分子生物学实验大全

1、实验方法大全建立一个良好的、具有示范意义的实验室规范是建立一个优秀实验室的最为基本的、必要的、关键的前题。正文目录正文目录i表格目录ii信息准备1基本鉴定神经活性因子所需项目1冰冻切片1cRNA探针标记1PCR Dig Probe Synthesis2Dig Easy Hyb杂交方案2原位分子杂交(ISH)3RACE实验方案5Northern Blot & Dot Blot6Northern Blot杂交-mRNA膜杂交6随机引物标记DNA探针(试剂盒:Promega, U1100)7DNA纯化柱制作8RNA Master Blot放射性探针杂交检测8多组织Northern Blot放射性探针

2、杂交检测8细菌培养9液体细菌培养9固体细菌培养10菌种的保存10感受态细胞的制备和保存10感受态细胞的制备10感受态细胞的冻存11质粒的提取和纯化11质粒DNA的小量提取和纯化11限制酶酶切反应12质粒的酶切，小量酶解反应12DNA的重组12T-载体连接(T/A cloning)12粘端连接法13平端连接法14平-粘端连接法(定向连接反应)15重组质粒的转化15重组质粒的鉴定17a-互补17插入失活17菌落原位杂交18限制酶酶切分析19琼脂糖凝胶电泳19从凝胶中回收DNA19PCR技术20细胞培养21无菌操作21试剂及材料21细胞的复苏22培养细胞换液22培养细胞的传代23细胞的冻存23细胞计

3、数23细胞转染24转染质粒的制备24脂质体转染系统24新生大鼠皮层神经元分离与培养24Western Blot(Immunoblotting)26蛋白质样品的准备26细胞胞浆样品准备26细胞培养上清样品准备26细菌培养菌体蛋白样品准备26SDS凝胶电泳26SDS凝胶电泳26SDS凝胶的考马斯亮蓝染色28SDS凝胶的银染29SDS-聚丙烯酰胺凝胶的干燥29转膜30免疫反应30显 色31DAB显色31ECL显色31表格目录表格 1、信息准备1表格 2、RNA探针标记体系1表格 3、PCR法Dig探针标记体系2表格 4、PCR法Dig探针反应参数2表格 5、抗体稀释液3表格 6、0.2mol/L N

4、aH2PO43表格 7、0.2mol/L Na2HPO43表格 8、0.2mol/LPB(pH7.2)(Method I)3表格 9、0.2mol/LPB(pH7.2)(Method II)3表格 10、RACE之PCR反应体系5表格 116表格 126表格 13、随机引物标记DNA探针反应体系7表格 14、RNA Master Blot杂交检测反应体系8表格15、LB液体培养基9表格16、LB固体培养基10表格 17、0.1mol/L CaCl2溶液11表格 18、TE buffer配制方案11表格 19、双酶切反应体系12表格 20、pGEM-T连接体系13表格 21、单次连接反应中PCR

5、产物最低浓度要求13表格22、平端PCR产物加尾体系13表格 2314表格 2414表格 2514表格 2615表格 27、LB液体培养基配方16表格 28、LB固体培养基配方16表格 29、SOC培养基配方16表格 30、Mg2+ stock(2M)16表格 3119表格 3220表格33、0.25% Trypsin-0.04% EDTA消化液:500ml22表格34、细胞冻存液23表格35、DMEM培养基24表格 36、30%凝胶贮备液26表格 37、10%SDS27表格 38、5电泳缓冲液27表格 39、10%过硫酸胺27表格 40、1.5mol/L Tris-Cl(pH8.8)27表格

6、 41、1.0mol/L Tris-Cl27表格 42、2Sample Buffer27表格 43、凝胶(分离胶)浓度的选择27表格 44、分离胶的制备28表格 45、配制Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳5%浓缩胶所用溶液28表格 46、脱色液28表格 46、考马斯亮蓝(Commassise blue R250)染液29表格 47、TBS配方(Western Blot用)30表格 48、TBST配方(Western Blot用)31表格 49、Blocking buffer配方(Western Blot用)31信息准备表格 1、信息准备基本鉴定神经活性因子所需项目范明:118呼256

7、0；孙焕东:118呼7728基因序列分析；表达产物纯化分析；测活系统；分布/表达谱；发育变化；作用类型(何种神经元)；与其他因子比较(活性)；转染后测活。冰冻切片器材:尖镊子、DEPC水(替代防冻液)、玻璃吸管(加液体)、单面刀片(修整组织块)、卫生纸(擦拭冷冻台等)。切片最佳温度:-1520，如果组织块表面过冷，切片将变为粉末状不可用，此时可戴乳胶手套用大拇指给组织块表面提高温度。此种处理可对后续的35张切片有效。切片时如果防卷板工作不正常，可用左手食指按压协助。cRNA探针标记试剂:Roche/BM公司产品Dig BA Labeling Kit(SP6/T7), Cat #1175025,

8、 Kit for 210 labeling/transcription reactions。常规下，1ug DNA?10ug NA。DEPC水，0.2M EDTA, 4M LiCl, 预冷的100%乙醇，预冷的70%乙醇流程:在置于冰上、无RNase的灭菌1.5ml Epp管中建立以下反应体系:表格 2、RNA探针标记体系模板DNA1ugNTP labeling mixture(vial 7)2ultranscription buffer(vial 8)2ulRNase inhibitor(vial 10)1ulDEPC水调整体积?18ulSP6 or T7 RNA polymerase(vi

