进行的。优点：对于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素，能较迅速、准确地测定其效价，具较高专属性。缺点：对含有同样官能团杂质的供试品不适用。不一定代表生物效价。23

11、3、抗生素活性表示方法以效价表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。用u/mL或g/mg表示。举例1：1mg青霉素钠定为1670单位,则1mg青霉素钾的效价 1670X356.4/372.5=1598u/mg(青霉素/青霉素钠):1670=(青霉素/青霉素钾):X举例2：青霉素V钾24 微生物检定法的优点是灵敏度高、需用量小，测定结果较直观；测定原理与临床应用的要求一致，更能确定抗生素的医疗价值；而且适用范围广，较纯的精制品、纯度较差的制品、已知的或新发现的抗生素均能应用；对同一类型的抗生素不需分离，可一次测定其总效价，是抗生素药物效价测定的最基本的方法。但其存在着操作步骤多

12、，测定时间长，误差大等缺点，随着抗生素类药物的发展和分析方法的进步，理化方法逐渐取代了生物学法，但对于分子结构复杂、多组分的抗生素，生物学法仍然是首选的效价测定方法。 25 2. 理化方法 是根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学性质及反应而进行的。对于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素，能较迅速、准确地测定其效价，并具有较高的专属性。但本法也存在不足：如化学法通常是利用抗生素化学结构上官能团的特殊化学反应，对含有具同样官能团杂质的供试品就不适用，或需采取适当方法加以校正。而且当该法是利用某一类型抗生素的共同结构部分的反应时，所测得的结果，往往只能代表药物的总含量，并不一定能代

13、表抗生素的生物效价。因此，通常在以理化方法测定抗生素含量时，不但要求方法正确可靠、具有专属性、操作简单、省时、试剂易得、样品用量少，而且要求测定结果必须与生物效价吻合。目前世界各国药典所收载的抗生素的理化方法主要是HPLC法，如-内酰胺类、四环素类、大环内酯类等抗生素大多采用HPLC法测定含量。 26 3. 抗生素活性表示方法 抗生素的活性以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。效价是以抗菌效能(活性部分)作为衡量的标准，因此，效价的高低是衡量抗生素质量的相对标准。效价用单位(U)或微克(g)表示。各种抗生素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定的，如1mg青霉素钠

14、定为1670 U；1mg庆大霉素定为590 U；1mg硫酸卡那霉素定为670 U。一种抗生素有一个效价基准，同一种抗生素的各种盐类的效价可根据其分子量与标准盐类进行换算。例1mg青霉素钾的单位(U)=1670356.4/372.5=1598 U/mg。以上为抗生素的理论效价，实际样品往往低于该理论效价。 27第二节 -内酰胺类抗生素 本类抗生素包括青霉素类和头孢菌素类，它们的分子结构中均含有-内酰胺环，因此统称为-内酰胺类抗生素。 28青霉素类6-APA6-APA*143229 发展史1929年，弗来明(Alexander Fleming) 发现青霉素。1958年谢汉合成6-氨基青霉烷酸(6-

15、APA)成功。开创了半合成青霉素的时代1961年，头孢菌素C被发现，头孢菌素迅速发展。80年代:广谱碳青霉烯类上市。30发现第一个用于临床的抗生素由青霉菌的培养液中分离而得31发现-偶然性在1928年夏弗莱明外出度假时，把实验室里在培养皿中正生长着细菌这件事给忘了。3周后当他回实验室时，注意到 一个与空气意外接触过的金黄色葡萄球菌培养皿中长出了一团青绿色霉菌。在用显微镜观察这只培养皿时弗莱明发现，霉菌周围的葡萄球菌菌落已被溶解。这意味着霉菌的某种分泌物能抑制葡萄球菌。此后的鉴定表明，上述霉菌为点青霉菌，因此弗莱明将其分泌的抑菌物质称为青霉素。然而遗憾的是弗莱明一直未能找到提取高纯度青霉素的方法

