荧光定量PCR体系

1、实时荧光定量PCR技术原理、应用及实践(Real time Quantitative PCR)Real time Quantitative PCR 主要内容 Real-time qPCR的定量原理2Real-time qPCR的检测方法3Real-time qPCR的基本概念 1Real-time qPCR的解析方法 4PCR：基本原理Denaturation: 94 96CAnnealing: 50 65CExtension: 70 75C基本要素： Template Primers DNA polymerase dNTP, N=A,G,C or T PCR：基本原理理想的PCR反应： N=

2、N0*2n实际的PCR反应： N=N0* (1+E)nN0：初始模板量N：第n次循环后的产物量 n：扩增反应的循环次数 E：扩增效率S形曲线，具有平台效应 与普通PCR的对比同一个样本进行96次重复传统PCR检测Real time PCR 检测Real time PCR-起点检测： - 起点量是样本中起始的DNA量- “加入了500个拷贝”- 具有重现性，误差小传统PCR-终点检测： - 终点产物量经过PCR放大的DNA量- “生成了500，0000，0000个拷贝”- 不恒定，误差大传统PCR检测Real-time qPCR激发光发射光- 在PCR反应体系中加入荧光基团。- 荧光基团在激发光

3、的作用下，产生波长更长的发射光。- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。 荧光基团 扩增曲线（primary curve）扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）线性图对数图 荧光阈值（threshold）基线(baseline)：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值- 缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的1

4、0倍- 手动设置：大于样本的荧光背景值 Ct 值(Cycle Threshold)Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。 起始模板量 基线 阈值 Ct值 Ct 值(Cycle Threshold)Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动很大，但Ct值相对固定；Ct值则极具重现性Ct值可以确定初始模板量？Rn=RB+ X0 (1+E)N * RS第n个循环的总信号 =本底信号 + 起始DNA数目 * PCR扩增效率 * 单位信号强度当循环次数n=Ct时RCt=RB+ X0 (1+E)Ct * RS两边同时取对数得:lg(R

5、Ct-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRSCt=-lgX0/lg(1+E)+ lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E) Ct=-klgX0+blgX0与Ct值呈线性关系根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数起始拷贝数越多，Ct值越小。Rn vs. Cycle number- 扩增曲线LogDNA vs. Ct - 标准曲线.未知10410310610510210标准曲线 (standard curve)标准曲线分析- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释y = -ax+b 测定荧光定量PCR反应的有效性- 线性的标准曲线：相关系数R2- 扩增效率： 扩增效率(E)=1

6、0-1/斜率-1 标准曲线分析 荧光定量PCR检测方法染料标记： SYBR Green I探针标记：水解探针： TaqMan非水解探针：Molecular beacon SYBR Green I 工作原理SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光。荧光信号与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加。 荧光信号强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。5353SGSGSGSG5353SGSGSGSGEmissionExcitation- 变性时，DNA双链分开，无荧光信号。- 延伸结束时，采集荧光信号。 SYBR

7、Green I 工作原理 SYBR Green I优点： 使用方便，成本低- 仅需设计两个引物通用性好- 对DNA模板没有选择性需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。缺点：SYBR Green与所有双链DNA结合- 引物二聚体或错误扩增产物造成假阳性- 只能检测单一模板，无法进行多重检测 将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT) 融解曲线 (dissociation curve) 确认PCR反应产物的特异性 对数图谱 原始图谱融解曲线分析- 非特异性产物- 引物二聚体 Taqman 工作原理探针与靶序列配对 （一段序列，两个基团，5 报告基团、3淬灭基团）完整的探针，报告基团R发射的荧光

8、被淬灭基团Q淬灭， 没有荧光产生。聚合酶的5外切酶活性报告基团R与淬灭基团Q分离，发射荧光。RQReporterQuencherRQ荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。 Taqman 工作原理 在退火过程中，探针与靶序列结合探针被Taq酶的5- 3 外切酶活性剪切成片断游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离 SYBR Green I与Taqman 对比Taqman特异性高- 与特异靶序列结合对模板有选择性- 可进行多重PCR反应 SYBR Green I 使用方便，成本低- 仅需设计两个引物通用性好- 对DNA模板没有选择性 荧光定量PCR解析方法绝对定量 样本中核酸的量

9、（拷贝数、微克）- 检测某给定血液样本中的病毒颗粒数，有6000个拷贝相对定量 不同样本中目的基因表达量的差异- 肿瘤组织和正常组织相比 某个基因的表达量mRNA改变了多少倍，改变了60倍绝对定量的步骤拷贝数计算对标准品进行梯度浓度稀释荧光定量PCR反应建立标准品未知样品Ct代入标准曲线确定拷贝数质粒提取OD值测定计算待测样本浓度/样本分子量/待测样本拷贝数标准品进行5-6个梯度稀释标准品稀释倍数为10绝对定量Sample- 样本起始浓度与Ct呈线性关系，根据已知拷贝的标准品作出标准曲线。-根据未知样品的Ct值，推算出未知样本量。以标准品为标杆相对定量 参照样本 Calibrator用于比较结

10、果的基准。 相对定量 特点选择内参基因内参基因beta-actin、GAPDH、 18S rRNA等看家基因housekeepinggene在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小- 文献检索- 实验筛选内参基因- 同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。- RNA抽提、反转效率不同，操作中存在误差。对样本初始浓度差异进行均一化校正。2- Ct法成立条件：假设扩增效率为100%满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近 2）内参基因和目标基因的扩增效率均为90%-110%假设条件： 内参基因和目标基因扩增效率差异大于5% 1）优化实验条件，使扩增效率接近 2）使用其他

