分子杂交基因芯片课件

1、第四章 基因操作中大分子的分离和分析三、分子杂交分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或 RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火 处理，形成异质双链的过程。由于操作方式相似，通 常将检测蛋白质的抗原抗体反应也看作是分子杂交。作用：用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质 是否存在，以及其相对分子质量的大小。 分类：根据检测对象的不同可分为Southern杂交、 Northern杂交、Western杂交。Southern杂交： 即DNA-DNA杂交分析，检测样品中特定的DNA及其含量 。Northern杂交： 即RNA-DNA杂交分析。检测样品中是否含有特定 基因的转录产物（

2、mRNA）及其含量 。Western杂交： 即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素 膜上的特异性蛋白质。 Southern杂交 1975年，英国Southern创建 1.是一种检测DNA分子的一种方法，通过southern印迹转移将琼脂糖凝胶上的DNA分子转移到硝酸纤维素滤膜上，然后进行分子杂交，在滤膜上找到与核酸探针有同源序列的DNA分子。2.主要步骤：（1）待测DNA样品的制备、酶切（2）待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳（3）凝胶中DNA的变性：碱变性（4）Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法（5）探针的制备（6）Sou

3、thern杂交(预杂交、杂交） 预杂交的意义：将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白 封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。 （7）洗膜 经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去。 （8）杂交结果的检测3.Southern 印迹转移（转膜）印迹转移（blotting) ：通过电泳将DNA、RNA或蛋 白质样品进行分离，使不同相对分子质量的的分子 在凝胶上展开，然后将凝胶上的样品通过影印的方 式转移到滤膜上的过程称为印迹。 4.探针及探针的标记 探针：分子杂交中被标记的已知序列的核酸片断称为探针。 （1）探针的种类： 根据探针的标记物不同：放射性探针和非放射性探针； 根据探针的来源及核酸

4、性质不同：分为DNA探针,RNA探针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。 Western杂交中的抗体被看作探针。（2）探针的标记： i）标记物 同位素标记：32P、35S、3H等 非同位素标记：生物素、地高辛、荧光素等ii）标记方法 a 均匀标记 b末端标记带有放射性的已知序列的核酸片断标记已知序列的核酸片断5 标记已知序列的核酸片断3 a 切口平移法(nick translation)：大肠杆菌的DNA聚合酶b 随机引物法(random primer)：六核苷酸残基的引物c PCR扩增标记法:d末端标记法: 5335535355PCR扩增法标记示意图T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T

5、4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5-OH上加磷5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPMg2+ pppATP（g-32P-ATP3 HOp 5 5 p HO 3 a. 放射性标记的优缺点：制作简单、 高比放射性、 放射自显影效果好。优点：缺点：半衰期短（32P只有14.3天）、 不易保存、 对人体有害。 要求在专门实验室操作。（3）标记物及其检测b.非放射性标记： 地高辛标记地高辛可以与dNTP连接成地高辛-dUTP( UTP)等，参入DNA(RNA)的合成过程，形成地高辛标记的DNA(RNA)探针。利用抗地高辛的抗体通过酶联免疫反应来完成。探针检测原理地高辛探针

6、序列待测基因地高辛抗体酶底物产物探针DNA用地高辛标记。地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个显色反应。地高辛抗体与地高辛结合。偶联酶及其底物酶：碱性磷酸酶 （Alkaline Phosphatase, AP）催化一些特殊的反应，反应的过程生成有色的产物。酶的作用：AP的显色反应底物(4) 单链探针的获取f1-orilacZPT7MCSpBluescriptPT32958 bpAprNorthern 印迹杂交(Northern bloting)检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳转膜：不需变性Western杂交印迹转移的是蛋白质杂交过程：抗原抗体反应探

7、针是针对某一蛋白质的特异性的抗体。其他分子杂交菌落杂交：就是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放出来，并使之固定在滤膜上。然后通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的DNA 。菌落杂交主要用来从用质粒或 Cosmid 构建的基因文库中寻找阳性克隆。噬菌斑杂交：以噬菌斑改为菌落。斑点杂交：是分子杂交中最简单的一种，直接将DNA或RNA分子以斑点的形式固定在杂交滤膜上，然后进行分子杂交。 其杂交的信号比菌落杂交和噬菌斑杂交受到蛋白质等细胞成分的干扰小，其结果的可靠性更强。 当核酸分子的斑点面积变得更小，在单位面积滤膜

8、上处理的样品数量就更多，当检测的灵敏度进一步提高后，就发展成 DNA 芯片。 四、基因芯片技术（一）、生物芯片的定义 生物芯片（Biochip）是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。基因芯片：又称 DNA 芯片或DNA阵列，是生物芯片的一种类型，它是将 DNA 分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中mRNA的表达量。也

9、可进行基因突变体的检测和基因序列的测定。6400点的基因芯片 （面积 12X14 mm)基因芯片分析的过程主要包括：样品及其标记处理、芯片制作、分子杂交、信号的检测和数据处理及分析等。（三）、生物芯片的分类 1按载体材料不同 玻璃芯片 硅芯片 陶瓷芯片 目前，玻片材料因易得、荧光背景低、应用方便等优点在国际上被广泛接受。通常是将玻片用化学方法处理并连接上活性基团，如氨基、醛基、巯基等，使生物分子通过共价键或离子键与载体结合。 2按点样方式不同 原位合成芯片（Loci-synthetic DNA Chip微矩阵芯片（Microarray）电定位芯片（Microelectronic） 是利用静电吸