9、al 11 or 12)2ul总体积20ul用枪头混匀，离心。37孵育2h；(可选)加入2ul无RNase的DNase(vial 9)，37孵育15min以去除模板DNA；加入2ul EDTA终止反应；向管中加入2.5ul 4M LiCl(1/10体积)和75ul(2.5倍体积)预冷的无水乙醇；离心，12,000rpm15 min(如果标记理想，可见沉淀片);加入预冷的70%乙醇100ul洗济沉淀片15min，可更换一次，弃上清；真空干燥或者室温自然干燥，以使乙醇挥发完全；用100ul DEPC水溶解沉淀，分装为5ul/管，保存于-70备用。此时可用杂交液保存备用(按照1:200浓度，即每管加

10、入1ml杂交液)使用浓度:建议1:2001:1000调试进行。PCR Dig Probe Synthesis试剂:Roche/RM产品，PCR Dig Probe Synthesis Kit, Cat #1636090, Kit fot 25 polymerase chain eaction(50ul).流程:冰上操作，向PCR管中加入反应体系:表格 3、PCR法Dig探针标记体系试剂加入量Control/ Taq DNA poly-merase, Takara product灭菌重蒸水36.25ul15.25ul10PCR buffer with MgCl2(vial 3)5ul10 Buf

11、fer: 2.5ul10PCR Dig mix(vial 2)5uldNTP: 4ulPrimer 11ul1ulPrimer 21ul1ulEnzyme mix, ExpandHigh Fidelity(vial 1)0.75ulTaq DNA polymerase, Takara product: 0.25ul模板DNA(/质粒DNA作为模板时无需纯化)1ul1ul总体积50ul25ul枪头混匀，稍离心使液体沉底；滴加适量液体石蜡油；启动PCR反应，参考反应条件如下:表格 4、PCR法Dig探针反应参数File #801952min?File #7910(9510sec?6030sec?7

12、22min)?File #7820(9510sec?6030sec?722min+5sec)?File #971727min?File #96100min(产物保护)电泳检测并半定量；使用前需经95100变性5min，然后置冰浴中直至加入杂交液使用。使用推荐剂量:2ul/ml杂交液。Dig Easy Hyb杂交方案试剂:Roche/RM产品，Dig Easy Hyb, , Cat #1603558, 500ml, Hybridization solution for nucleic acid blots with digoxigenin-labeld probes.流程(for DNA:RNA

13、 hybridization):将适量杂交液预热到合适的杂交温度；用此杂交液孵育杂交膜30min，并轻轻搅动；Dig探针(525ng/ml for DNA-probes, 100ng/ml for RNA-probes)煮沸变性，并快速置于冰上冷却；将探针加入到预热的杂交液中并混匀，防止气泡形成；倒掉预杂交液，马上加入含有探针的杂交液；孵育至少6h，并轻轻晃动。原位分子杂交(ISH)实验器材:搪瓷盆，木制动物固定台(1)，图钉，大剪刀，小剪刀，镊子，止血钳，输液架，输液瓶及网兜，输液器及针头，以及试剂配制:DEPC水(1)，1000ml: DEPC液1ml +ddH2O1000ml。振荡过夜，

14、次日高压生理盐水(8.5%)，1000ml: NaCl8.5g+ddH2O1000ml30%蔗糖溶液(100ml):蔗糖30g + 0.1mol/L PB(RNase free)80ml，4保存。抗体稀释液(10ml): 表格 5、抗体稀释液10% BSA0.2ul3% Triton1ml0.01mol/L PBS8.8ml总体积10ml0.2mol/L NaH2PO4:表格 6、0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO42H2O31.2g蒸馏水?1000ml微波炉加热助溶0.2mol/L Na2HPO4:表格 7、0.2mol/L Na2HPO4Na2HPO412H2O71.632g蒸馏

15、水?1000ml微波炉加热助溶0.2mol/LPB(pH7.2)表格 8、0.2mol/LPB(pH7.2)(Method I)试剂加入量0.2mol/L NaH2PO419ml0.2mol/L Na2HPO481ml室温保存表格 9、0.2mol/LPB(pH7.2)(Method II)试剂加入量Na2HPO4.12H2O58.02gNaH2PO4.2H2O5.928gddH2O(Rnase free，if needed)调节体积?1000ml0.1mol/L NaOH调节pH7.2,高压0.1mol/L PBS(RNase free):用0.2mol/L PB稀释计算0.1mol/L甘氨

16、酸/0.1mol/L PBS(RNase free): 自行计算0.3% Triton X-100/0.1mol/L PBS(RNase free): 自行计算10mg/ml蛋白酶K(RNase free): 100mg蛋白酶K溶于10ml DEPC水中，分成小份，-20保存。使用浓度:2ug/ml(储存液稀释5000倍)4%多聚甲醛 /0.1mol/L PB: 自行计算20SSC :1mol/L Tris-HCl(1)pH7.5Tris(三羟甲基氨基甲烷)60.5gddH2O400ml浓盐酸37.5ml调节pH值至7.5, 补足至500ml(2)pH8.0、pH9.0配方同上，用浓盐酸调pH

