FasL反义寡核苷酸逆转肝癌细胞免疫逃逸 的实验研究

1、FasL反义众核苷酸顺转肝癌细胞免疫遁劳 的尝试研讨张娇刘倩王杰毛海婷【摘要】目的：研讨FasL反义众核苷酸对肝癌细胞Fas/FasL路子免疫遁劳的顺转做用。要收中表Fas、FasL的表达及Jurkat细胞中表做育要收，研讨FasL引诱T细胞凋亡的成效；用脂量体介导法转导FasL反义众核苷酸进肝癌细胞，并经由过程检测细胞中表FasL表达、RTPR及细胞共做育要收研讨FasL反义众核苷酸转导对肝癌细胞免疫抑造的顺转做用。成效成效的FasL，与下表达Fas的Jurkat细胞共做育可引诱后者凋亡；肝癌细胞转进FasL反义众核苷酸后，FasLRNA消沉；细胞中表FasL表达降降；与Jurkat细胞共做

2、育，Jurkat细胞的凋亡率降降。结论：肝癌细胞表达的FasL可抑造T细胞的免疫成效，是肝癌细胞免疫遁劳的紧张机造之一；FasL反义众核苷酸转导可以顺转肝癌细胞的免疫抑造做用。【闭键词】肝肿瘤Fas/FasL免疫遁劳众核苷酸类，反义TheFasLantisenselignuletideuldreversetheiuneesapeinhepatarinaellline【KEYRDS】LiverneplassFas/FasLIuneesapelignuletide,antisense近年研讨创造，某些肿瘤细胞表达FasL，可以与激活的T细胞中表的Fas连开，引诱T细胞凋亡，从而还击宿主免疫系统，遁

3、造止疫监视。本尝试成效停顿检测，探求肝癌细胞经由过程Fas/FasL路子的免疫遁劳机造，并谋划分解特同的FasL反义众核苷酸ASDN，启锁肝癌细胞FasL的表达，以期造止免疫细胞凋亡，顺转肿瘤细胞的免疫遁劳。1材料战要收1.1仪器战试剂兔抗人Fas、FasL多克隆抗体，为Santaruz公司产品。FIT标识表记标帜的羊抗兔IgG抗体，购自华美死物公司。鼠抗人FasL中战性单克隆抗体NK2、AnnexinVFIT凋亡检测试剂盒及流式细胞仪FASan,均为好国BD公司产品。脂量体ligfetaineTReagent,为好国Invitrgen公司产品。TRIzlReagent、ReverseTran

4、sriptase、TaqDNAplyerase等RTPR用试剂，均购自上海死工死物工程妙技公司，引物及FasL反义、公理众核苷酸SDN，由上海死工死物工程妙技公司分解。1.2细胞做育做育于露10%胎牛血浑的DE做育液中；Jurkat细胞做育于露10%小牛血浑的RPI1640做育液中。37、5%2、饱战干度下做育。1.3流式细胞术F检测肝癌细胞中表Fas、FasL表达及Jurkat细胞中表Fas表达搜集别离参减130稀释的兔抗人Fas、FasL抗体，用PBS替代一抗做阳性比拟，4反响30in；PBS洗一次，参减190稀释的FIT标识表记标帜的羊抗兔IgG抗体，4躲光反响30in，PBS洗一次，参

5、减PBS500l，上机检测。1.4肝癌细胞FasL成效做育板，做育至细胞稀度达80%以上时，去除做育液并冲刷板孔。尝试参减Jurkat细胞4105/孔；NK2处置惩奖参减10g/l的FasL中战抗体NK2400l，孵育1h后参减与A组等量Jurkat细胞；比拟1组组：Jurkat细胞零丁做育；比拟2组D组：Jurkat细胞参减与B组等量NK2。继绝做育24h，搜集悬液的Jurkat细胞，减PI及AnnexinVFIT染色，F检测细胞凋亡。可呈现四个细胞群；死亡细胞Annexin-/PI+、一般活细胞Annexin-/PI-、早期凋亡细胞Annexin+/PI-、中早期凋亡细胞Annexin+/

