基因的体外重组和转化ppt课件

1、外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达衔接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞7 基因的体外重组与转化7 基因的体外重组与转化1 DNA片段的体外衔接2 重组体导入细菌细胞3 重组噬菌体DNA的体外包装与转导4 重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染重组过程中，需求思索的要素：1衔接效率高、易于挑选；2便于回收外源基因；3在载体的启动子控制之下，并置于正确的阅读框之中，以便表达。基因的重组是依赖于限制性内切酶、DNA衔接酶和修饰酶的作用，分别对外源基因和载体进展适当切割和修饰后，将外源基因和载体巧妙地衔接在一同。1 DNA片段的体外衔接一、粘性末端的衔接二、平末端的衔接三、PCR

2、产物的衔接四、体外衔接应留意的事项五、体外衔接的结果体外衔接DNA衔接酶 ：由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子。；只能衔接粘性末端T4 DNA衔接酶： 由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。1970年：容易制备，而且可以衔接平末端DNA分子及单链DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中运用广泛。衔接酶一、粘性末端的衔接利用粘性末端单链间的碱基互补，并用DNA衔接酶把相互接近的5端磷酸与3-OH连到一同。1. 两段DNA的衔接依托粘性末端2. DNA片断与载体的衔接依托粘性末端3. 载体与载体的衔接二、平末端blunt end的衔接5端与3端并列接近的时间太

3、短，不容易被衔接酶衔接。1. 直接衔接T4DNA衔接酶虽然能衔接平末端，但效率很低，只需粘性末端的1%。5 5 5 5 3 3 3 3 -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3 -OH-PP-HO-5 3 1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。1同聚物加尾法 2. 人工加尾构成 “粘性末端 末端脱氧核苷酸转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。加尾碱基互补缺陷：优点：能把任何片段衔接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点用T4 DNA衔接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，构成一个人工粘性末端。

4、2衔接物(linker)衔接 linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker： linker的作用 缺陷：1可以用内切酶把插入片段切下来。假设插入片段内部也有该酶位点，不能切下完好的插入片段2能给载体衔接上Polylinker:优点：3DNA接头 (adapter)衔接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 BamHI adapter用T4DNA衔接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。 adapter一头平末端、另一头粘性末端某种酶切位点

5、序列。 adapter的作用Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接头自我衔接接头与接头会彼此以粘性末端接在一同，影响与DNA片段的衔接。优点：连上后就能用。缺陷：先用小牛肠碱性磷酸酶CIP处置接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我衔接。 以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。防止自我衔接碱性磷酸酶处置质粒载体为了提高衔接

6、效率，普通采取提高的浓度，添加重组子比例。这样就会出现自生衔接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处置，除去其末端的磷酸基，防止环化， 经过接反响后构成的缺口可在转化细胞后得以修复。载体自连及去磷酸化表示图常用碱性磷酸酶BAP（大肠杆菌）CIP(小牛肠)分子量 80,000温度 60 65最适PH8.0热稳定性好，100 暂时性失活，室温放置可恢复活性，苯酚完全失活分子量 100,000温度 37 最适PH10.0附近（高底物浓度）PH 8.0附近（低底物浓度）6530分钟处理99的活性不可逆失活，随具体条件改变有变动，完全失活苯酚处理5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P

7、-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接头之间不能构成磷酸二酯键自我衔接！ 5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP处置-OHHO-Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5GATCCCGG- HO-GGCC CCGG-OH -GGCCCTAG5 5HO-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5 缺口缺口HO-OHCIP处置T4 ligase虽然有缺口，但依然能与DNA片断衔接。衔接体系

8、载体DNA 50 ng 0.5ul目的DNA 19 ng ? ul双蒸水 ? ul 5ul连接反应液（2） 5ul总体积 10ul用加样器柔和吹打混匀,16连接2小时。附注：载体和目的基因的摩尔比为1:350ng:5.4kb=6.3ng:0.7kb6.3ng*3=19ng1. 载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。在最小的反响体积中，通常一个衔接反响用10-50ng的载体DNA。2. 平末端衔接在22保温4-16小时，粘性末端在22保温3小时，或16保温16小时。大多数衔接反响用T4DNA衔接酶，但大肠杆菌的DNA衔接