17、值至8.0和9.0，最后将总体积补足至500ml。5mol/L NaCl: 自行计算1mol/L MgCl2:自行计算TSM1(1000ml):0.1mol/L Tris-HCl, pH8.0100ml5 mol/L NaCl20ml1mol/L MgCl210mlddH2O870ml用Tris/HCl调节至pH8.0TSM2(1000ml)0.1 mol/L Tris-HCl, pH9.5100ml5 mol/L, NaCl20ml1 mol/L, MgCl250mlddH2O830ml用Tris/HCl调节至pH9.5操作流程:注:下面所用的PBS为0.1M，pH7.3；Tris-HCl为

18、0.1M。阴性对照:(1)杂交液中不加探针；(2)杂交前用RNase消化组织。(1)大鼠麻醉: 1%戊巴比妥钠腹腔注射(1ml/200g体重)(2)生理盐水灌注: 250ml/200g体重(3)4%多聚甲醛灌注: 250ml/200g体重(4)4%多聚甲醛后固定: 6h或过夜(5)30%蔗糖，4，过夜，至组织块沉降(6)冰冻切片: 1530um(7)0.1M PBS(pH7.2, 无RNase)， 53次 从此处到进入杂交液以前约需。(8)0.1M 甘氨酸/0.1M PBS(无RNase)， 5(9)0.3% Triton X-100/0.1M PBS(无RNase), 25蛋白酶无，溶解于(

19、11)4%多聚甲醛/0.1M PB， 5(12)0.1M PBS(无RNase)， 53次(13)0.1M Tris-HCl，10(新配, pH8.0, 含0.25%乙酸酐)(14)2SSC(无RNase)，10(15)加杂交液，422024h10ul20ul/切片，稀释比例:1:100(0.5ug/ml)盖玻片应经DEPC水处理(16)4SSC，15从此处到进入抗体以前约需。(17)2SSC，3730(含RNase A, 20ug/ml)(18)1SSC，3710(19)0.5SSC，3710(20)0.05M PBS，103次(21)加抗体，3734h, 2030ul/切片Anti-Dig

20、-AP，稀释:1:1000抗体稀释液成份:0.05M PBS(pH7.2)， 1% BSA，0.4% Triton X-100(22)0.05M PBS，103次从此处到进入显色液以前约需。(23)TSM1，103次(24)TSM2，103次(25)加显色液，室温，避光显色，13h，10起间断观察NBT/BCIP，稀释比例:1:50(用TSM2)(25)蒸馏水冲洗，室温干燥, 无水乙醇脱水, 二甲苯透明,封片RACE实验方案试剂:ClonTech试剂盒或Roche/BM RACE试剂盒，流程:引物设计，实验Primer Premier完成，要求GC%=50%60%，Tm70；于冰上制作反应体系

21、:表格 10、RACE之PCR反应体系电泳检测；内引物对核实；片段放大；重组并测序。Northern Blot & Dot BlotNorthern Blot杂交-mRNA膜杂交试剂及材料1、随机引物标记cDNA探针试剂盒:Nuclease-free Water5Lebelling BufferdNTPs:dATP、dTTP、dGTPNuclease-free BSADNA Polymerase I, Large Fragment(Klenow)2、DNA模板3、-32P-cCTP4、染料:5、TEN:表格 111TEN终浓度贮存液用量用量TrisCl10mM,pH8.01M,pH8.010m

22、l5mlEDTA1mM,pH8.00.5M,pH8.02ml1mlNaCl100mM5M20ml10ml加水至1000ml500ml室温贮存。 6、杂交液:ExpressHyb Hybredization Solution(通用)7、10mg/ml剪切的鲑精DNA:8、20SSC表格 123M NaCl175.3g0.3M Na3Citrate2H2O88.2g用1M HCl调pH7.0加水至1000ml 室温贮存。9、10% SDSSDS100g蒸馏水1000ml 加热65，助溶。室温贮存。10、洗液1(Array & dot通用)配方贮存液用量用量2SSC20SSC100ml50ml1%

23、SDS10% SDS100ml50ml加水至1000ml500ml 室温贮存。11、洗液2(Array & dot通用)配方贮存液用量用量0.1SSC20SSC5ml2.5ml0.5% SDS10% SDS50ml25ml加水至1000ml500ml 室温贮存。12、洗液1(Northern通用)配方贮存液用量用量2SSC20SSC100ml50ml0.05% SDS10% SDS5ml2.5ml加水至1000ml500ml 室温贮存。13、洗液2(Northern通用)配方贮存液用量用量0.1SSC20SSC5ml2.5ml0.1% SDS10% SDS10ml5ml加水至1000ml500

24、ml 室温贮存。14、0.5% SDS配方贮存液用量用量0.5% SDS10% SDS50ml25ml加水至1000ml500ml15、显影液16、定影液17、杂交膜随机引物标记DNA探针(试剂盒:Promega, U1100)器材及试剂:准备沸水(电炉、微波炉等)，制冰，DNA纯化柱，Sephidex G-50，TEN洗注液，20个Epp管流程:将标记试剂盒中的Klenow大片段置于-20冰盒中，其余试剂置于冰上融解；DNA模板变性:95100，2min后快速冰上冷却；在1.5ml离心管中依次加入以下试剂:表格 13、随机引物标记DNA探针反应体系试剂终浓度用量加入量Nuclease-fre