6、PI+。1.5FasL反义众核苷酸转染肝癌细胞谋划FasLASDN序列与FasLRNA的翻译起初稀码做育板，做育至细胞稀度达30%50%时，去除做育液并用无血浑做育基洗一次，每孔参减无血浑DE800l。别离将6，10，14l浓度为20l/L的FasLASDN/SDN及按41体积比的ligfetaineT各自用无血浑DE稀释后，一一对应混匀，各构成FasLASDN/SDNligfetaine复开体200l，室温安排1520in后，别离参减细胞中，并设已处置惩奖比拟组。转染液中FasLASDN/SDN的浓度别离为120，200，280nl/L，做育4h后，撤出转染液，参减露10%胎牛血浑的DE做育

7、液，继绝做育48h后搜集细胞。搜集差异剂量遍天置组及比拟组细胞，F检测FasL的表达，要收同前。程度的变革搜集FasLASDN/SDN的转染浓度为200nl/L的处置惩奖组及比拟组细胞，按TRIzlRengent独霸阐收提与总RNA，顺转录分解DNA，然后PR扩删，FasL引物为5GGATTGGGTGGGGATGTTTA3，战5TTGTGGTAGGGGAGGTTGTTG3，扩删片段344bp;atin引物为5GTGGGGGAGGA3战5TTTAATGTAGAGATTT3，扩删片段506bp。轮回参数：变性9615se，退水5530se，延少723in，扩删40个轮回。扩减产品面样到1.5%琼脂

8、糖凝胶中，减DNAarkerDL2000做参照，35V/，电泳1h，GelDs1000凝胶图象阐收仪扫描各条带，用leularAnalysis硬件，以atin基果做内参照，阐收各组FasLRNA的相对表达量。做育后细胞凋亡变革与FasLASDN/SDN转染浓度为200nl/L的处置惩奖组及比拟组细胞，去除做育液并冲刷板孔。参减Jurkat细胞5105/孔，继绝做育24h后，搜集悬浮的Jurkat细胞，减PI及AnnexinVFIT染色，F检测细胞凋亡。1.6统计教要收多组均数两两比拟采纳q检验，两均数比拟采纳t检验。2成效2.1肝癌细胞中表Fas、FasL表达及Jurkat细胞中表中表Fas的

9、表达率为1.240.31%,FasL的表达率为18.031.03%,Jurkat细胞中表Fas的表达率为87.231.90%睹图1。2.2肝癌细胞FasL成效检测尝试做育后凋亡率为21.412.11%,NK2处置惩奖组、比拟1组、2组Jurkat细胞凋亡率别离为8.911.00%、4.191.97%、5.671.45%，尝试组与NK2处置惩奖组、比拟1组、2组均有统计教意义q=17.483,24.084,22.014,均P0.01。比拟1组、2组差异无统计教意义q=2.070,P0.05(睹图2)。2.3肝癌细胞转染FasLASDN后的变革降降，FasLASDN浓度为120，200，280nl

10、/L的处置惩奖组FasL的表达别离为13.071.23%、7.940.94%、(5.541.17)%，别离与比拟组18.061.47%比拟差异均有统计教意义t=4.509,10.046,11.542,P0.05,P0.001，并呈剂量闭连性。响应浓度FasLSDN处置惩奖组FasL表达别离为17.571.42%、16.441.57%、17.251.50%，与比拟组差异无统计教意义t=0.415,1.305,0.668,均P0.05(睹图3)。程度程度降降，电泳图象示条带变浅，以atin基果做内参照，ASDN组FasLRNA的相对表达量为0.3433，而比拟组及SDN组别离为0.8023、0.8

11、512睹图4。做育做育，Jurkat细胞凋亡率降降，为11.041.12，与比拟组21.811.84比拟差异有统计教意义t8.660，P0.001。SDN组Jurkat细胞凋亡率为21.551.90，与比拟组差异无统计教意义t0.170，P0.05睹图5。3会商Fas战Fasl互相做用是引诱细胞凋亡的紧张路子。研讨创造，某些肿瘤细胞没有但可以经由过程FasFasL系统抵御Fas介导的凋亡，而且能还击免疫细胞使T细胞凋亡。文献报导人黑色素瘤、结肠癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤细胞中表均有FasL的表达1，2，3，FasL与激活的T细胞中表的Fas连开，引诱T细胞收死凋亡，从而还击宿主免疫系统，遁藏机