11、方法 相对定量方法 2- Ct法 相对定量举例相对定量分析 待测样品目的基因 浓度 待测样品内参基因 浓度 F= 对照样品目的基因 浓度 对照样品内参基因 浓度假设条件： 内参基因和目标基因扩增效率不同 优点：实验优化简单 缺点：每一轮实验都必需做标准曲线 双标准曲线法80% 相对定量举例 双标准曲线法 实 验 流 程 SYBR Green法实验流程 样本处理RNA提取qPCR数据分析逆转录 样本处理与RNA提取外界刺激 10min 可检测的表达改变样品离开定义环境 2min 裂解、固定细胞TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS）液氮RNA保存液 小心DNA污染

12、！使用DNase 阴性对照 逆转录逆转录引物选择下游应用：是否检测其它基因？Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？检测灵敏度是否足够？ RT-PCR一步法还是两步法？两步法: 反转录和PCR扩增分两步进行。 步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检测 多个基因。便于反应优化。在工作的初期。一步法：反转录和PCR扩增在同一管内完成。 简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。在工作的成熟阶段。荧光定量PCR体系Template PrimersDNA聚合酶Buffer and dNTPsDye总原则与普通PCR相同：避免引物二聚体，避免二级结构扩增片段长度（80

13、 - 300bp)推荐做跨intron设计引物设计原则Master mix使用Master mix有效降低系统误差- 热启动酶Hotstar化学修饰，低温下酶活抑制性强，热复活需10minFast Hotstar抗体修饰，热复活仅需几十秒- Buffer反应增强剂减少模板二级结构影响控制Mg2+浓度稳定剂- DyeReal SYBRGreen mix RealSuper mixMaster mix的优化新型荧光染料(Super Green)激发、发射波长与SYBR Green近似对PCR反应抑制更轻微可使用较高浓度(1uM, SYBR green 0.3uM)更亮，灵敏度更高较短的链延长时间对

14、小片段DNA和ssDNA结合更弱减少背景，有效信号更强与更强的信号协同，使溶解曲线峰更窄，适合于HRM分析化学性质更稳定致突变性与毒性更弱SYBR GreenSuper GreenMaster MixROX Passive Reference不参与、不干扰PCR反应恒定发射荧光信号用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。有不同系统，需参照仪器要求选择。 误差控制使用Master mix配置预混体系设置生物学重复（不同个体） 技术性重复（复孔）阳性和阴性对照 实验环境控制试剂准备区核酸制备区反应液制备区荧光定量PCR反应区荧光定量PCR体系 数据分析融解曲线：单一特异性产物扩增曲线

15、：- Ct值大小- 各复孔之间重复性- 不同浓度梯度稀释的间隔性标准曲线：- R20.980或 r 0.990- 反应效率尽可能高：90%-110%- 目的基因的扩增效率接近内参基因操作注意事项为避免加样误差，保证重复性，配制预混体系配制反应体系时，液体要缓慢加至管底，减少吹打低速离心，充分混匀，如有气泡短暂离心不要直接在八连管上进行标记避光保存，试剂分装避免反复冻融酒精擦拭移液器的吸头设置反应重复（至少二个）设置对照案例分析 总体原则偶然因素 - 操作原因实验重复 生物学重复、技术性重复机器因素 仪器加样孔结合扩增曲线、融解曲线、标准曲线分析单孔和多孔分析内参基因和目的基因对比分析案例分析

16、扩增曲线曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显。扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象。模板进行梯度稀释时，各浓度间隔性好。Ct 15-35重复性扩增曲线- 低浓度样本没有稀释好- 重复性差，加样存在误差案例分析 扩增曲线案例分析 扩增曲线 无信号或Ct值偏大内参基因和目的基因均无信号- RNA降解内参基因和目的基因均偏大- 模板量低- 对未知浓度的样品应从稀释最高浓度做起内参基因正常，而目的基因偏大或无信号 - 引物设计- 目的基因表达量低案例分析Q内参基因与目的基因的Ct值之差在多大范围内可以接受？A：- 在使用2-Ct法计算的前提是，公式成立的条件是内参基因和目的基因的扩增效率相接近

17、并且足够高，在90%-110%之间，因此内参基因与目的基因的差值是可以接受的。- 内参基因和目的基因的Ct值在15-35以内，并且重复管之间的重复性很好，这样的数据都是可以接受的。案例分析 扩增曲线扩增曲线不平滑- 样本浓度太低- 原始信号弱关闭ROX校正信号案例分析 扩增曲线扩增曲线很早扬起- 样本浓度太高（稀释样品浓度）案例分析 熔解曲线熔解曲线出现双峰引物峰：- 阴性对照（体系污染，配合扩增曲线）- 降低引物浓度- 重新设计引物非特异性扩增- 基因组污染- 非特异片段（重新设计引物）案例分析 熔解曲线非正常熔解曲线- 试剂污染- 仪器需要校正各点之间线性关系各孔的重复性R2相关系数Slo

18、pe E 反应效率 案例分析 标准曲线 案例分析 标准曲线标准曲线的线性关系不佳- 加样存在误差- 样品稀释不准确使得标准曲线不呈梯度。 扩增效率低 （引物的扩增效率、引物与模板的最适比例）- 调节引物终浓度 案例分析 标准曲线Trouble shooting 常见问题 可能原因 解决方法Housekeeping gene 无信号RNA降解用新鲜组织提取RNAHousekeeping gene 有信号而目标基因无信号1. 目的基因表达低。 逆转录效率不高2. PCR引物不良1. 富集mRNA 2. 在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。3. 尝试不同PCR引物。减小产物大小，改换目标 区段，考虑不同剪接体。4. 尝试不同热循程序，降低复性