25、e Water29ulLabeling 5Buffer110ul10ulMixture of the unlabelled dNTPs2ul0.7ul3Denatured DNA Template500ng/ml25ng1ulNuclease-free BSA400ug/ml2ul2ula-32P-dCTP(进入同位素室后加入)333nM5ul5ulDNA Polymerase I, Large Fragment(Klenow) (进入同位素室后加入)100u/ml1ul(5U)1ul总体积50ul50ul注:Water+Template的体积应为30ul。轻轻混匀，室温反应至少1h；终止反应

26、:951002min，快速冰上冷却。纯化探针:50ul体系10ul染料，用100ul Tips全部滴加到纯化柱中(上层液体已流完)。缓慢滴加TEN。待液体流出10滴左右起用1.5ml离心管收集，4滴/管。收集1020管。随后计数各管的CPM值。一般采用第1、2、3连续高峰合并得到400ul600ul探针，取100ul使用。不用时置于铅盒中，-20保存。DNA纯化柱制作器材及试剂:纯化柱，Sephidex G-50，蒸馏水流程:取适量Sephidex G-50用水膨胀，洗；填柱，如不均，用细药勺勾兑；RNA Master Blot放射性探针杂交检测试剂:杂交液，洗液I，洗液II流程:准备预杂交液

27、: 15ml杂交液预热5060；150ul(1.5mg)鲑精DNA，951005min；快速冰上冷却； 将变性的鲑精DNA同预热的杂交液混合。预杂交:将膜放入10ml预杂交液中，杂交炉中6530min，不停摇动。准备探针:在离心管中加入下列试剂表格 14、RNA Master Blot杂交检测反应体系试剂用量加入量放射性标记的DNA探针20ug, 10-20106 CPM150ulC0t-1 DNA30ug-鲑精DNA150ug15ul20SSC50ul总体积215ul951005min?6530min加入已预热的剩余的5ml预杂交液中，充分混合。杂交:倒出预杂交液，加入含有探针的杂交液。于杂

28、交炉中656h或过夜，不停摇动。洗膜:小心地倒出杂交液，弃入废液缸。预热洗液1:200ml，6520min4，不停摇动；预热洗液2:200ml，5520min2，不停摇动。取膜:用镊子从取出膜，抖去多余的洗液，立即将潮湿的膜包入保鲜膜中。检测放射量:背景500，则过夜即可。如CPM在100左右，则3天或更多。洗片:显影13min，定影10min，流水冲洗30min。洗膜:从膜上洗去cDNA探针，以便再次使用。150200ml 0.5%SDS，煮沸10min；冷却10min；取出膜，检测CPM值，如果仍可查出放射性(CPM20)，则重复洗膜；将膜放入杂交管，进行下一轮实验或包装于保鲜膜中-20储

29、存备用。多组织Northern Blot放射性探针杂交检测试剂:杂交液，洗液I，洗液II流程:预热杂交液: 杂交液预热68；摇动至沉淀完全溶解。预杂交:将膜放入至少5ml杂交液中，68，30min，不停摇动。探针变性:放射性标记的探针，95100，25min，迅速冰浴。加探针:加100ul200ul探针到预热的5ml新鲜杂交液中，充分混合。杂交:倒出预杂交液或回收，加入含有探针的杂交液。68，1h，不停摇动。洗膜:小心地倒出杂交液，弃入适当的废液缸。洗液1，室温，20min3，不停摇动；洗液2，50，20min2，不停摇动。取膜:用镊子从管中取出膜，沥去多余的洗液。将潮湿的膜包入保鲜膜中。计数

30、检测放射性，若未洗干净，用洗液2加洗一次。放射自显影:压片，将膜用胶带在增感屏上，一般压3张，-70，一般3天后检测。洗片:显影13min，定影10min，流水冲洗30min。洗膜:从膜上洗去cDNA探针，以便再次使用。150200ml 0.5%SDS，煮沸10min；冷却10min；取出膜，检测CPM值，如果仍可查出放射性(CPM20)，则重复洗膜；将膜放入杂交管，进行下一轮实验或包装于保鲜膜中-20储存备用。细菌培养液体细菌培养试剂及材料:1、 LB液体培养基:表格15、LB液体培养基胰蛋白胨(bacto-tryptone)10.0g5.0g酵母提取物(yeastextract)5.0g2

31、.5gNaCl10.0g5.0g去离子水定容至1000ml500ml 用5M NaOH调pH7.0。(进口试剂不必调)高压灭菌。2、50mg/ml氨苄青霉素: 氨苄青酶素钠溶于水中；过滤；分装贮存在-20。 使用浓度:50ug/ml。3、 16或18ml培养管；脱脂棉；枪头；吸管；(高压灭菌)。4、 镊子；试管架；酒精灯；加样器；三角烧瓶；摇床。小量培养操作程序:取灭菌的16或18ml的培养管，加入35ml LB培养基。再加入50mg/ml氨苄青霉素35ul，(如培养宿主菌则不加抗生素)，也可将抗生素先加入LB培养基中。用无菌牙签(或枪头)调取单菌落，送入培养液，(或取菌液100ul，加入培养

