大学生自由探索项目-被动吸烟(共11页)

1、中南(zhn nn)大学(dxu)本科生自由探索计划项目申 请 书项目名称：被动(bidng)吸烟对孕鼠子代脑组织基因表达的影响申报类别： 医学类 申 请 人： 席周欢 联系电话：学号： 2204120612 所属学院： 信息科学与工程学院 E- MAIL： 751033612 指导教师： 卢光琇 电话：中南大学2014年制填表说明(shumng)一、本申请书所列各项内容均须实事求是(sh sh qi sh)，认真填写，表达明确严谨，简明扼要。二、本申请书为大十六开本（A4），左侧装订成册。可网上下载、自行(zxng)复印或加页，但格式、内容

2、、大小均须与原件一致。三、“申报类别”包括：数学类、物理类、化学类、医学（含生物）类、信息类。四、“项目性质”包括“新申报”和“滚动项目”两类，在所选性质后的“”标注“”；申报“滚动项目”需在“申请人曾经参与科研的情况”一栏中说明原研究项目名称。五、“项目组主要成员”栏目中在首行填写项目负责人的信息，“出生年月”按“1994-01”的格式填写。六、“指导教师”栏目中填写指导教师（团队）的基本信息，“职称”栏目填写“正高、副高、中级、其他”。七、“经费预算”主要包括：材料费、测试化验加工费、差旅费、会议费、国际合作与交流费、出版/文献/信息传播/知识产权事务费、等。一、基本情况项目名称被动吸烟对

3、孕鼠子代脑组织基因表达的影响申报类别医学类项目性质新申报 滚动项目经费预算30000 元项目组成员姓 名性别出生年月学号所学专业联系电话项目分工席周欢女1994-052204120612临床医学八年目负责人刘佳女1992-072204120608临床医学八年目执行刘锐女1993-102204120611临床医学八年目执行周伶俐女1995-022204120614临床医学八年目执行舒常发男1995-012204120623临床医学八年目执行指导教师姓名职称学位联系电话

4、电子邮箱卢光琇正高学ugxdirector;申请人曾经参与科研的情况撰写综述肿瘤患者的生育风险评估并于国际生殖与健康计划杂志上发表；撰写EORTC QLQ-CX24介绍及发展并于当代医学杂志发表；撰写垂体瘤术后43例成人生长激素缺乏症的研究并于中国现代手术学杂志发表。导教师承担科研课题情况上世纪80年代始建立人类辅助生殖技术平台，并取得了丰硕的成果。1981年建立国内第一个人类冷冻精子库；1983年诞生了国内第一例冷冻精液人工授精婴儿；1988年诞生了国内第一例供胚移植试管婴儿；1990年建立国内第一个植入前胚胎遗传学诊断动物型；1991年诞生了国际上第一例经畸形精子

5、分离术治疗后诞生的正常婴儿；1994年建立国内第一个精子显微授精动物模型；1996年诞生了国内第一批核移植小鼠；1999年成就了国际上第一个人类核移植囊胚；2000年诞生了国内第一例经超快速冷冻后的冻胚移植试管婴儿；2005年诞生了国内首例经孕前诊断排除“杜氏肌营养不良症”的正常婴儿；诞生了世界首批全基因组测序技术的PGD/PGS试管婴儿。获得了国家自然科学基金重点项目、国家973项目、国家科技攻关项目、中华医学会基金会（CMB）等多项课题资助；先后发表论文456篇，其中在SCI杂志上发表论文118篇，出版专著6部，获得国家实用新型专利8项。 项目简介（100字左右）孕妇被动吸烟对胎儿的健康有

6、诸多危害，有研究表明，孕妇被动吸烟将引起胎儿的脑组织发育迟缓或脑组织发育不全，出生后发现其学习记忆功能、运动功能等受到严重影响。我们将探究被动吸烟孕鼠的子代脑组织基因表达与正常鼠子代的差异，为研究被动吸烟引起的人类胎儿脑组织基因表达差异打下基础。二、课题(kt)论证（5000字左右(zuyu)）1 研究目的和研究意义研究目的探究被动吸烟孕鼠的子代与正常孕鼠子代脑组织基因表达的差异。研究意义（1）引起人们重视被动吸烟对非吸烟生殖妇女后代的危害，在优生优育工作中加强避免母孕期父亲吸烟导致孕母处于烟雾环境的宣传。（2）探究被动吸烟孕鼠的子代脑组织基因表达与正常鼠的差异，为研究被动吸烟引起的人类胎儿脑