9、酶可用于粘性末端的衔接，平末端衔接时用此酶，活力较低。 3. 载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好运用灭菌的双蒸水而不是TE，毕竟TE中含有离子，能够影响衔接反响。衔接反响中值得留意的几个问题三、PCR产物的衔接1. 在引物的5端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；1设计原那么2带酶切位点的引物的构造3端1520bp与模板互补； 5端610bp是某个内切酶的识别序列。5端多余的35bp属维护碱基防止与所扩增的DNA片断内部酶切位点反复。引物1GCAGAATTC 互补序列模板EcoRI位点5-3 GCAGAATTC 互补序列5-3 3 模板GCAGAATTC 互补序列 PCR产物5-3 3

10、复性延伸模板模板3 3 GCTAGCCGG 互补序列模板BamH I 位点-5 3- 5 复性延伸模板模板3 3 GCTAGCCGG 互补序列-5 3-模板5 GCTAGCCGG PCR产物 互补序列-5 3-引物2带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC PCR产物5-3 GCTAGCCGG PCR产物-5 3-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTC PCR产物5-3 GCTAG PCR产物-5 3-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！2. 与T载体直接衔接1PCR产物两个3端普通都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个

11、多余的核苷酸优先加A。2T载体的两个3端人为地各加一个T利用Taq DNA聚合酶，当原料中只需dTTP时，被迫在平端载体上添加T！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶载体PCR产物TATA四、DNA体外衔接应留意的事项插入片断与载体的酶切位点互补一样的粘性末端才干有效地衔接。尽量防止平端衔接。EcoRIEcoRIEcoRI1用一样的酶切2用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。2. DNA插入的方向正确1用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向衔接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3. 插入

12、基因的开放阅读框ORF正确1DNA定向插入2起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要留意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTC T重组但移码突变！4. 防止载体本身环化衔接1提高插入片断的用量衔接反响体系中，插入片断比载体多10倍以上。2用碱性磷酸酶处置载体载体切口的5磷酸被除去，不能自我衔接。但可以与插入片断以单链衔接。5 3 载体插入片断五、载体和外源DNA插入片段的衔接结果1. 载体本身环化衔接2. 载体之间相互衔接3. 插入片段相互衔接4. 一个载体与几个插入片段重组五、载体和外源DNA插入片段的衔接结果5. 几个载体与一

13、个插入片段重组7能存活能存活不能存活能存活能存活 1972年，美国斯坦福大学的伯格P.Berg等人于把一种猿猴病毒的DNA与噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA衔接酶把这两种DNA分子衔接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子。 1973年，科恩S.Cohen等人把一段外源DNA片段与质粒DNA衔接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完好地建立起了基因克隆体系。 美国总统国家科学奖 中国科学院爱因斯坦讲席教授、美国国家科学院院士、美国斯坦福大学教授斯坦利科恩(Stanley N. Cohen) Stanley Cohen教授发明该专利时的笔记照片-重组DN

14、A专利 从同意该专利到该专利1997年12月2日失效的17年中，该专利一共答应了468家公司，两所大学共获得了答应费收入约2.55亿美圆。 2 重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备二、重组DNA导入大肠杆菌1.热休克法2.电转化法4.体外包装的噬菌体的转导重组体导入细菌细胞3.农杆菌介导法重组体的转化受体细胞重组体的转化 由流动镶嵌模型开展而来的生物膜构造模型 黑膜实验不同分子经过无膜蛋白的人工脂双层1. 目的添加受体菌细胞膜的通透性。一、感受态大肠杆菌的制备 原核细胞的转化细菌转化1)受体细胞的选择限制缺陷型: 防止修饰和降解重组缺陷型： 防止重组整合转化亲和型： 较高的可转化性遗传互

15、补型： 利于挑选感染缺陷型： 防止感染实验中运用的受体细胞为大肠杆菌DH5 alpha菌株。运用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2. 菌种用CaCl2处置大肠杆菌，能添加膜的通透性。3. 制备原理CaCl2诱导转化特殊处置受体细胞细胞膜特性改动CaCl2处置受体细菌50-100mmol/LCaCl2 感受态细菌重组体转入细菌4. 制备过程培育大肠杆菌OD600至0.5On ice 5-10 min4离心3000g 10min搜集菌用冰冷的50mMCaCl2重悬4离心搜集菌4离心搜集菌分装、-70 冻存用冰冷的50mMCaCl2重悬On ice 30 min用冰冷的50mMCa

16、Cl2重悬15%甘油3离心3重悬2冰浴CaCl2法制备感受态细胞流程将宿主菌在琼脂培育基平板上划线，37培育1620小时。挑取单菌落转入10ml LB培育基100ml-胰蛋白胨1g，酵母提取液0.5g，NaCl 1g，dH2O中，37 振荡培育过夜。从中汲取1ml转入50ml LB培育基中37振荡培育， 测OD600达0.40.6。培育物在冰浴中放置10分钟。取1.5ml参与预冷的Eppendorf管中，于5000rpm下室温离心2-5分钟。弃上清，参与1ml用冰预冷的0.05M CaCl2 ，混匀，置冰上10分钟。5000rpm 4离心10分钟，弃上清，加100ul 0.05M CaCl2重

