《DNA片段的PCR扩增》

1、DNA片段的PCR扩增杭州第十四中学 卓芳芳“应用PCR技术扩增SRY基因检测性别” 01翻转课堂学习任务流程 彩虹学堂 01翻转课堂02模拟操作学习任务流程 生命科学探究性实验室01翻转课堂02模拟操作03确立课题学习任务流程 课题：应用PCR技术扩增SRY基因检测性别01翻转课堂02模拟操作03确立课题04设计方案学习任务流程 实验方案人类Y染色体SRY基因的鉴定一、实验原理 SRY基因是Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段。通过PCR对SRY基因进行扩增和检测，可快速鉴定性别。PCR作用可分为3步反应。1. 变性：模板DNA经加热至94使DNA双链解旋成为单链；2. 退火：温度降至4

2、060左右，引物1、2分别与模板DNA的两条单链的互补序列配对结合；3. 延伸：在DNA聚合酶的作用下于72左右，以dNTP为反应原料合成互补链，并重复循环三个过程，13小时时间就能将目的基因扩增放大几百万倍。 琼脂糖凝胶电泳是利用不同分子量的DNA在凝胶中电泳速度不同而分离DNA片段的方法。DNA在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中会向正极泳动。其迁移速度常与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小标准物的移动距离与扩增片段的移动距离比较，便可观测相应大小的目的基因是否存在。此方法观测简便，灵敏度较高，是最常用的检测方法。二、实验目的 1、掌握PCR反应的基本原理和实验操作2、掌握利用琼脂

3、糖凝胶电泳法对条带进行鉴定的方法和实验操作 三、实验材料、试剂及仪器 1、实验材料 男性的口腔上皮细胞及头发毛囊细胞、女性的口腔上皮细胞及头发毛囊细胞2、实验试剂 0.2mol/LNaOH溶液、0.04mol/LHCl溶液、PCR混合液、引物1、引物2、无菌水、琼脂糖、1TAE缓冲液、核酸染料、DNA标样等3、仪器 各种规格微量移液器和枪头、PCR管、配胶板、PCR仪、电泳仪、离心机、凝胶成像系统、电子称、药勺、称量纸、其他各种玻璃器材四、实验准备1、引物设计：可直接在NCBI网站搜索该基因相关文献获得引物序列；可根据NCBI上该基因的碱基序列，借助引物设计软件如Oligo等进行设计，再由引物

4、合成公司合成相关引物。扩增人SRY基因引物：SRY1：5-TGGGACTGGTGACAATTGTC-3 SRY2：5-GAGTACAGGTGTGCAGCTCT-32、模板DNA制备（1）男生口腔粘膜上皮细胞或毛发数根，女生口腔粘膜上皮细胞或毛发数根作为对照。（2）剪下带毛囊的发根部分，放入一个200lPCR管，加20l的0.2mol/LNaOH溶液，75温育30min（在有热盖的PCR仪中反应，以避免水分蒸发）。（3）加入100l的0.04mol/LHCl中和。（4）12000r/min离心5min去除未溶解的沉淀物，上清转入1个新管，DNA就在水溶液中。3、DNA标样的选择 根据SRY基因大

5、小（300bp左右）选择相应规格的DNA标样，各种标样所含片段如下：试剂名称试剂量PCR混合液55lSRY引物12.2lSRY引物22.2l灭菌蒸馏水24.2l4、配胶（1）组装好配胶板，插上合适的梳子。（2）在200ml带盖螺旋瓶中加入0.5g的琼脂糖和50ml1TAE缓冲液，微波中加热使溶解至透明。冷却至60加入5l核酸染料，倾倒至配胶板上，凝固后将梳子取出。五、实验步骤 1、PCR反应体系配置（1）取4个PCR管，编号1、2、3、4；（2）为避免微量取样造成较大误差，先将下列成分预混；再离心混匀，分装到4只 PCR管中（19l/管）； （3）1号和2号加入6l男生模板DNA，3号和4号管

6、加入6l女生模板DNA，再离心混匀；最终每个样品反应体系为25l。2、PCR仪反应条件为： 循环20次3、电泳检测（1）在电泳槽中倒入适量1TAE缓冲液，将凝胶放入电泳槽，加样孔靠近负极。（2）用10ul微量移液器加2-5l DNA标样到凝胶板的一个加样孔，再各取10l PCR产物于4个加样孔，盖上电泳槽，然后插上电源，设置电压120V，电泳10-20min。（3）电泳结束后，将凝胶放置于凝胶成像系统照射箱中，加样孔朝里，打开凝胶成像系统的紫外灯，拍照并保存照片，对结果进行分析讨论。预变性943min变性9430s退火5030s延伸7230s循环后延伸725min保存401翻转课堂02模拟操作