7、组织基因表达差异打下基础。（3）为探究从基因水平治疗被动吸烟引起的脑损伤提供背景支持。2 国内外研究现状我国是一个烟草大国，大的消费群体使中国成为世界第一烟民大国。零点前进策略发布的调查显示：中国香烟消费者日平均吸烟数为15.81支，高于世界平均水平（13.63支）。全世界现有11亿烟民，其中中国就有4.6亿。近年来，被动吸烟对非吸烟妇女的生殖健康的危害引起了越来越多国内外学者的重视。由于烟民数量庞大，我国妇女虽然主动吸烟者较少，但被动吸烟者甚多1。并且，我国妊娠妇女被动吸烟的情况较普遍，有超过一半的孕妇在怀孕期间曾接触到香烟烟雾，女性被动吸烟的危害已远远超过主动吸烟2。1.孕期被动吸烟对妊娠

8、及胎儿的影响目前，国内外大量研究表明，妊娠期被动吸烟会导致多种不良妊娠结局，包括自然流产、非人为因素流产、早产( 37周) 、胎死宫内、 异位妊娠、葡萄胎、出生缺陷、低出生体重、胎儿发育迟滞等。香烟中的尼古丁通过胎盘直接进入胎儿体内,导致胎儿流产、宫内发育迟缓、低体重、早产、死亡3。 1.1增加早产、死产风险有研究4对109例被动吸烟及无被动吸烟的孕妇进行追踪调查分析，结果被动吸烟组的孕妇早产发生率显著高于无被动吸烟组，胎膜早破新生儿窒息的发生率均大于无被动吸烟组。此外，丹麦一项涉及25102例孕妇的大样本队列研究5表明，孕期被动吸烟可增加死产发生的危险性。 1.2抑制胚胎发育研究显示，新生儿

9、身高体重被动吸烟组均显著低于无被动吸烟组4。动物实验表明，被动吸烟抑制孕鼠体内NO的生成，抑制了胚胎发育，也抑制了孕鼠胎仔的生长发育，增大孕鼠胎仔的吸收胎及死胎率，对整个大鼠胚胎发育带来不利影响，从而为间接评价被动吸烟对孕妇的危害提供参考依据6。 1.3影响新生儿行为、学习能力及智力 另外，瑞典大学的一项研究表明，妊娠期间的被动吸烟将对新生儿动作协调性产生有害的影响，增加其多动症及注意力不集中现象7，8。丹麦Laurberg等观察了住院待产期间孕妇及其婴儿，被动吸烟使婴儿因碘缺乏而引起大脑损伤风险增加K。葛晓东9认为，香烟烟雾暴露损害了幼年小鼠的空间学习能力，该现象的可能机理是香烟烟雾暴露对神

10、经发生的抑制作用，据此推测，被动吸烟可能对新生儿学习能力及智力产生影响。2.孕期被动吸烟影响妊娠及胎儿的原因 2.1有毒物质通过胎盘导致畸胎 烟草中含有4000种以上的化合物，如颗粒物（焦油）、尼古丁酸、一氧化碳、氰氢酸、酚类苯蒽等，其中尼古丁酸、一氧化碳和多环芳香烃对孕妇和胎儿最为有害。而香烟烟雾中所含得大量有毒物质被母体吸入后，可透过胎盘屏障直接毒害胚胎或胎儿，或通过损伤子宫胎盘结构而影响胚胎发育10。如尼古丁除可刺激神经末梢释放儿茶酚胺促进子宫肌肉及血管收缩，导致子宫胎盘缺血缺氧，尼古丁还可以作用于凝血因子，使血液呈高凝状态，导致胎盘血液灌流量减少，胎儿营养供应不足，引发胎儿畸形11，对