10、附的原理将DNA快速定位在硅基 质、导电玻璃上。3按芯片固定的生物分子类型 基因芯片或 DNA 芯片 蛋白质芯片（Protein Chip） 芯片实验室（Lab-on-Chip） 在微小的硅材料表面，制造出能够对微量样品进行变性、分离、纯化、电泳、PCR扩增、加样及检测等微小结构，使过去一个实验的各个实验步骤微缩于一个芯片上，这种技术被称为芯片实验室。顾秉林校长参观北京博奥生物芯片有限公司 博奥研制的兽药残留蛋白芯片检测平台系统 4按芯片使用功能和用途不同分类 测序芯片 表达谱芯片 基因差异表达分析芯片 基因功能分析研究 将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体、

11、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。（四）、基因芯片技术的特点高通量、微型化： 基因芯片技术的特点的核心是微型化。芯片每平方厘米固体表面上可固定十万个 DNA 片段、数万个基因。一次分析可得到数万个基因的表达信息。微型化的另一方面是样品用量与试剂用量的微量化，用纳克级的 mRNA 、微升级的杂交液就能分析成 千上万个基因的表达信息。平行化： 基因芯片技术可在同一张

12、芯片上同时对实验组和对 照材料进行杂交分析，实现了平行化操作，避免了各种 误差，提高了信息的重现性和准确性，使实验结果具有 可比性。自动化： 芯片制作及分析过程易于自动化。芯片设计制作可 实现自动化，可根据要求将需要分析的基因制作成符合 要求的芯片；杂交、洗片等过程都可实现自动化，工作 效率大幅提高。 （五）、 基因芯片的制作 必须要有代表所要分析基因的DNA样品。1DNA 样品的来源 （1）从细胞或组织中提取mRNA 后反转录成cDNA文库，经测序及生物信息学分析得到代表各个基因的DNA序列，利用PCR扩增技术或DNA固相合成获取所期望的各种基因片段；（2）利用基因组测序数据，经生物信息学分

13、析得到代表各个基因的序列数据，再利用PCR扩增技术或DNA固相合成技术获取人们期望的各种基因片段。2生物芯片的制作 生物芯片微阵列的制作按照制作方法可分为两大类，即原位合成和预合成后点样。 接触点样法 喷墨法 光刻 DNA 合成法 （五）、 基因芯片的杂交及结果分析 1探针的标记 标记的方法通常是在反转录的底物中加入带有标记基团的寡核苷酸单体，通过反转录将标记分子掺入 cDNA 分子中。 双色荧光标记技术（Cy3,Cy5)是常用的标记技术. 2杂交 在一定的条件下，分子间氢键的断裂与恢复是 DNA/DNA 、 DNA/RNA 分子间选择性结合的根本动力，这一过程称之为杂交。3芯片结果读取与扫描

14、仪 生物芯片扫描仪：激光系统扫描仪（共聚焦/非共聚焦） 和CCD系统扫描仪 分次扫描，同时扫描， 4生物芯片的软件系统与数据处理 伪色图： Cy3,Cy5 若以红色表示处理样品，以绿色表示对照样品，重叠变成黄色，如某一点（代表一个基因）呈红色就表明该基因的表达上升，若某一点呈绿色就表明该基因的表达下降，表达量 。相等为黄色（六）、 基因芯片的应用 1基因表达分析；2基因型及多态性分析； 3杂交测序； 4核酸和蛋白质相互作用的研究；5疾病的诊断与治疗；6药物开发； 7在营养与食品卫生领域的应用； 8在环境科学领域中的应用。 五、RNAi技术1. 定义RNA干扰( RNA interference

15、, RNAi) ：是指在生物体 细胞内，由于外源或内源性双链RNA的存在，诱导体内 同源mRNA高效特异性降解的现象。 不破坏或改变原来的目的基因，但可以降低目的基因的 表达。因此是一种序列特异性的转录后基因沉默( post transcriptional gene silencing, PTGS) 机制。2.RNAi的发现“ 共抑制( co- suppression)” 发生在转录后的RNA 水平1990年, Napoli CD 1995年，Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达。设计： 反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达； 正义RNA

16、以期观察到基因表达的增强。结果: 二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。 RNAi的提出uninjected, no probeuninjected, mex-3 probeantisense mex-3 RNA, mex-3 probe double-stranded mex-3 RNA injected, mex-3 probe1998年2月，Fire A和Mello C体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫，基因抑制效应变得十分微弱经过纯化的双链RNA能够高效特异性阻断相应基因的表达证实，Guo S

17、博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）。Zamore, P. D. Science 296, 1265-1269 (2002)dsRNA55RNA-induced silencing complex (active, 100kDa complex)small interfering RNAsMechanism of RNAi post-transcriptional gene silencing(inactive,

18、250-500kDa complex)(endonucleolytic cleavage in the region of homology)(a critical step in the activation of RISC)Zamore, P. D. Science 296, 1265-1269 (2002)RNAi 诱导特异性基因沉默的机制研究（1） dsRNA的降解，siRNA的形成 dsRNA 进入细胞内, 与一种核酸内切酶Dicer 结合, 并被酶切成19 23nt 的小干扰RNA( small interference RNA, siRNA) , （2 ）沉默复合物的形成 siRNA