7、03确立课题04设计方案05制定量规学习任务流程 实验操作行为量规评价项目评价环节评价指标组别/等级ABCD知识储备思维创新课前预习在彩虹平台中有高质量提问、讨论，能引发师生的积极思考；总结的操作要点详细且准确在彩虹平台中有较好的提问、讨论；总结的操作要点较详细、准确在彩虹平台中有提问、讨论或有总结操作要点仅有提问、讨论或操作要点总结中的一项1234方案设计对情景问题能提出多种可行的方法并陈述理由，方案设计完整合理对情景问题能提出一种可行的方法，方案设计较完整合理对情景问题能够提出方法但无设计方案无法提出可行的方法1234结果讨论结果分析准确，能提出引发思考探讨的问题结果分析较准确，有一定的讨

8、论和思考结果有分析，但讨论思考少结果分析不准确、无讨论思考1234实验操作实践能力实验准备引物、DNA marker选择准确，凝胶无气泡，加样孔整齐光滑，有添加染料其中一个环节有缺陷其中两个环节有缺陷实验未能完成或每个环节都有缺陷1234PCR加样操作带上手套，能够熟练使用移液器依次向4个PCR管准确加入4种试剂，枪头及时更换，试剂用完及时盖盖子，混匀离心后再分装，加入模板后再次离心混匀其中一个环节有缺陷或遗漏其中两个环节有缺陷或遗漏未能完成或只能完成其中一项操作1234PCR仪操作能成功完成PCR仪开机，准确设置并开始PCR程序，PCR管放置位置准确基本能独立完成PCR仪的开机、设置等操作，

9、需老师提醒个别操作要点需教师频繁指导才能完成设置未能完成，需教师全程指导仪器操作和使用1234电泳上样操作熟练使用移液器对4个样品和1个marker进行上样，能熟记样品位置，样品未从加样孔漏出，未破坏加样孔其中一个环节有缺陷其中两个环节有缺陷未能完成或每个环节都有缺陷1234实验13 DNA片段的PCR扩增评价量规量表电泳仪操作电泳缓冲液高出凝胶3-4mm，凝胶放置时加样孔近负极；正负极、电压设置完全正确其中一个环节有缺陷其中两个环节有缺陷未能完成或每个环节都有缺陷1234凝胶成像系统操作能熟练打开凝胶成像系统及分析软件，凝胶加样孔靠里放置于照射箱，紫外灯照射下，marker条带清晰，且能看到

10、样品条带有无；操作过程中没有打开照射箱箱门从而造成紫外线对学生可能的损害其中一个操作环节有缺陷其中2个环节有缺陷未能完成或只知道其中一项操作1234情感态度核心素养分工合作每位组员都有明确的任务分工，每个环节都能良好地完成每位组员有任务分工，在1-2个环节分工合作不够到位组员分工不明确，经常出现组内只有个别同学在执行任务未进行分工，合作少，未完成任务1234互动情况每位组员积极参与讨论并努力解决问题，此外还能积极参与它组的问题讨论每位组员积极参与讨论并努力解决问题，与它组讨论少组内有一定讨论，但是不够深入，不参与他组的讨论几乎没有讨论1234量规使用清楚量规的使用，富有责任感，能严格按照量规指

11、标规范实验操作，进行公正、公平的评价清楚量规的使用，能进行公正、公平的评价基本清楚量规的使用，偶有量规使用方面的问题不清楚量规的使用1234扩展延伸关心社会实事，情感上能产生强烈共鸣，有改善不良社会现实的美好意愿关心社会事实，有触动关心社会事实不够关心1234组1组2组3组4折算方式（A：5分，B：3分，C：1分，D：0分）最终统计得分表01翻转课堂02模拟操作03确立课题04设计方案05制定量规06实验实施 量规评价学习任务流程 实验实施 量规评价 PCR反应操作1 PCR反应体系配制取4个PCR管，编号1、2、3、4；由于微量取样容易造成较大误差，首先将下列成分预混 (因为有挂壁的影响，预