11、孕17周前流产的孕妇血液和胎儿脐血及羊水中可替宁( 尼古丁降解物)的放射性免疫检测发现，无论是主动吸烟还是被动吸烟, 胎儿的脐血、羊水中都有可替宁成分, 甚至由于累积而超过母亲血液中的可替宁的浓度12；香烟烟雾中的一氧化碳可与血红蛋白结合形成碳氧血红蛋白，导致胎儿发生低氧血症，易发畸形13；焦油长期积存，可诱发异常细胞形成，导致胎儿畸形14。有研究显示：多因素Logistic回归分析中，校正混杂因素影响后，妊娠早期被动吸烟发生胎儿畸形的危险度是2.518；单因素分析研究还发现，妊娠早期被动吸烟胎儿心脏系统泌尿系统和唇腭裂畸形明显高于非暴露组，而胎儿消化系统畸形发生率明显低于非暴露组15。 2.

12、2调控基因表达被动吸烟可能通过调控细胞凋亡而引起胎儿宫内生长受限。Bax诱导凋亡的发生，bcl-2抑制凋亡的发生，研究发现，孕期被动吸烟组的胎鼠脑组织中，Bax mRNA的相对表达量明显比未被动吸烟组的高，而二者的bcl-2 mRNA表达量无明显差异，推测被动吸烟致宫内生长受限胎鼠发生率的增加，可能与Bax/bcl-2的比值增加有关16。Misra等17在荟萃分析中发现，暴露于环境香烟烟雾的妇女所生的新生儿发生SGA（小于胎龄儿，small for gestational age）的危险度是非暴露组的24倍 。 2.3调节锌、镉代谢 王伟民等18报道，吸烟对孕妇锌、镉代谢有影响。接触香烟烟雾的

13、孕妇血清及其新生儿脐血清具有低锌高镉的代谢特点，胎盘高镉将阻碍对锌的转运，镉是一种有害环境元素，支流烟雾中的镉可通过孕妇呼吸道进入机体，其生物半衰期为1030年，故有明显的蓄积损害作用。 Wolch发现19，镉可改变胎盘内各种代谢酸的功能，从而使胚胎死亡、畸形、宫内生长迟缓( intrauterine growth retardation，IUGR) 和胚胎功能不全的发生率上升。胎盘是镉的靶器官之一，而锌参与体内许多酶的组成，还有研究表明，锌影响染色质结构和基因的表达。口服锌能改善IUGR胎儿的出生体质量，锌对宫内胎儿的生长发育具有极其重要的作用，而被动吸烟胎儿IUGR发生率较高。镉是锌的拮抗

14、物，吸烟除导致血清镉升高，还可通过高镉与锌竞争置换含锌酶中的锌，而不利妊娠中的锌代谢20。3.孕期被动吸烟对胎儿脑组织影响的研究进展孕妇被动吸烟对胎儿的危害越来越受到重视。其中，对胎儿脑组织的影响是最主要也是最严重的影响之一。由于以人为研究对象进行试验，难度大，风险性高，耗时长，所以目前关于被动吸烟对胎儿脑组织造成影响的机制的研究比较少，多数都是以鼠为研究对象进行致病原因的实验探究。胡灵玉等研究发现孕期被动吸烟子代的脑重较正常对照组显著降低6。 国内外的研究显示，孕鼠被动吸烟可致胎鼠宫内生长受限并影响其脑的发育21。张金等研究发现孕期被动吸烟组的胎鼠中枢控制呈进行性下降，可以说，被动吸烟对小鼠

15、中枢神经功能的损害非常严重22。马太芳23等研究表明，被动吸烟影响脑组织内源性生长抑素和精氨酸加压素的代谢，这可能与吸烟造成的机体缺氧状态以及烟气中的某些有毒成分对神经组织的毒害作用有关。 目前已知的与子代脑组织影响的相关表现及致病原因有如下三个方面： 3.1抑制子代的生长发育 烟雾中的有害物质可影响胎盘的血液供应，其中CO可降低血红蛋白的携氧能力，从而对被动吸烟胎鼠造成慢性缺氧损害。Ferrer等报道，缺血缺氧可引起局部脑组织细胞凋亡相关基因Bax表达增加，从而抑制子代的生长发育24。 3.2影响子代学习记忆能力姜丽娜等研究表明，被动吸烟对大鼠子代学习记忆有明显的影响，可降低其学习记忆的能力