32、液中)，用无菌棉球封好管口。37，摇床培养，100200 r/min，至生长饱和，约612 h，可过夜培养。大量培养操作程序:在培养瓶中加入LB液体培养基100200ml，高压灭菌。每ml LB加氨苄(50mg/ml)1ul(终浓度50ug/ml)。每ml培养基加菌液510ul(终浓度0.51%)。100200r/min 37摇床培养至OD值0.60.8。固体细菌培养试剂及材料1、 LB固体培养基 普通培养基:在液体培养基中加入1.5%琼脂制成。表格16、LB固体培养基胰蛋白胨(bacto-tryptone)10.0g5.0g酵母提取物(yeast extract)5.0g2.5gNaCl 1

33、0.0g5.0g琼脂粉15.0g7.5g去离子水定容至 1000ml500ml 高压灭菌20min；取出后在无菌状态下铺板。 选择性培养基: 将消毒的固体培养基置室温下，冷却至50时加入抗生素或其它必需的添加成份。 如氨苄青霉素50ug/ml，即每ml培养基中加氨卞贮存液(50mg/ml)1ul。 摇匀后，无菌状态下，倒入灭菌的平皿中，培养基厚23mm，室温放置23h或37放置半小时，使其固化。4保存待用。操作程序采用划痕法接种:菌种的保存菌种保存液:甘油溶液(80%或100%皆可):高压灭菌DMSO溶液操作程序:1、 取1.5ml离心管，加入0.3ml保存液(100%甘油)。2、 加入0.7

34、ml菌液，混匀后，贮存于-70。感受态细胞的制备和保存感受态细胞的制备试剂及材料:LB液体培养基:不含抗菌素。0.1mol/L CaCl2溶液:表格 17、0.1mol/L CaCl2溶液无水CaCl2 1.1g5.5g双蒸去离子水?100ml500ml0.22um滤器过滤除菌；置于灭菌试剂瓶中，4保存。E. coli单菌落或冻存菌种(如JM109)。流程:取菌种(JM109)100ul接种至含3ml LB的玻璃试管中/菌种复苏；200rpm250rpm37振摇过夜/12h16h；次日取菌液100ul至含10ml LB的试管中(1:100)；37剧烈振摇23h；待OD600值达到0.30.4时

35、，取出，立即置冰浴1015min；/自本步起需无菌操作；将细菌移到预冷的10ml塑料离心管中；离心:4 4,000g 10min；弃培养液，将管倒置于滤纸上1min/可用无菌枪头吸去残留培养液；加预冷的0.1mol/L CaCl2 2ml重悬菌体；置冰浴30min；离心:44,000g10min；弃上清液，倒置于滤纸上1min/可用无菌枪头吸去残留培养液；再加400ul预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体(操作要轻)，分装为200ul/管或者50ul/管；置4冰箱1224小时，即可用于转化，或者加甘油冻存于-70备用。注：上述试剂用量为制备10ml菌液的量；若制备200ml菌液，则在上述

36、基础上乘以20。感受态细胞的冻存将感受态细胞分装成200ul/管；每份加30%体积(80ul)的甘油保存液。置-70，可保存3个月之久。质粒的提取和纯化质粒DNA的小量提取和纯化采用Wizarda Plus Minipreps DNA Purification systerm, 100preps。Promega Cat. #A7500。常规产量:81.5mlDH5a16hovernight?3.0ug质粒；33.0mlDH5a16hovernight?5.0ug质粒一、每Kit所含的试剂及物品:Cell Resuspension Solution(A711B)，内含RNase A:；Cell

37、Lysis Solution(A712B)，内含NaOH和SDS，为碱裂解法；Neutralization Solution(A713D)，为醋酸钾；Wizard Minipreps DNA Purification Resin(A767B)Column Wash Solution(A810B)，内含55%乙醇及TE: Wizard Minicolumn(A129A): Syring Barrels(809B):二、 自备试剂和物品:真空泵或2.5ml或者5ml注射器。无菌蒸馏水或TE缓冲液。表格 18、TE buffer配制方案试剂终浓度Tris-HCl, pH7.510mMEDTA1mM9

38、5%酒精。三、用前，用95%乙醇稀释Column Wash Solution四、流程:将5 ml 培养物转入5ml离心管或者10ml离心管中，离心，10,000g10min；细胞重悬:加入300ul Cell Resuspension Solution , 重悬细胞沉淀。细胞裂解:加入300ul Cell Lysis Solution , 颠倒4次混匀。蛋白沉淀:加入300ul(如果为endA阳性，则用量加倍)Neutralization Solution, 颠倒4次混合。将细菌溶解产物离心，10,000g10 min，室温。此时可吸取20ul电泳鉴定质粒大小；/树脂用前需要强力振荡混匀。f、

39、g可先将树脂吸入注射器中，然后用此注射器吸取细胞的裂解上清。将上清液吸至1.5ml离心管，加入DNA纯化树脂1ml。用注射器取混合液，混匀，将混合液推入Minicolumn中。取2.5ml洗柱液，推入Minicolumn中，液体流入废液缸。将柱装在离心管上，室温离心，12,000rpm2 min。将柱移至新的离心管上，加入50ul水或TE，等1分钟；离心，12,000g30sec，洗脱质粒。弃去Minicolumn，将管中的质粒贮存在4或-20。限制酶酶切反应质粒的酶切，小量酶解反应主要用于质粒的酶切鉴定，20ul体积中含0.21ug DNA。流程:在新的灭菌的0.5 ml离心管中依次加入下列