16、，于是他将点青霉菌菌株一代代地培养，并于1939年将菌种提供给准备系统研究青霉素的英国病理学家弗洛里（Howard Walter Florey）和生物化学家钱恩。32 田中几乎没有发表过什么论文。仅有的几篇也只是发表在不是很重要的会议和杂志上。他与日本学术界几乎没有任何交往。以至于前天晚上获奖的消息传来时，日本学术界措手不及。在电视台采访去年的诺贝尔化学奖获奖者名古屋大学野依良治教授时，该教授透露他刚与前年的获奖者白川英树教授联系过，都不知道田中耕一何许人也。最后，该教授只能结结巴巴地说：这说明只要自己努力，不在学术界活跃也能得到诺贝尔奖。与田中有一面之交的另一位教授也找不到话来称赞他，只是笼

17、统地说：人很老实，工作热心。再问如何相识时，原来教授也只是因为买了岛津制作所的分析仪器，听过一次田中作的产品介绍。 333435细心与协作精神的胜利青霉素的发现始于一个现象的意外观察，而我唯一的功劳仅是没有忽视观察。 A.Fleming36细心与协作精神的胜利化学家和经过生物学训练或具有生物学知识的行家之间的合作是非常关键之处，这也是在此之前对大批已知抑制剂的研究成果甚少的原因之所在。 Florey37发现-偶然性2田中耕一基质辅助激光解吸质谱（对生物大分子的质谱分析法 ）牛顿-万有引力0.004%甲酸机会总是给有准备的人留着的,当机会到来时,你准备好了吗?38头孢菌素类7-ACA*12435

18、639一、化学结构与性质青霉素类的基本结构头孢菌素的基本结构1.化学结构：-内酰胺环侧链A：-内酰胺环B：氢化噻唑环青霉素类（penicillins）侧链A：-内酰胺环B：氢化噻嗪环头孢菌素类（cephalosporins）AB6-APA 7-ACA 40药物名称物理性质鉴别检查含量测定阿莫西林Amoxicillin白色或类白色结晶性粉末；味微苦。在水中微溶，在乙醇中几乎不溶。D(水溶液) +290o+315o。1. TLC或HPLC2. IR1. 有关物质：HPLC；2. 阿莫西林聚合物；3. 残留溶剂：丙酮与二氯甲烷；4. 水分HPLC法阿莫西林钠Amoxicillin Sodium白色或

19、类白色粉末或结晶；无臭或微臭，味微苦；有引湿性。在水或乙醇中易溶，在乙醚中不溶。D(水溶液) +240o+290o。1. TLC或HPLC2. IR3. 钠盐的鉴别1. 有关物质：HPLC；2. 残留溶剂：乙醇与乙酸甲酯；3. 2-乙基己酸；4. 水分；5. 可见异物；6. 不溶性微粒；7. 细菌内毒素；8. 无菌HPLC法青霉素钾Phenoxymethylpenicillin Potassium白色结晶或结晶性粉末；无臭或微臭，微苦。在水中易溶，在三氯甲烷、乙醚或液体石蜡中几乎不溶。D(水溶液) +215o+230o。1. HPLC2. IR3. 钾盐的鉴别1. 吸光度；2. 结晶性；3.

20、有关物质：HPLC；4. 青霉素聚合物；5. 水分HPLC法青霉素钠Benzylpenicillin Sodium白色结晶性粉末；无臭或微有特异性臭；有引湿性；遇酸、碱或氧化剂等即迅速失效，水溶液在室温放置易失效。在水中极易溶解，在乙醇中溶解，在脂肪油或液状石蜡中不溶。1. HPLC2. IR3. 钠盐的鉴别1. 吸光度；2. 结晶性；3. 有关物质：HPLC；4. 青霉素聚合物；5. 可见异物；6. 不溶性微粒；7. 细菌内毒素；8. 无菌HPLC法氨苄西林Ampicillin白色结晶性粉末；味微苦。在水中微溶，在三氯甲烷、乙醇、乙醚或不挥发油中不溶；在稀酸溶液或稀碱溶液中溶解。D(水溶液)