16、25。产生影响的原因有许多种说法，其中受到广泛认同的说法有如下两种。 3.2.1被动吸烟导致子代海马体中一氧化氮合酶表达下降 海马体是大脑中对某些类型的学习和记忆的关键区域26,它可以直接干预和信息的储存27。一氧化氮(nitrous oxide，NO)在体内由一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase，NOS)催化左旋精氨酸和02反应生成，NO是迄今公认的体内被发现的第一个气体性信息传递分子，作为细胞间信使分子和类神经递质，参与神经传导与发育及突触可塑性等过程，在学习、记忆与行为形成中起重要作用。长时间暴露于烟雾环境中导致海马NOS表达下降，则该区NO的生成势必减少，从而使

17、该区微循环供血不足，进而间接影响细胞生长发育及其功能。海马体中NOS表达下降可能是被动吸烟导致子代学习记忆功能降低的机制之一28。 3.2.2被动吸烟引起胎鼠小脑皮质中神经生长因子水平降低 小脑皮质也是胚胎期神经生长因子水平较高的部位之一，被动吸烟也可能降低小脑皮质神经生长因子的含量。牛磺酸在哺乳类动物的脑内含量丰富，神经元和神经胶质细胞可能通过选择性储存和释放牛磺酸，以维持脑组织的正常活动，牛磺酸的合成和摄人受阻可能导致其功能异常29。被动吸烟是引起胎鼠小脑皮质中神经生长因子水平降低的可能因素，这将导致胎鼠发育迟缓以及学习和记忆功能下降29。 3.3导致子代致神经管缺陷 哺乳动物神经管在发育

18、的特定期间(即生殖致畸期)易受到各种致畸物的影响,而尼古丁又是一种很容易通过胎盘的有毒性、易挥发的神经致畸物,所以无论主动吸烟,或被动吸烟,尼古丁都可迅速进入羊水中,直接影响神经管的正常发育3。目前造成这种影响的原因有：被动吸烟可诱导神经上皮及其周围间充质细胞变性，死亡，细胞数量减少，从而导致了神经管的形成和分化异常，使神经管延迟闭合或不闭合，这是被动吸烟致神经管缺陷的一条重要的途径。被动吸烟导致神经管缺陷的另一个重要途径是使神经上皮的纤维粘连蛋白减少，干扰这些神经上皮细胞及其周围间充质细胞的增殖和迁移，使神经管不能正常形成。 被动吸烟致神经管缺陷的发生与细胞膜表面的甘露糖糖基和岩藻糖糖基改变

19、密切相关。被动吸烟可使神经上皮及其基膜和神经管周围的间充质细胞的相应糖基明显升高，细胞间的粘着增强，从而干扰神经上皮的正常细胞增殖、黏着和迁移过程，这也是引起神经管缺陷的主要原因之一30。4.结语 目前，很多实验都表明孕妇被动吸烟会增加不良妊娠结局的风险，因此，从基因表达水平深入探究被动吸烟的影响非常有必要。但从国内外研究发展现状来看，关于孕鼠被动吸烟对其子代脑组织基因表达的影响的研究还很局限，有广阔的研究价值和发展前景。因此本研究着眼于胎鼠脑组织基因表达情况，探究孕鼠被动吸烟对胎鼠的影响，为研究被动吸烟引起人类胎儿脑组织基因表达差异打下基础，并引起人们对尽量避免妊娠期被动吸烟的高度重视。【参

