第五章-生物反应器的检测及控制汇总课件

1、第五章 生物反应器的检测及控制第一节 生化过程主要检测的参变量（1）温度 ：整个发酵过程不同阶段所维持的温度。其高低与发酵中酶反应速率、氧溶解度和传递速率、菌体生长速率和产物合成速率等密切相关。（2）压力:发酵过程中发酵罐维持压力。供给细胞呼吸代谢所必需的氧，强化培养液的混合与传质，可防止外界空气中杂菌侵入,避免污染。一般维持在0.02-0.05MPa。（3）液面（或浆液量）：液面的高低决定反应器的装料系数即影响生产效率。特别是通气发酵过程，排气会带走一定水分，影响液面。（4） 泡沫高度：无论厌气还是通气发酵均有不同程度的泡沫产生。控制不好，影响装料系数，降低生产率，同时可能造成染菌。（5）培

2、养基流加速度：实现优化连续发酵或流加操作，获得最大发酵速率和生产效率的控制参数。（6）通气量：每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积,也叫通风比,也是需氧发酵的控制参数。其大小与氧传递和其他控制参数有关,一般控制在0.5-1.0L/(L.min)。（7）黏度（或表观黏度）：其大小可作细胞生长或细胞形态的一项标志,也能反映罐中菌丝分裂过程情况,通常用表观黏度表示。其大小可改变氧传递阻力, 物质传递等。（8）搅拌转速与搅拌功率：两者与氧传递速率和发酵液混合状态以及物质传递等有关。好氧性发酵不同阶段控制不同转数,以调节培养基中溶氧。（9）冷却介质流量与温度：不同发酵时期的发酵热不同，要维持正常的发酵

3、温度，需要的冷却介质的流量和温度也有所不同。需要通过测定和控制冷却介质的进出口温度和流量。（10）蒸气压强：无论是发酵培养基还是发酵罐体等都需要饱和蒸气进行高温高压灭菌。（11）湿度：对于固体通风发酵，需要对通入发酵反应器的空气温度和湿度进行调控。另外，成品包装车间的湿度也需要控制。（12）pH值 ：发酵过程中各种生化反应的综合结果，是发酵工艺控制的重要参数之一。 pH值高低与菌体生长和产物合成重要相关。（13）溶氧浓度和氧化还原电位：需氧发酵中，不同发酵及发酵时期有不同溶氧水平，通过检测溶氧浓度变化，了解发酵是否异常，进行发酵中间控制。对亚好氧发酵则通过氧化还原电位计来确定微小溶氧值。（14

4、）发酵液中CO2溶解浓度：通气发酵中， CO2溶解浓度过高抑制细胞生长和产物形成；对光照自养的微藻培养，适当提高CO2溶解浓度有助于细胞生长。（15）培养基质浓度和产物浓度：发酵液中糖、氮、磷等对菌生长和产物合成有重要影响, 也是提高代谢产物产量的重要控制手段。产物浓度是发酵产物产量高低或合成代谢正常与否的重要参数 , 也是决定发酵周期长短的根据。（16）细胞浓度及酶活性：是控制发酵速率和效率的重要参数之一。生产上,常根据细胞浓度决定补料量和供氧量,以保证生产达预期水平。对酶的催化反应，酶活性也同等重要。第二节 生化过程常用检测方法及仪器 要求：传感器耐蒸气加热灭菌，较高精度和稳定性， 响应时

5、间短。一、检测方式及仪器组成在线检测：仪器的电极等可直接与反应器内的培养基接触或可连续从反应器中取样进行分析检测。如溶氧、温度、pH、压力等。一般首选。检测仪器的基本构成：被测样品 传感器 信号转换器 输出显示器 信号放大器离线测量：从反应器中取样出来后，用仪器或化学分析检测。二、主要参数检测原理及仪器在线无菌取样系统：（非挥发性物质检测取样）挥发性物质检测取样1.温度的测定温度检测仪包括：热电阻检测器、半导体热敏电阻、热电偶和玻璃温度计。常用金属热电阻温度计，以铂电阻最常用，其次是铜电阻。铂电阻耐热、耐腐蚀、精度高、价高；铜电阻价低、易氧化、体积大。半导体热敏电阻灵敏度高、响应时间短、体积小