21、 +280o+305o。1. TLC或HPLC2. IR1. 有关物质：HPLC；2. N,N-二甲基苯胺：GC；3. 水分HPLC法普鲁卡因青霉素Procaine Benzylpenicillin白色微晶性粉末；遇酸、碱或氧化剂等即迅速失效。在甲醇中易溶，在乙醇或三氯甲烷中略溶，在水中微溶。D(水溶液) +280o+305o。1. TLC或HPLC2. IR1. 有关物质：HPLC；2. 青霉素聚合物；3. 残留溶剂：乙酸乙酯与正丁醇；4. 水分；5. 细菌内毒素；6. 无菌HPLC法-内酰胺类抗生素部分原料药的物理性质、鉴别、检查和含量测定 41-内酰胺类抗生素部分原料药的物理性质、鉴别、

22、检查和含量测定 药物名称物理性质鉴别检查含量测定头孢他啶Ceftazidime白色或类白色结晶性粉末；无臭或微有特臭。在磷酸盐缓冲液(pH6.0)中略溶，在水或甲醇中微溶，在丙酮或三氯甲烷中不溶。E1% 1cm(磷酸盐缓冲液 pH6.0) 400430。1. HPLC2. IR1. 有关物质：HPLC；2. 头孢他啶聚合物；3. 吡啶：HPLC；4. 可见异物；5. 不溶性微粒；6. 细菌内毒素；7. 无菌HPLC法头孢克洛Cefaclor白色至微黄色粉末或结晶性粉末，微臭。在水中微溶，在甲醇、乙醇、三氯甲烷或二氯甲烷中几乎不溶。 D(水溶液) +105o+120o。E1% 1cm(水溶液)

23、230255。1. TLC或HPLC2. IR1. 有关物质：HPLC；2. 残留溶剂：二氯甲烷；3. 水分HPLC法头孢呋辛酯Cefuroxime axetil白色或类白色粉末；几乎无臭，味苦。在丙酮中易溶，在三氯甲烷中溶解，在甲醇或乙醇中略溶，在乙醚中微溶，在水中不溶。E1% 1cm(甲醇) 390420。1. HPLC2. IR1. 结晶性；2. 异构体：HPLC；3. 有关物质：HPLC；4. 水分HPLC法头孢拉定Cephradine白色或类白色结晶性粉末；微臭。在水中略溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中几乎不溶。D(醋酸盐缓冲液 pH4.6) +80o+90o。1. TLC或HPLC2.

24、 IR1. 结晶性；2. 头孢氨苄：HPLC；3. 有关物质：HPLC；4. 头孢拉定聚合物；5. 水分；6. 可见异物；7. 不溶性微粒；8. 细菌内毒素；9. 无菌HPLC法头孢氨苄Cefalexin白色或乳黄色结晶性粉末；微臭。在水中微溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中不溶。D(水溶液) +149o+158o。 E1% 1cm(水溶液)220245。1. HPLC2. IR1. 有关物质：HPLC；2. 水分HPLC法头孢羟氨苄Cefadroxil白色或类白色结晶性粉末，有特异臭味。在水中微溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中几乎不溶。1. 三氯化铁反应2. HPLC 3. IR1. 结晶性2. 有关

25、物质：HPLC 3. 水分HPLC法头孢替唑钠CeftezoleSodium白色至淡黄色结晶性粉末；无臭，有引湿性。在水中易溶，在甲醇中微溶，在乙醇和乙醚中几乎不溶。D(水溶液) -5o-9o。E1% 1cm(水溶液)270300。1. UV2. HPLC3. IR4. 钠盐的鉴别1. 有关物质：HPLC；2. 头孢替唑聚合物；3. 水分；4. 可见异物；5. 不溶性微粒；6. 细菌内毒素；7. 无菌HPLC法头孢噻吩钠Cefalotin Sodium白色或类白色的结晶性粉末；几乎无臭。在水中易溶，在乙醇中微溶，在三氯甲烷和乙醚中不溶。D(水溶液)+124o+134o。1. HPLC2. IR

26、3. 钠盐的鉴别1. 吸光度；2. 有关物质：HPLC；3. 头孢噻吩聚合物；4. 残留溶剂：乙醇与丙酮；5. 2-乙酸己酸；6. 水分；7. 可见异物；8. 不溶性微粒；9. 细菌内毒素；10. 无菌HPLC法青霉素（青霉素G、苄青霉素） 氨苄西林（氨苄青霉素）头孢氨苄头孢拉定44酸性结构与性质2、与碱金属(Na+、K+)成盐 ，（1）酸性与溶解度 羧基 易溶于水 Na45与有机碱(普鲁卡因)成盐 难溶于水普鲁卡因青霉素46（2）(5%头孢唑啉钠溶液 1824)头孢菌素类 C6 C7青霉素类 C2 C5 C6 旋光性（手性C）47 （3）共轭体系 头孢菌素类 母核有共轭体系 青霉素类 母核无