12、混量应配置到至少1.1倍)；离心混匀，分装到4只 PCR管中（19l/管）； 1号和2号管分别加入6l男生口腔上皮细胞和头发毛囊细胞DNA，3号和4号管加入6l女生口腔上皮细胞和头发毛囊细胞DNA，再离心混匀；最终每个样品反应体系为25l。 PCR反应操作2 PCR仪操作打开电源，放入扩增样品，尽可能往中间对称放置；设定程序，保存并命名，PCR反应条件设置为：按下开始按钮，反应30min左右；仪器显示结束，按下结束按钮，打开仪器盖，取样品备用。 电泳检测操作3 电泳在电泳槽中倒入适量1TAE缓冲液，需要高出凝胶面3-4mm，本实验大概要1.5L左右；将配好的凝胶放入电泳槽，加样孔靠近负极；用1

13、0ul的微量移液器加2-5l DNA marker加到凝胶版的一个加样孔，在各取10l 4管PCR产物与4个加样孔；盖上电泳槽盖，然后插上电源，设置电压120V，电泳10-20min；按下结束按钮，打开电泳槽盖，取出凝胶观察分析。 电泳检测操作4 凝胶成像系统操作插上电源，打开电脑和凝胶成像系统电源开关；将电泳得到的凝胶放置于凝胶成像系统照射箱中，便于后续分析，注意加样孔侧朝里；点击桌面相关软件，打开电源，打开紫外灯，调整对比度和亮度；拍摄并保存照片，对结果进行分析讨论。结果分析第一组第二组第三组第四组量规评价评价项目评价环节评价指标组别/等级ABCD知识储备思维创新课前预习在彩虹平台中有高质

14、量提问、讨论，能引发师生的积极思考；总结的操作要点详细且准确在彩虹平台中有较好的提问、讨论；总结的操作要点较详细、准确在彩虹平台中有提问、讨论或有总结操作要点仅有提问、讨论或操作要点总结中的一项1234方案设计对情景问题能提出多种可行的方法并陈述理由，方案设计完整合理对情景问题能提出一种可行的方法，方案设计较完整合理对情景问题能够提出方法但无设计方案无法提出可行的方法1234结果讨论结果分析准确，能提出引发思考探讨的问题结果分析较准确，有一定的讨论和思考结果有分析，但讨论思考少结果分析不准确、无讨论思考1234实验操作实践能力实验准备引物、DNA marker选择准确，凝胶无气泡，加样孔整齐光

15、滑，有添加染料其中一个环节有缺陷其中两个环节有缺陷实验未能完成或每个环节都有缺陷1234PCR加样操作带上手套，能够熟练使用移液器依次向4个PCR管准确加入4种试剂，枪头及时更换，试剂用完及时盖盖子，混匀离心后再分装，加入模板后再次离心混匀其中一个环节有缺陷或遗漏其中两个环节有缺陷或遗漏未能完成或只能完成其中一项操作1234PCR仪操作能成功完成PCR仪开机，准确设置并开始PCR程序，PCR管放置位置准确基本能独立完成PCR仪的开机、设置等操作，需老师提醒个别操作要点需教师频繁指导才能完成设置未能完成，需教师全程指导仪器操作和使用1234电泳上样操作熟练使用移液器对4个样品和1个marker进

16、行上样，能熟记样品位置，样品未从加样孔漏出，未破坏加样孔其中一个环节有缺陷其中两个环节有缺陷未能完成或每个环节都有缺陷1234实验13 DNA片段的PCR扩增评价量规量表电泳仪操作电泳缓冲液高出凝胶3-4mm，凝胶放置时加样孔近负极；正负极、电压设置完全正确其中一个环节有缺陷其中两个环节有缺陷未能完成或每个环节都有缺陷1234凝胶成像系统操作能熟练打开凝胶成像系统及分析软件，凝胶加样孔靠里放置于照射箱，紫外灯照射下，marker条带清晰，且能看到样品条带有无；操作过程中没有打开照射箱箱门从而造成紫外线对学生可能的损害其中一个操作环节有缺陷其中2个环节有缺陷未能完成或只知道其中一项操作1234情感态度核心素养分工合作每位组员都有明确的任务分工，每个环节都能良好地完成每位组员有任务分工，在1-2个环节分工合作不够到位组员分工不明确，经常出现组内只有个别同学在执行任务未进行分工，合作少，未完成任务1234互动情况每位组员积极参与讨论并努力解决问题，此外还能积极参与它组的问题讨论每位组员积极参