6、、结构简单、耐腐蚀、寿命长，但温度与电阻值的关系非线性，使用不多。温度测量与控制：小型发酵罐：半导体或水银触点温度计大型发酵罐：铂金电阻或半导体温度计控温方式：用简单的On-Off或效果更佳的PID（画面信息数字化）控制控温介质：冷、热水。2.压强检测最常用的是隔膜式压力表。工业规模生产时，通常把压力信号转换成电信号，以便远距离监控。3.液位和泡沫高度检测液位检测法主要有：压差法、电容法和电导法，前两种最常用。（1）电容式液面计（液位不同，两根金属电极间电位不同）（2）压差法（反应器内上下两点或三点间不同压强计算出料液量和液面高度）泡沫高度测定：最常用电极探针测定，泡沫产生增多，其表面上升与电

7、极探针接触而产生电信号。另用超声波测定泡沫高度。泡沫控制：化学消泡和机械消泡4.培养基和液体流量测定最常用流量计，如液体质量流量计、电磁流量计、漩涡流量计和转子流量计。5.气体流量计实用类型分为：（1）体积流量型：根据流动气体动能的转换及流动类型改变而检测流量。（小实验室用转子流量计）（2）质量流量型：利用流体的固有性质如质量、导电性、电磁感应及导热等特性设计。最常用的是利用其导热性。6.发酵液黏度检测常用的黏度仪有：振动式黏度传感仪、毛细管黏度计、回转式黏度计以及涡轮旋转黏度计等。（1）振动式黏度传感仪：特制金属棒插入反应器溶液，强制振动，其振动特性与液体黏度有关。（可保证无菌操作，但测定黏

8、度相对值，精确度较差。）（2）发酵液循环黏度测定： 在反应器中装自动无菌取样循环系统，发酵液通过取样管路流过旋转式黏度计或毛细管黏度计，实现连续在线检测。（测定范围：0.015-100Pa.s，响应时间10s，灵敏度为满刻度的1）7.搅拌转速和搅拌功率（1）搅拌转速：罐容越小，转速越高。检测常用法磁感应式、光感应式：在搅拌或电极轴上装设感应片切割磁场或光速而产生脉冲信号，脉冲频率与转速相同。测速发电机：在搅拌或电极轴上装设一小型发电机，输出电压与转速成线性关系。搅拌转速调节：小罐采用直流电机、调速电机和变频器等实行无级调速，大罐调速设备投入大，目前固定转速。（2）搅拌功率生产规模的搅拌功率只测

9、定驱动电机电压与电流，或直接测定电机搅拌功率，但此功率包含传动减速机构的功率损失。实验研究采用轴转矩测定法。 P=2nM8.pH检测最常用的是复合pH电极，结构紧凑，耐高热。原理：玻璃电极和参比电极浸泡于某一溶液时，具有一定电位。注意：电极保护和标定。pH控制：加入酸碱试剂调节培养基中碳氮源的添加9.溶氧浓度检测常用溶氧电极测定原理：氧分子在阴极上还原，有电流产生，产生的电流和被还原的氧量成正比。溶氧值采用饱和溶氧百分数和溶氧值表示，前者最常用。注意：测定时使电极周围的液体适度流动，加强传质，尽量减小与电极膜接触的液膜滞流层厚度，减少气泡和生物细胞在膜上积存，减少测定误差。溶氧控制：根据发酵情

10、况流加碳源调节通风量和搅拌转速10.溶解CO2浓度检测原理：CO2分子能特殊选择渗透通过特定的微孔膜，并使扩散通过的CO2进入饱和碳酸氢钠缓冲溶液中，平衡后显示的pH与溶解的CO2浓度成正比。注意：其工作原理同pH计类似。每次灭菌后均需校正后才能测定。11.氧化还原电位（ORP）ORP作为亚需氧生物反应中微量溶氧浓度的指示。检测原理：基于溶液中的金属电极上进行的电子交换达平衡时，具有相应的ORP，此值与溶液的pH和温度以及溶氧有关。12.排气氧分压和CO2分压的检测（1）排气氧分压的检测：主要有磁氧分析、极谱电位法和质谱法。氧是顺磁性的，磁化率较大，在所有气体中占重要地位。将被检测样品气体导入

11、磁场，非均匀磁场范围内作用在气体分子上的力导致压强变化，即在均匀磁场和无磁场的空间存在压强差：p M Co2（2）排气中CO2分压检测常用红外线二氧化碳测定仪和二氧化碳电极。红外线二氧化碳测定仪原理：CO2在近红外波段有吸收谱，吸收峰在2.6-2.9103和4.1-4.5103nm间。吸收峰波段内，通过含有CO2的气体时，光强度衰减。I 。、 I入射光和衰减后光强度；光吸收系数；L光透过气体的距离，m；Co2 CO2气体浓度，13.细胞浓度测定（1）全细胞浓度测定：分湿重法、干重法、浊度法、湿细胞体积等。其中干重法最准确，其余三种简便。在线检测全细胞浓度必需满足：响应连续、迅速；灵敏度在0.0