27、明显UV 多数有苯环取代基 UV48青霉素钠UV7-2049（4）内酰胺环 水溶液 不稳定 干燥纯净 稳定 不稳定性因素四元环张力大 酰胺键易水解 50100-青霉噻唑酰基羟胺酸青霉素青霉烯酸青霉噻唑酸青霉酸青霉醛青霉胺图 青霉素的降解反应51例青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OH青霉素酶青霉酸H2OpH2100青霉噻唑酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl252图 头孢噻吩钠降解产物图 53二、鉴别试验 本类药物的鉴别试验，现版ChP，USP，BP采用的方法主要为HPLC、IR和TLC法。 (一) 色谱法 (二) 光谱法 (三) 呈色反应 (四) 各种盐的反应5

28、4(一) 色谱法 利用比较供试品溶液主峰与对照品溶液主峰的保留时间(tR)是否一致或比较供试品溶液与对照品溶液所显主斑点的位置和颜色是否相同进行鉴别。HPLC法一般都规定在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰应与对照品溶液主峰的保留时间一致。中国药典对鉴别试验中有HPLC法又有TLC法的，规定可在两种鉴别方法中选做一种。 55 (二) 光谱法 1. 红外吸收光谱(IR) 红外吸收光谱反映了分子的结构特征，各国药典对收载的-内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别。该类抗生素的-内酰胺环羰基的伸缩振动(1750cm-11800cm-1)，仲酰胺的氨基、羰基的伸缩振动(3300cm-1，152

29、5 cm-1，1680 cm-1)、羧酸离子的伸缩振动(1600cm-1，1410cm-1)是该类抗生素共有的特征峰。56特征吸收峰归属峰位(cm-1)归属36002600O-H1780C=O1690C=O1585, 1480COO-1250CO图 阿莫西林的红外光谱图(KBr压片法) 57 1、IR法-内酰胺环酰胺58 2. 紫外吸收光谱(UV) 本类药物的紫外光谱鉴别法通常利用最大吸收波长鉴定法：将供试品配成适当浓度的溶液，直接测定紫外吸收光谱，根据其最大吸收波长或最大吸收波长处的吸光度进行鉴定。如头孢唑啉钠的紫外鉴别法：取本品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含16g的溶液，在272n

30、m的波长处有最大吸收。 59（1）样品的最大吸收波长Cu2+头孢氨苄 max = 262nm青霉素V钠 A280nm/A264nm = 1.301.50（2）分解产物的最大吸收波长60(三) 呈色反应 1. 羟肟酸铁反应 青霉素及头孢菌素在碱性中与羟胺作用，-内酰胺环破裂生成羟肟酸；在稀酸中与高铁离子呈色。 612. 类似肽键的反应-茚三酮反应 -氨基酸62-氨基、伯胺某些羟基胺类酮式烯醇式茚三酮茚三酮缩合蓝紫色633. 与重氮苯磺酸反应（偶合）酚羟基头孢哌酮此外，本类药物还可与变色酸-硫酸、硫酸-甲醛等试剂反应而呈色。 64(四) 各种盐的反应 钾、钠离子的火焰反应 青霉素类、头孢菌素类药品

31、中，许多制成钾盐或钠盐供临床使用，因而可利用钾、钠离子的火焰反应进行鉴别。如阿莫西林钠、头孢尼西钠、头孢西丁钠、头孢曲松钠等钠离子的鉴别；青霉素钾、青霉素钾等钾离子的鉴别。 65 焰色鲜黄色 + 醋酸氧铀锌黄 Na+（二）各种盐的反应K+、Na+反应1、 焰色紫色 + 0.1%四苯硼钠 + Ac白 K+66三、检查 本类抗生素的杂质主要有高分子聚合物，有关物质，异构体等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用测定杂质的吸光度来控制杂质量的。此外，有的还进行结晶性、抽针与悬浮时间等有效性试验，部分抗生素还检查有机溶剂残留量。 (一) 聚合物 (二) 有关物质和异构体 (三) 吸光度 (四) 有机