40、试剂:表格 19、双酶切反应体系质粒DNA(+水)?16ul10Buffer K(兼容体系)2ul限制酶: EcoR 1ul BamH1ul总体积20ul稍离心，混合。37水浴或温箱，11.5 h。取出后电泳分析鉴定是否酶解。 DNA的重组T-载体连接(T/A cloning)(一)、试剂:外源片段DNA；pGEM-T载体，Promega: A1360, A180, A3600 and A3610/TM042；(二)、流程:将pGEM-T离心至管底；建立以下连接体系(每次使用前切记将2Buffer振荡混匀):表格 20、pGEM-T连接体系成份10ul体系20ul体系2Rapid Ligati

41、on, T4 DNA Ligase需要按照每次用量分装，避免多次冻融。5ul10ulpGEM-T1ul1ulPCR product(含有粘性A末端)3ul(Maximum)8ul(Maximum)T4 DNA Ligase(3 Weiss units/ul)1ul1ul用Tip吹打混匀，室温1h或4过夜说明:A、单次连接反应中PCR产物最低浓度要求:表格 21、单次连接反应中PCR产物最低浓度要求PCR产物大小反应体系最低含量要求每ul含量0.5kb125ng8.5ng41.5ng1kb250ng17ng83ng2kb500ng34ng166ngB、平端PCR产物加尾体系(for effici

42、ent T/A cloning):表格22、平端PCR产物加尾体系成份加入量实用量参考纯化的无A末端的PCR产物17ul7ulTaq DNA Polymerase 10Reaction Buffer with MgCl21ul1uldATP终浓度0.2mM0.2ul(from王升启)Taq DNA Polymerase5units1ul(Takara产品)去离子水调整体积?10ul反应:701530min此步后可电泳回收，用10ul水溶解离心，吸取3ul(10ul体系)或者8ul(20ul体系)进行连接反应吸取12ul和pGEM-T载体建立连接反应可将10ul全部用于连接反应准备转化JM109

43、宿主细胞，蓝白斑筛选。粘端连接法试剂及材料:1、 含目的基因片段的DNA:如NDF1/pcDNA1。2、 载体DNA:如pcDNA3；pET22B；3、 10Buffer K:4、 限制性内切酶:BamH I； EcoR I；5、 去离子双蒸水6、 10连接buffer7、 T4DNA连接酶操作程序:1、 制备目的基因片段和载体:建立如下酶切反应:表格 23去离子双蒸水6ul-DNA(13ug)10ul16ul10Buffer K2ul2ulBamH I1ul1ulEcoR I1ul1ul总体积20ul20ul 37，12h。2、琼脂糖凝胶电泳回收目的基因片段和线性化载体。3、在1.5ml E

44、p管中建立连接反应:表格 24目的基因片段(0.4ug)13ul6ul载体DNA(0.1ug)4ul2ul10连接Buffer2ul1ulT4DNA连接酶1ul1ul去离子双蒸水至总体积20ul10ul 16，1216h。4、将连接的重组质粒转化大肠杆菌，根据不同用途选择不同菌种制备感受态细胞。平端连接法试剂及材料1、 含目的基因片段的DNA:如NDF1/pcDNA1；2、 载体DNA:如pGEM-T Vector System(Promaga)3、 去离子双蒸水4、 TE(pH8.0)5、 10连接buffer或2连接buffer6、 T4DNA连接酶操作程序1、制备目的基因片段和线性化载体

45、。 采用PCR技术从NDF1/pcDNA1中扩增出NDF1片段。 去5-P的线性化载体(pGEM-T):由试剂公司提供。 2、连接反应:表格 25、连接反应体系目的基因(平端)(0.5ug)7ul3ul载体(pGEM-T)(0.1ug)1ul1ul10连接Buffer1ul-2连接Buffer-5ulT4DNA连接酶1ul1ul去离子双蒸水至10ul10ul 16，1624h。3、转化大肠杆菌，并进行克隆筛选鉴定。平-粘端连接法(定向连接反应)试剂及材料1、 含目的基因片段的DNA:2、 载体DNA3、 限制性内切酶4、 T4DNA连接酶5、 Klenow大片段6、 2mM dNTP7、 10

46、Klenow buffer操作程序1、 制备目的基因片段和线性载体: 将载体双酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收，使其两端位点不同，防止连接时自身环化。 将含目的基因片段的DNA双酶切，其中必需只有一种与载体酶切所有的酶相同；琼脂糖凝胶电泳回收。2、 粘端连接: 目的基因片段和载体各有一匹配末端，先用T4DNA连接酶作用12h，将其连接起来； 而另一端不匹配，无法连接。此时即形成载体连接有目的基因的开环结构。3、 Klenow补平反应，将带有目的基因载体两端的粘性末端补平:表格 26、连接反应体系带目的基因的载体(0.1ug)4ul10Klenow buffer2ulKlenow大片段1ul2mM d