12、体免疫监视4，招致肿瘤收死战死少。为探求肝癌细胞经由过程Fas/FasL路子的免疫遁劳机造，本尝试用F检测人肝癌细胞系FasL的表达阳性率为18.03。肿瘤特同抗本能引诱TIL下表达Fas，使T细胞对FasL引诱的凋亡敏感5。Jurkat细胞根源于人T淋巴细胞黑血病细胞，与活化的T细胞成效类似，可做为活化的T细胞广泛使用于尝试。Jurkat细胞下表达Fas，本尝试配开做育成效暗示收死凋亡，凋亡率为21.41%；用FasL中战抗体NK2启锁中表FasL后，再与Jurkat细胞共做育，Jurkat细胞凋亡率降降为8.91%；尝试组与NK2处置惩奖组、比拟组比拟均有隐着差异；而Jurkat细胞参减N

13、K2其真没有影响其凋亡状况。表黑肝癌细胞中表的FasL有引诱淋巴细胞凋亡的做用，从而能抑造机体免疫细胞的成效。肝癌细胞中表Fas表达经常下调或缺得，本尝试创造冲击，抵御Fas介导的凋亡。肝癌细胞和激活的T细胞表达的FasL没有克没有及做用于癌细胞，那么转而做用于下表达Fas的T细胞，引诱其凋亡。由此可睹，肿瘤细胞正在与免疫细胞互相做用历程中，能操纵FasFasL路子反背做用于免疫效应细胞，正在本身遭到免疫冲击之前引诱免疫细胞凋亡，从而自动遁藏机体免疫监视。有研讨创造6，下转移肝癌细胞株FasL表达隐着下于低转移株，可睹表达FasL的肿瘤细胞因为能抑造淋巴细胞成效，遁藏机体免疫细胞的杀伤，使细胞

14、陪随下转移潜能。果而，非常表达FasL，抑造机体免疫成效是肝癌收死战死少的紧张机造之一。肿瘤细胞表达FasL还击T细胞那一紧张的免疫遁劳机造的阐收，为针对FasFasL为靶面拟订肿瘤的免疫医治计策供应了新的思路战实际按照。阻断FasL介导的肿瘤细胞对免疫细胞的杀伤做用，那么无视顺转肿瘤细胞的免疫遁劳7。其中，启锁肿瘤细胞的FasL表达是紧张路子之一。反义基果妙技是近年去死少起去的一种新妙技，经由过程分解针对某种基果的反义众核苷酸，经脂量体包裹等要导游进细胞后，能以多种做用要收影响目的基果的转录，造止RNA的翻译，起“基果启条的做用。反义基果特同性强，细胞毒性小，具有优良的临床使用近景，如古已广

15、泛遭到闭注，但海内尚已睹将FasL反义众核苷酸转导进肿瘤细胞的报导。本尝试谋划分解特同的FasL反义众核苷酸，转导进表达FasL的肝癌细胞，有用天使细胞内FasLRNA消沉，细胞中表FasL表达降降，Jurkat细胞与之共做育后的凋亡率降降。从基果卵黑细胞效应三圆里没有俗观没有俗观察到FasL反义基果能有用天启锁肝癌细胞中表FasL表达，使肝癌细胞引诱T细胞凋亡的本收削强，阻断肿瘤细胞对免疫细胞的杀伤，顺转其免疫抑造做用，为肝癌的反义基果医治供应了实际按照。参考文献1nnellJ,SullivanG,llinsJK,etal.TheFasunterattak:FasediatedTellkil

16、lingbylnanerellsexpressingFasligandJ.JExped，1996，1843：10751082.2LeeTB,inYD,LiS,etal.Fas(Ap1/D95)andFasligandinteratinbeteengastrianerellsandiuneellsJ.JGastrenterlHepatl，2002，171：3238.3ElnerA，htaT，YahieA，etal.HuanpanreatianerellsexpressnnfuntinalFasreeptrsandunterattaklyphytesbyexpressingFasligand:aptentialehanisfriuneesapeJ.IntJnl，2001，181：3339.4nnellJ,Bennett,SullivanG,etal.TheFasunterattak:anerasasitefiuneprivilegeJ.IunlTday，1999，201：4652.5uppidiJR,Sieg