32、溶剂 (五) 结晶性67四、含量测定 各国药典收载的青霉素类和头孢菌素类的含量测定除少数几个样品采用抗生素微生物检定法测定外，大多采用HPLC测定方法。 高效液相色谱法是近年来发展最快的方法，它能有效地分离供试品中可能存在的降解产物、未除尽的原料及中间体等杂质，并能准确定量，适用于本类药物的原料、各种制剂及生物样本的分析测定。ChP2010收载的本类抗生素中除磺苄西林钠采用微生物检定法测定含量外，其余均采用HPLC法测定含量。 68HPLC法 外标法特点 快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好 一法多用（鉴别、检查、含测） 可分离降解产物、未除尽的原料药及中 间体ChP2010 青霉素类、头孢菌

33、素类69色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢钾溶液(取磷酸二氢钾6.8g，加水溶解并稀释成1000ml，用磷酸调节pH值至3.4)-乙腈(92 8)为流动相；检测波长为254nm。取头孢克洛对照品及头孢克洛-3-异构体对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中分别含头孢克洛及头孢克洛-3-异构体约0.2mg的混合溶液，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图，头孢克洛峰与头孢克洛-3-异构体峰的分离度应符合要求。 测定法 取本品约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取头孢克洛对照品适量，同法测

34、定。按外标法以峰面积计算出供试品中C15H14ClN3O4S的含量。规定按无水物计算，含C15H14ClN3O4S不得少于95.0%。 ChP2010头孢克洛含量的HPLC测定法 70Assay Mobile phase Dissolve 1 g of sodium 1-pentanesulfonate（戊） in a mixture of 780 mL of water and 10 mL of triethylamine. Adjust with phosphoric acid to a pH of 2.5 0.1, add 220 mL of methanol, and mix. Sta

35、ndard preparation Transfer about 15 mg of USP Cefaclor RS, accurately weighed, to a 50-mL volumetric flask, dilute with Mobile phase to volume, and mix. Sonicate briefly, if necessary, to achieve dissolution, and avoid heating the solution. noteUse this Standard preparation within 8 hours if stored

36、at room temperature, or within 20 hours if stored under refrigeration. preparation Transfer about 15 mg of Cefaclor, accurately weighed, to a 50-mL volumetric flask, dilute with Mobile phase to volume, and mix. Sonicate briefly, if necessary, to achieve dissolution, and avoid heating the solution. n

37、oteUse this Assay preparation within 8 hours if stored at room temperature, or within 20 hours if stored under refrigeration. USP34 Cefaclor(头孢克洛)71Resolution solution Prepare a solution in Mobile phase containing about 0.3 mg of cefaclor and 0.3 mg of USP Cefaclor, Delta-3 Isomer RS per mL. Chromat

38、ographic system The liquid chromatograph is equipped with a 265-nm detector and a 4.6-mm 25-cm column containing 5-m packing. The flow rate is about 1.5 mL per minute. Chromatograph the Resolution solution, and record the responses as directed for Procedure: the relative retention times for cefaclor

39、 and cefaclor, delta-3 isomer are about 0.8 and 1.0, the resolution, R, between the cefaclor peak and the cefaclor, delta-3 isomer peak is not less than 2.5, the tailing factor is not more than 1.5, and the relative standard deviation for replicate injections is not more than 2%. 72Procedure noteUse

40、 peak areas where peak responses are indicated. Separately inject equal volumes (about 20 L) of the Standard preparation and the Assay into the chromatograph, record the chromatograms, and measure the responses for the major peaks. Calculate the potency, in g per mg, of cefaclor (C15H14ClN3O4S) in e

41、ach mg of the Cefaclor taken by the formula: (WS / WU)(P)(rU / rS)in which WS and WU are the weights, in mg, of USP Cefaclor RS and of Cefaclor taken to prepare the Standard preparation and the Assay preparation, respectively; P is the designated potency, in g of cefaclor (C15H14ClN3O4S) per mg, of