20、考文献】1 郭宝成, 妇女被动吸烟与健康关系的研究. 河南预防医学杂志, 1999(04): 第205-207页.2 刘迎平, 不同孕期大鼠被动吸烟对胎鼠的发育及脑组织c-fos基因表达的影响. 中国分子心脏病学杂志, 2013(05): 第689-691页.3 文江, 大鼠宫内暴露尼古丁影响神经管发育的形态学观察, 2005, 中国医科大学. 第41页.4 尚肖肖，王志萍，赵仲堂 妊娠期被动吸烟与出生缺陷关系的Meta分析J 环境与健康杂志，2010，27( 12) :1065-10695 WisborgK，Kesmodel U，HenriksenTB，et al Exposuretotob

21、acco smokeinuteroandtheriskof stillbirthanddeathinthefirst year of lifeJ AmJEpidemiol，2001，154( 4) :322-3276 胡灵玉与何德文, 被动吸烟对孕鼠及胚胎发育的影响. 环境与健康杂志, 2003(06): 第329-330页.7 EllingsonJM，Rickert ME，LichtensteinP，et al Disentanglingtherelationshipsbetweenmaternal smokingduringpregnancyandcooccurringriskfactor

22、sJ Psychol Med，2011，25( 1) :1-118 Tiesler, C.M., et al., Passive smoking and behavioural problems in children: results from the LISAplus prospective birth cohort study. Environ Res, 2011. 111(8): p. 1173-9.9 葛晓东, 香烟烟雾暴露对小鼠学习能力和神经发生的影响研究, 2008, 广西医科大学. 第90页.10 RogersJM TabaccoandpregnancyJ ReprodToxi

23、col，2009，28( 2) 15260.11 LambersDS，ClarkKE Thematernal andfetal physiologiceffectsof nicotineJ SeminPerinatol，1996，20( 2) 11526.12 Eric Jauniaux , Beatrice Gulbis, Ganesh Acharya , et al. Maternal Tobacco Exposure and Cotinine Levels in Fetal Fluids in the First Half of Pregnancy J . Obstet Gynecol,

24、 1999, 93: 25- 2913 Wenderlein JM Smoking and pregnancyJ ZArztl Fortbild，1995，89( 5) 46771.14 FranssenME，Vander Wilt GJ，et al Aretrospectivestudyof the teratogenicityof dermatological coal tarproductsJ ActaDermVenereol，1999，79( 5) 3901 15 涂新枝等, 妊娠早期被动吸烟与胎儿畸形关系的队列研究. 中国优生与遗传杂志, 2013(04): 第127-129页.16

25、 孟菂等, 被动吸烟致宫内生长受限胎鼠脑组织细胞凋亡相关基因的表达. 中华妇产科杂志, 2001(11): 第42-43页.17 Misra DP，Nguyen RH Environmental tobacco smoke and low birthweight: ahazardintheworkplace? J EnvironHealthPerspect，1999，107( Suppl 6) :897-90418 王伟民，诸余强，梁世音，等妊娠期被动吸烟对锌镉代谢的影响J中华妇产科杂志，1999，34( 2) :118-11919 WolchS Dynamics of morphologic

26、al andcytochemical changes in theplacenta following cadmiumchloride intoxicationJ Ginkol Pol，1992，63( 6) :265-27420 井淇,路中, 孕期吸烟与被动吸烟影响妊娠结局的研究进展. 医学综述, 2012(15): 第2455-2458页.21 Gospe SM，Zhou SS，Pinkerton KE. Effects of environmental tobacco smoke exposure in utero and/or postnatally on brain developm

27、ent.Pediatr Res.1996,39:494-498.22 张金, 魏利华与李阳, 吸烟对中枢神经系统危害的实验研究. 中西医结合心脑血管病杂志, 2008(12): 第1425-1426页.23 马太芳等, 孕鼠被动吸烟对胎鼠脑区生长抑素和精氨酸加压素含量的影响. 山西医科大学学报, 2008(08): 第689-691页.24 Ferrer, I., et al., Bcl-2, Bax and Bcl-x expression following hypoxia-ischemia in the infant rat brain. Acta Neuropathol, 1997.