47、NTP2ul去离子双蒸水至总体积20ul 室温2h后，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀。 溶于10ul TE(pH8.0)。4、平端连接: 再用T4DNA连接酶作用1620h，使带有目的基因片段的载体环化。5、将重组质粒转化感受态细胞。6、克隆筛选鉴定重组质粒。重组质粒的转化准备:感受态细胞；抗性平板；预热SOC培养基；水浴42；制冰IPTG stock solution(0.1M): 1.2g IPTG(Cat. Promega#V3951)+50ml双蒸去离子水，过滤除菌，4保存。X-Gal(2ml):100mg IPTG(Cat. Promega#V3941)溶解于2ml二甲酰胺(N,N-dime

48、thyl-formamide)中，铝箔纸封口，-20保存。LB培养基:表格 27、LB液体培养基配方Bacto-tryptone10gBacto-yeast extract5gNaCl5g去离子水?1000ml用NaOH调节至pH7.0，高压灭菌表格 28、LB固体培养基配方Bacto-tryptone10gBacto-yeast extract5gagar15gNaCl5g去离子水?1000ml用NaOH调节至pH7.0，高压灭菌含有ampicillin的LB培养板:在1000ml LB培养基中加入15g agar(琼脂)，高压。冷却至50左右时加入氨苄青霉素(Amp)至终浓度100ug/m

49、l。按照3035ml/85mm培养皿铺板。凝固后置37中30min1h，4保存备用。含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板:按上述方法制作LB培养板，加入ampicillin,加入至0.5mM IPTG和80ug/ml X-Gal后倒板。或者加入100ul 100mM IPTG和20ul 50mg/ml X-Gal至平板表面，3730min可完全吸收后使用。SOC培养基:表格 29、SOC培养基配方Bacto-tryptone2.0gBacto-yeast extract0.5gNaCl, 1mol/L1mlKCl, 1mol/L0.25ml双蒸去离子水97ml搅拌助溶，高

50、压，冷却至室温Mg2+ stock, 2M, 已过滤除菌(实际可高压)1mlGlucose, 2M, 已过滤除菌1mlMg2+ stock(2M)表格 30、Mg2+ stock(2M)MgCl26H2O20.33gMgSO47H2O24.65g双蒸去离子水?100ml过滤除菌/实际可高压流程(根据 pGEM-T说明书):准备LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，使用前将平板预热至室温；离心连接反应管。吸2ul连接体系至置于冰上的灭菌1.5ml Epp离心管中；从-70中取出冰冻的感受态细胞(如JM109)，置冰浴中约5min至刚刚融化。轻轻晃动使细胞混匀；吸取50ul细胞至上述连接反应管中

51、；/实际吸取200ul感受态细胞轻晃Epp管以混匀，至冰上20min；于准确调温的42水浴中热休克4550sec，切勿轻晃、震动；将Epp管返回冰上2min；加入950ul已经预热到室温的SOC培养基至Epp管中；/实际加入750ulSOC培养基摇菌:371.5h(150rpm)；铺板:将100ul转化体系铺板至准备好的LB/amp/IPTG/X-Gal平板；/实际此时才加入IPTG(4ul)+X-Gal(40ul) 或者其它筛选用抗生素，然后将1ml全部铺板液体被吸收后倒置培养37过夜，后置4下以便蓝白斑鉴定重组质粒的鉴定a-互补原理:适用于含有b-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体，载体含有

52、LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。材料及试剂1、 X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-b-D-半乳糖苷):20mg/ml:20mg X-Gal溶于1ml二甲基甲酰胺，-20避光保存。2、 IPTG(异丙基硫代-b-D-半乳糖苷)(200mg/ml):1g IPTG溶于4ml去离子双蒸水，定容至5ml，0.22um过滤除菌，-20保存。操作程序:制备含相应抗菌素(如Ap+、Mana+)的琼脂平板。于平板表面加X-Gal 40ul和IPTG 4ul，用无菌玻璃涂布器将试剂均匀涂布于整个平板表面。37，1h至所有液体消失。将200ul转化的菌液涂布于平板表面，37，20min后，倒置平板

53、继续培养1216h。/实际使用:在20ul连接体系中加入200ul感受态细胞，加入780ul SOC培养基，加入IPTG(+4ul)和X-Gal(+40ul)至所需浓度，将此1ml菌液全部铺板，超静台中吹干约1h，转入倒置培养基中培养812h(常规为过夜)，然后将平板置414h，观察确定蓝白斑。中止培养，将平板置414h，使蓝色充分显现。挑取白色菌落置35ml LB(含相应抗生素如Ap)液体培养基中，37振荡培养812h，提取质粒，限制酶酶切分析进一步鉴定。插入失活原理:该法适用于有2个以上选择标志的载体。试剂及材料1、 Ap2、 tet3、 转化菌操作程序1、 制备LB琼脂培养板分别含有Ap

54、和tet。2、 将200ul转化的菌液均匀涂布于含Ap培养板表面，置3720min后倒置培养1216h。3、 挑取转化菌落，分别接种于Ap培养板和tet培养板上相对应的位置，37培养810h。4、 如重组体的外源DNA克隆在tet基因中，应挑选在Ap培养板生长而在tet培养板不能生长的菌落，并将其接种于含Ap的LB液体培养基5ml中培养812h。5、 小量制备质粒，限制酶酶切分析进一步鉴定。 菌落原位杂交原理:采用放射性标记的探针与含有质粒的细菌菌落杂交的方法。待检菌落从主平板移到硝酸纤维素滤膜上与标记探针杂交，通过放射自显影查出阳性菌落，再从主平板上回收这些阳性菌落。试剂及材料1、 10%S