42、USP Cefaclor RS; and rU and rS are the peak responses of the cefaclor peaks obtained from the Assay preparation and the Standard preparation, respectively.Cefaclor has a potency of not less than 950 g and not more than 1020 g of C15H14ClN3O4S per mg, calculated on the anhydrous basis.USP（2009）版与Ch.P

43、方法相比，USP方法更为严谨。 73第三节 氨基糖苷类抗生素 氨基糖苷类抗生素抗生素的化学结构都是以碱性环己多元醇为苷元，与氨基糖缩合而成的苷，故称为氨基糖苷类抗生素(Aminoglycosides Antibiotics)。主要有硫酸链霉素、硫酸庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、盐酸大观霉素、硫酸小诺霉素、硫酸巴龙霉素、硫酸卡那霉素、硫酸西索霉素、硫酸阿米卡星、硫酸依替米星、硫酸核糖霉素、硫酸新霉素等，它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。 74第三节 氨基糖苷类抗生素链霉素 双氢链霉素新霉素 卡那霉素庆大霉素 巴龙霉素 75链霉素链霉胍 + 链霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺 苷元糖(链霉双糖胺

44、)链霉双糖胺链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺绛红糖胺紫素胺 2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺78庆大霉素C复合物 庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH379硫酸链霉素StreptomycinSulfate 硫酸巴龙霉素Paromomycin Sulfate 硫酸庆大霉素Gentamycin sulfate 硫酸奈替米星Netilmicin Sulfate 一、化学结构与性质80药物名称物理性质鉴别检查

45、含量测定硫酸链霉素StreptomycinSulfate白色或类白色的粉末；无臭或几乎无臭，味微苦；有引湿性。在水中易溶，在乙醇或三氯甲烷中不溶。1. 坂口反应2. 麦芽酚反应3. IR4. 硫酸盐的鉴别反应1. 硫酸盐 EDTA滴定法2. 有关物质：HPLC(蒸发光散射检测器);3. 可见异物;4. 不溶性微粒;5. 异常毒性;6. 细菌内毒素;7. 无菌微生物检定法硫酸巴龙霉素Paromomycin Sulfate白色或微黄色的粉末；无臭，引湿性极强，遇光易变色。在水中易溶，在甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。D(水溶液) +50o+55o。1. TLC或HPLC2. IR3. 硫酸

46、盐的鉴别反应巴龙霉素组分：HPLC(蒸发光散射检测器)微生物检定法硫酸庆大霉素Gentamycin sulfate白色或类白色的粉末；无臭；有引湿性。在水中易溶，在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。D(水溶液) +107o+121o。1. TLC或HPLC2. IR3. 硫酸盐的鉴别反应1. 硫酸盐 ：HPLC;2. 庆大霉素C组分 HPLC-蒸发光散射检测器;3. 有关物质：HPLC(蒸发光散射检测器);4. 水分;5. 细菌内毒素微生物检定法硫酸奈替米星Netilmicin Sulfate白色或类白色的粉末或疏松块状物；无臭，味微苦；有引湿性。在水中易溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中不溶。D(

47、水溶液) +88o+96o。1. HPLC2. 硫酸盐的鉴别反应1. 硫酸盐：HPLC2. 有关物质：HPLC(蒸发光散射检测器);3. 水分;4. 可见异物;5. 不溶性微粒;6. 细菌内毒素微生物检定法氨基糖苷类抗生素部分原料药的物理性质、鉴别、检查和含量测定 81一、结构与性质多与硫酸成盐链霉素 3个庆大霉素 5个碱性中心碱性（1）水溶性溶解性（2）(3) 旋光性 含多个氨基糖82链霉素 pH57.5庆大霉素 pH212 稳定UV （4）稳定性（5）链霉素水解产物反应链霉素230nm有吸收,庆大、奈替米星无83二、鉴别试验 (一) 茚三酮反应 (二) Molisch试验 (三) N-甲基

48、葡萄糖胺反应(Elson-Morgan反应) (四) 麦芽酚(Maltol)反应 (五) 坂口(Sakaguchi)反应 (六) 硫酸盐反应 (七) 色谱法(八) 光谱法84(一) 茚三酮反应 本类抗生素为氨基糖苷结构，具有羟基胺类和-氨基酸的性质，可与茚三酮缩合成蓝紫色化合物。中国药典采用本法鉴别硫酸小诺霉素及其制剂。 硫酸小诺霉素的茚三酮反应鉴别法：取本品约5mg，加水1ml溶解后，加0.1%茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶0.5ml，在水浴中加热5分钟，即呈紫蓝色。 85二、鉴别试验 茚三酮反应 （一）羟基胺结构86（二）Molisch试验 具五碳糖或六碳糖结构的氨基糖苷类经酸水解后