17、悬，置冰浴备用或于4短期保管。假设欲将制备的感受态细胞长期保管，将制备的细胞重悬于含有15甘油的0.05M CaCl2 中，放入-80冰箱或液氮中冻存。转化-热激发取制备好的感受态细胞，置于冰浴上；向感受态细胞中参与衔接产物不超越转化体系的1/10体积，柔和混匀后冰浴上放置30min；将衔接体系放入42水浴中热激90sec；迅速转入冰浴2min；参与0.8ml LB培育基，37振荡培育45min；取适量培育物涂布于Amp+ LB固体培育基，放入37培育箱中培育。转化表示图1. 0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层构成液晶构造，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶分开

18、所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；2. 参与DNA，Ca2+又与DNA结合构成羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外外表上；3. 经短暂的42热脉冲处置后，细菌细胞膜的液晶构造发生猛烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性添加，DNA分子便趁机进入细胞内。二、重组DNA导入大肠杆菌1转化transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。2转染transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1. 外源DNA导入细菌的几种方法3转导transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。每gDNA转化胜利的细菌克隆数。 3. 转化方法 2. 转化率简单，但转

19、化效率不高1热休克法heat shock转化效率高2电转化法10ng载体DNA100L感受态菌 On ice混合，静置10分钟42C 1分钟参与1mL LB培育基37摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA1热休克法电击法 (Gene transfer by electroporation)2高压电穿孔转化法LB培育受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2C离心集菌冰冷的水重悬菌体2C离心集菌冰冷的水重悬菌体2C离心搜集菌体少量冰冷的水重悬分装成 50-300L 电转仪调为2.5kV,25F 脉冲控制器200-400 0.5g质粒DNA On ice混合参与1

20、mLSOC培育液37C中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化电转化法步骤：4. 平板培育基培育细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37过夜用氯化钙化学转化环形重组质粒 质粒自我衔接:干扰要素线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。环形质粒数1重组质粒 5. 影响转化率的要素生长形状制备感受态菌必需运用对数生长期的菌。必需在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在-70以下CaCl2处置运用感受态菌时必需迅速融化融化后普通不能再次冻存运用。2感受态细胞 competent cells) 把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染才

21、干的噬菌体颗粒。1体外包装in vitro packaging 2转导transduction经过受体菌细胞外表的DNA接受器位点receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进展扩增。3 重组噬菌体DNA的体外包装与转导cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32下培育细菌时可以坚持溶源性。 但当温度升高到4445时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。3cI857基因突变的噬菌体 但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。cI857其它基因溶源形状DNA不转录、不翻译DNA阻遏 蛋白阻遏 蛋

22、白4445DNA转录、翻译合成外壳蛋白32噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白尾部蛋白。在cI857基因突变的噬菌体的根底上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。 4 互补型噬菌体 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白头部、尾部蛋白。噬菌体2(5) 体外包装过程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，构成噬菌斑。每g DNA能构成106噬菌斑。 6 转导 74 重组克隆载体导入真核细胞一、导入酵母细胞二、导入植物细胞三、导入哺乳动物细胞外源基因导入真核细胞转化率高的菌株； 有突变的菌株与导入的载体基因互

23、补； 不育的菌株不会与其他酵母接合。一、导入酵母细胞1. 菌株选择如：ura3-52, trp1-289, leu2-3, leu2-112, his311利用原生质球进展转化 2. 酵母的转化方法 酵母原生质球感受态酶去壁CaCl2、 PEG插入外源基因 的酵母载体PEG聚乙二醇使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。 CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。 转化原生质球 (Spheroplast) 指细胞壁未被全部去掉的细菌细胞，它呈圆球状，可以人为地经过溶菌酶或青霉素处置革兰氏阴性细菌而获得。该类菌细胞壁肽聚糖虽被除去，但外壁层中脂多糖、脂蛋白依然保管，外壁的构造尚存。所以，原生质球较之原生质体对外界环境具一定抗性，并能在普通培育基上生长。 酵母0.1mol/L LiCl处置插入外源基因的酵母载体感受态40% PEG 40002利用Li+盐进展转化叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培育基愈伤组织分化幼苗二、导入植物细胞1.