55、DS2、 变性液:0.5M NaOH，1.5M NaCl3、 中和液:0.5M Tris-Cl(pH7.4)，1.5M NaCl4、 2SSC5、 预杂交液: 50%甲酰胺 6SSC0. 1%SDS1Denhart100ug/ml变性鲑精DNA6、-32P标记的双链DNA探针7、 硝酸纤维素滤膜(NC膜)8、 杂交袋9、 保鲜膜10、 暗盒11、 X光片操作程序1、 菌落转移 用铅笔在NC膜上划好约5mm见方的小格(直径60mm划64小格，直径80mm划100小格)，将膜夹在两层普通滤纸之间高压灭菌备用。 将滤膜平铺于合适的琼脂培养皿上，膜与琼脂之间不要有气泡。 用灭菌牙签挑取待检菌落顺序涂到

56、滤膜小格子中间，同时涂一个仅含载体质粒的菌落作为阳性对照。 将两种平皿37倒置培养1014h，无滤膜的平板置4保存待用。取下滤膜继续处理。 2、 膜处理 使长有菌落的膜面向上，将膜放到浸有10%SDS的普通滤纸上，勿使膜与纸间有气泡，室温3min。 将膜移至用变性液浸透的滤纸上，室温5min。 将膜移至中和液浸透的滤纸上，室温5min。 将膜移至2SSC浸透的滤纸上，室温5min。 将膜置80烤箱干烤12h。 3、 杂交将膜放入杂交袋中，加入预杂交液，封口。42摇床轻摇4h。将标记好的-32P双链DNA探针置100变性5min，迅速冰浴冷却，加入预杂交袋中，混匀，封口。42水浴摇床杂交过夜。将

57、膜移至2SSC，0.5%SDS中室温漂洗5min，弃洗液。加入0.1SSC，0.1%SDS，置4215min，弃洗液。重复第二洗液洗膜2次。将膜移到干的滤纸上，室温晾干或37烘干。用保鲜膜将膜包好，置暗盒中，在暗室中压片。-20显影2472h。显影后，根据X光片黑色显印斑点位置判断保留的培养皿中所对应的菌落。将其挑出，进一步扩增，制备质粒，酶切鉴定。限制酶酶切分析原理:经上述三种方法筛选出的菌落需进一步酶切鉴定，尤其对鉴定外源基因的插入方向更为重要。操作程序:1、 挑选转化菌落，培养。2、 小规模制备质粒。3、 琼脂糖凝胶电泳初筛。挑选出比对照质粒(原始质粒)大的重组质粒，该质粒插入有目的基因

58、。4、 将挑选出的质粒选择合适的酶切位点 进行限制酶酶切分析。 琼脂糖凝胶电泳一、 试剂及材料:1、 琼脂糖2、 电泳缓冲液:50TAE ; 1TAE。表格 31、琼脂糖凝胶电泳缓冲液配方50TAE1000mlTris242gEDTA-Na22H2O37.2冰乙酸57.13、 10 mg/ml溴化乙锭4、 上样缓冲液:0.25溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 4保存。5、 稳压电泳仪和水平凝胶电泳槽；橡皮膏。6、 透射紫外线灯；照相机；微波炉。二、 操作程序:1、 根据所需浓度(1%)称取琼脂糖(1g)，加入100 ml 1TAE。2、 微波炉(3分钟)或沸水浴使琼脂糖溶解，用三角瓶

59、，1/3液体。3、 溶液冷至60，加入溴化乙锭，终浓度0.5ug/ml。(100ml加5ul 10mg/ml的EB)。带手套操作。4、 用橡皮膏将电泳凝胶床的两端封好，成一胶模。5、 将琼脂糖倒入模具，凝胶厚度35 mm，插上梳子。6、 室温3045 min后，凝胶完全凝固，小心取出梳子和橡皮膏，将凝胶放入电泳槽。 可同时制作几块凝胶，固化后用保鲜膜包住，4保存，在数日内可用。7、 加入电泳缓冲液(1TAE),液面高出胶面12 mm。8、 DNA样品中加入1/6的上样缓冲液(20ul:3ul)，混匀。9、 用移液器将DNA样品(15ul)加入样品孔。10、 盖上电泳槽通电，正极为红色，样品向正

60、极泳动。60v(60100v)恒压电泳。11、 根据指示剂迁移的位置，判断是否终止电泳。12、 切断电源，取出凝胶，在透射紫外线灯下观察。13、 用加红光滤色镜的相机，光圈放到最大，曝光15-30s，拍照留底。 从凝胶中回收DNA一、 试剂及材料1、树脂(Wizard PCR Preps DNA Purification Resin)2、 一次性注射器3、 柱Minicolumn4、 80%异丙醇5、 去离子双蒸水二、操作程序切胶:将切下的胶条放入1.5ml离心管中。加入0.51ml树脂(Wizard PCR Preps DNA Purification Resin)。65，5min，至胶熔化