49、，在酸作用下脱水生成糠醛（五碳糖）或甲基糠醛，这些产物遇-萘酚或蒽酮呈色。-萘酚呈色 红紫色蒽酮呈色 蓝紫色87 阿米卡星的蒽酮呈色鉴别：取本品约10mg，加水1ml 溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即显蓝紫色。 88坂口反应N-甲基葡萄糖胺反应麦芽酚反应89本类药物经水解，产生葡萄糖胺衍生物，如链霉素中的N-甲基葡萄糖胺，硫酸新霉素、硫酸巴龙霉素中的D-葡萄糖胺，在碱性溶液中与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物(I)，与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液(Ehrlich试剂)反应，生成樱桃红色缩合物(II)。 (三) N-甲基葡萄糖胺反应(Elson-Morgan反应)90N-甲基葡萄糖胺反应（三）

50、乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色（Elson-Morgan反应）(缩合吡咯衍生物)红色对二甲氨基苯甲醛H+93 硫酸链霉素的麦芽酚反应鉴别：取本品约20mg，加水5ml溶解后，加氢氧化钠试液0.3ml，置水浴上加热5分钟，加硫酸铁铵溶液(取硫酸铁铵0.1g，加0.5mol/L硫酸溶液5ml使溶解) 0.5ml，即呈紫红色。 （四）麦芽酚反应94（四）麦芽酚反应 链霉糖特有反应H+分子重排95（五）坂口反应链霉胍特有反应（或-萘酚）8-羟基喹啉 -萘酚96（六）反应H+UV法（七）光谱色谱法（八）庆大霉素无UV吸收（BP） TLC法IR法TLC法HPLC971. 薄层色谱法 Ch

51、P2010、USP34-NF29和BP2010均采用TLC法对本类抗生素进行鉴别。多以硅胶为薄层板，三氯甲烷-甲醇-浓氨水为展开剂，茚三酮或碘蒸气为显色剂。 2. 高效液相色谱法 本类药物也可根据组分检查或含量测定项下HPLC方法，通过比较供试品溶液和对照品溶液的色谱图进行鉴别。98 ChP硫酸庆大霉素注射液的TLC鉴别：取本品与硫酸庆大霉素标准品，分别加水制成每1ml中含2.5mg的溶液，作为供试品溶液和标准品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2l，分别点于同一硅胶G薄层板(临用前于105 活化2 小时)上；另取三氯甲烷-甲醇-氨溶液(1:1:1)混合振摇，放置1小时，分取下层混合液

52、为展开剂，展开，取出于2025晾干，置碘蒸气中显色，供试品溶液所显主斑点数、位置和颜色应与标准品溶液斑点数、位置和颜色相同。 99BP(2010)对硫酸链霉素注射液的鉴别方法如下： Carry out the method for thin-layer chromatography, using a silica gel precoated plate (Merck silica gel 60 plates are suitable) and as the mobile phase the lower layer obtained by shaking together equal volum

53、es of 13.5M ammonia, chloroform and methanol and allowing to separate. Apply separately to the plate (1) a volume of the injection containing the equivalent of 30 g of gentamicin and (2) 0.1 mg of gentamicin sulphate British Pharmacopoeia Chemical Reference Substance dissolved in a volume of water e

54、qual to the volume of the injection used. After removal of the plate, allow it to dry in air, spray with ninhydrin solution R1 (Dissolve 1.0 g of ninhydrin in 50 ml of ethanol (96%) and add 10 ml of glacial acetic acid.) and heat at 105 for 2 minutes. The three principal spots in the chromatogram ob