28、94(6): p. 583-9.25 Jie Y，Jiang LNet a1Impacts of passive smoking ON learning and memory ability of mouse offsprings and intervention byantioxidantsJBiomedical and Environmental Sciences，2008，21(2)114414926 Cui G C, Ye G L (2002). Recent advances in the study of long-term potentiation (Part I). Nervo

29、us Diseases and Mental Hygiene 2, 179-182.27 Brenda M, Larry R S, Eric P K (1998). Cognitive neuroscience and the study of memory. Neuron 20, 445-468.28 余海洋等, 被动吸烟对胎鼠海马神经元一氧化氮合酶表达的影响. 四川解剖学杂志, 2010(04): 第6-9页.29 李芳兰, 被动吸烟影响仔鼠小脑皮质神经生长因子含量及牛磺酸的干预作用(英文). 中国临床康复, 2006(38): 第184-185页.30 王东, 被动吸烟致神经管缺陷的形态

30、学观察及其发生机制的实验研究, 2003, 青岛大学. 第 71页.3研究内容、研究方法以及重点和难点研究内容将45周的健康雌性Wistar大鼠每日暴露于不同剂量和时长的香烟烟雾中，一个月后与健康810周龄雄性Wistar大鼠交配，孕期继续按原剂量和时长暴露于香烟烟雾直至产下乳鼠。随机处死部分新生乳鼠，取其脑组织，做基因表达谱分析，与正常鼠对比，找出表达存在差异的基因；其余子代置于正常空气环境中饲养，对其进行行为学研究。研究方法实验动物采用SPF级雌性Wistar大鼠40只，鼠龄45周，适应性饲养一周后，随机平均分成A、B、C、D4组，其中A、B、C组为实验组，D组为对照组。参照COPD大鼠烟

31、雾吸入模型处理实验组大鼠，将大鼠置于自制烟箱，烟箱后壁装有小型风扇, 以维持箱内氧和二氧化碳浓度处于相对正常水平（置入大鼠前点燃一支香烟，燃烧至一半的时候采集箱内气体，立即送检，气相色谱仪测定其中氧气、一氧化碳、二氧化碳含量）。每日点烟量：实验组A每日5支，实验组B每日15支，实验组C每日25支。每次点燃一支烟，一支燃毕再点下一支。每支烟燃烧时间大约为10分钟，实验组AB每日一次，实验组C每日分两次完成烟雾处理，持续一个月。健康对照组D, 在正常空气条件下喂养1个月。 10只健康SPF级雄性Wistar大鼠，鼠龄810周，使这10只雄鼠分别与ABCD组母鼠交配。具体方法为每晚7点与雌鼠合笼，次

32、日上午810时观察雌鼠阴道口，先挑出有阴栓者确定为已交配；未见阴栓者进行阴道涂片，镜检发现精子即确定已交配，确定交配当日定为妊娠0 d(GD0)。孕鼠孕期继续按原香烟暴露量处理直至乳鼠出生，每隔3天称孕鼠体重，计算体重增长率，观察孕鼠体征，有无阴道出血流产等状况；记录孕期长度以确定是否有早产的情况发生。出生乳鼠当日测体重，鉴定性别，按头、躯干、四肢、尾部的顺序进行外观畸形检查。部分处死，取脑组织，称重，各组随机选取一只乳鼠，用基因芯片对其脑组织进行基因表达谱的分析，找出表达差异基因后，再用PCR扩增技术在该组余下样本中验证相应基因表达的差异。未处死的乳鼠在正常空气条件下继续饲养至4周龄，利用水迷宫、独木桥等实验测试子代鼠的记忆力、反应能力、平衡能力等指标，与对照组进行对比，为孕期香烟暴露影响子代脑部发育提供辅助证据。各组随机抽样，针对已验证的存在差异表达的基因再次利用PCR扩增技术检测，对比幼鼠时期，实验组与对照组的这些基因是否仍存在表达差异。实验流程图：产仔，检查乳鼠，部分处死，取脑组织基因表达谱测定、PCR验证余下正常条件下饲养4周行为学检测，再次PCR检测之前确定的差异基因表达异同5支/d15支/d25支/d0支/d5支/d15支/d25支/d0支/d母鼠40只ABCD烟雾暴露（30d）烟雾暴露(孕期)适应性饲养1周，分组各组分别与同品系健康公鼠10只交配