12、2g/L以上；电极本身对细胞无影响；检测过程对细胞无损伤，不必加药物；可检测含固体微粒的发酵液；易于清洗、灭菌。流通式浊度计满足上述要求。不同细胞采用不同光，如可见单色光、激光或紫外光作为光源照射细胞。全细胞浓度与光密度值呈线性关系。注意： 适于游离细胞；气泡会干扰读数；适当提高发酵液流过光电比色皿速度，以免细胞附壁增大测定误差。（2）活细胞浓度测定原理：利用活细胞催化反应或活细胞本身特有物质而使用生物发光或化学发光法进行测定。例如：通过检测发酵液的ATP来测定活细胞浓度。 ATP荧光素O2氧化荧光素PP1CO2荧光 荧光强度与ATP浓度成正比。三、生物发酵液中营养成分与产物分析大多数成分是通

13、过微孔陶瓷取样器或渗透膜取样器取样后，使用HPLC或GC等仪器或化学方法检测。第三节 生物传感器的研究开发与应用生物传感器：由固定化的生物材料和适当的换能器件相结合而构成，换能器把生化反应信号转换成可定量的检测信号的检测器件。原理：利用生物细胞自身或其中所含的酶等有生物功能的物质制成。生物材料包括：固定化酶、微生物、抗原抗体、生物体组织或器官等换能器：电化学电极、热敏电阻、离子敏感场效应管、光纤和压电晶体等。一、生物传感器在微生物发酵过程检测上的应用（1）流式细胞仪（Cell Sorter）：被检测的含细胞试样流过检测器，细胞逐个滴下，由激光检出。根据预先设定的各种细胞的电特性进行识别，可统计

14、出细胞的尺寸分布及细胞龄等特性。（2）各种酶电极：用于培养基营养成分如糖类、营养盐以及产物等的分析检测。具体检测的酶反应原理，以及一些生产发酵中已研制开发的生物传感器，见材料p83-84表1-5-3和1-5-4。二、生物传感器的类型及结构原理生物传感器膜（固定化酶、微生物等）与其他有机或无机敏感膜的区别：不产生界面电势仅与待测物质发生生物催化反应，生成能使生物膜层下面的敏感层产生响应的物质，属二次响应。生物传感器特点（理论）：具有特异性和多样性不需添加化学反应试剂，检测方便、快速可自动和在线检测注意：事实不耐高温，稳定性不好，寿命短（急需解决）用于在线检测存在问题。1.酶电极（1）酶电极的响应

15、时间和响应信号输出稳态响应：酶电极置于待检测溶液时，电极信号随时间逐渐增加，最后趋于稳定。目的物质浓度测定步骤：以时间和响应信号为坐标，作出不同浓度标准物质响应曲线。再以标准物质的浓度和最初响应速率（由求得）为坐标，作出响应标准曲线。测定样品液的时间和响应信号的响应曲线，对照标准曲线，查出样品液中物质浓度。响应时间：当电极参加某一样品溶液或样液中待测物质浓度改变后，电极信号输出达到稳态值所需的时间。通常，输出信号达稳态值的95所需时间称为95响应时间或简称响应时间。响应时间的影响因素：酶膜的厚度和扩散速率以及被测系统的基质浓度（2）酶电极的专一性和抗离子干扰实际检测时，离子干扰和目的检测物质结

16、构类似物等均会导致酶电极的专一性，降低其测量的准确性和精度。（3）酶电极的稳定性和使用寿命 稳定性受酶失活和固定化酶渗漏影响。主要受被测溶液特性如是否存在使酶失活或分解的蛋白酶等，或过高或过低的pH等。提高稳定性和使用寿命的方法：酶固定化时，酶层上用半透膜保护或使用辅酶等方法；注意正确的电极保存和使用方法。（4）某些酶电极的原理说明（见材料p87）2.微生物电极可利用其中某种酶的催化作用，也可利用其中多种酶进行催化。较酶电极使用寿命长。分微生物呼吸性测定型和代谢产物电极活性物质测定型。（1）呼吸性测定型原理：微生物呼吸作用消耗氧或产生CO2，用氧电极或CO2电极进行检测。其浓度变化与待测物质浓度有相应关系。（2）代谢产物测定型原理：微生物活细胞使有机物代谢生成相应代谢产物，代谢产物使电极产生响应。3.免疫电极优点：重现性强、灵敏度、专一性高和检测速度快。（1）标记免疫电极原理：用酶、红血球或核糖体等作为标记物，在免疫反