55、tained with solution (1) correspond to the three principal spots in the chromatogram obtained with solution (2).100(八) 光谱法 1. 红外吸收光谱 中国药典和英国药典均采用红外光谱法鉴别本类药物，如硫酸庆大霉素、硫酸巴龙霉素、硫酸卡那霉素、硫酸阿米卡星、硫酸新霉素、硫酸链霉素等。 2. 紫外吸收光谱 本类药物多无紫外吸收，故其鉴别试验中很少采用紫外法。但BP2010利用这一性质，采用紫外法对庆大霉素进行鉴别， 101 硫酸庆大霉素的UV鉴别：取硫酸庆大霉素10mg，加水1ml和

56、40%硫酸溶液5ml；在水浴中加热100分钟，冷却，用水稀释至25ml。取该溶液进行紫外扫描，在240nm330nm范围内应无最大吸收。 102三、有关物质及组分分析(一) 有关物质检查 (二) 组分测定 (三) 硫酸盐检查 103(一) 有关物质检查 现版各国药典对本类抗生素的有关物质检查主要采用TLC和HPLC法。104(二) 组分测定 本类抗生素多为同系物组成的混合物，同系物的效价、毒性各不相同，为保证药品的质量，必须控制各组分的相对含量，如ChP对硫酸庆大霉素、硫酸小诺霉素等规定了组分分析。105对微生物的活性无明显差异毒副作用和耐药性不同发酵菌种不同工艺差别C组分比例不一致规定控制各

57、组分的相对百分含量ChPUSPBPJP庆大霉素C组分的测定106 庆大霉素C1、C2、C1a对微生物的活性无明显差异，但其毒副作用和耐药性有差异，导致各组分的多少影响产品的效价和临床疗效。因此中、英、美、日等国药典均规定控制各组分的相对百分含量。ChP2010、USP34-NF29和BP2010均采用高效液相色谱法测定庆大霉素C各组分的含量。 庆大霉素无紫外吸收，当采用紫外检测器检测时，需进行衍生化处理。由于其具有强极性和水溶性，为获得理想的色谱结果，可采用蒸发光散射检测器或利用庆大霉素C组分结构中的氨基与邻苯二醛(o-phthaldehyde，OPA)、巯基醋酸在pH10.4的硼酸盐缓冲液中

58、反应，生成1-烷基-2-烷基硫代异吲哚衍生物，在330nm波长处有强吸收。107108max = 330nm衍生化原理 1、蒸发光散射检测器(ELSD) 2005年版药典 ChP2000年版 109RPHPLC方法 2.规定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%计算 3.峰面积归一化法110 ChP庆大霉素中庆大霉素C组分的HPLC检测：ChP采用蒸发光散射检测器检测庆大霉素中庆大霉素C组分： USP庆大霉素中庆大霉素C组分的衍生化紫外检测HPLC测定法： BP庆大霉素中庆大霉素C组分的HPLC柱后衍生化法电化学检测测定法： 111(三) 硫酸盐检查 本类抗生素临床

59、应用的主要为硫酸盐，各国药典规定EDTA络合滴定法或HPLC法测定硫酸盐含量，作为组分分析。112 硫酸卡那霉素中硫酸盐测定方法(EDTA络合滴定法)：取本品约0.18g，精密称定，加水100ml使溶解，加浓氨溶液调节pH值至11后，精密加氯化钡滴定液(0.1mol/L)10ml、酞紫指示液5滴，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定，注意保持滴定过程中的pH值为11，滴定至紫色开始消褪，加乙醇50ml，继续滴定至蓝紫色消失，并将滴定结果用空白试验进行校正。每1ml氯化钡滴定液(0.1mol/L)相当于9.606mg，本品含硫酸盐的量按无水物计算应为23.0%26.0%。 113

60、硫酸依替米星中硫酸盐测定方法(HPLC法)：精密量取硫酸滴定液适量，用水定量稀释制成每1ml中约硫酸盐(SO4)0.075mg、0.15mg和0.30mg的溶液作为对照溶液(1)、(2)、(3)。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(pH 值范围0.88.0)；以0.2mol/L三氟醋酸-甲醇(8416)为流动相；流速为每分钟0.5ml；用蒸发光散射检测器检测(参考条件：漂移管温度100C，载气流速为每分钟2.6L)，取依替米星和奈替米星对照品各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中各0.2mg的混合溶液，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图，依替米星峰和奈替米星峰的分离度应大于1.2，连续5次进样，依替