(自然科学)GB4789涉及的微生物常规检测技术课件

1、GB4789-200334项GB4789-200839项方法改变12项，新增5项GB/T 4789.1-2008食品卫生微生物学检验 总则GB/T 4789.2-2008食品卫生微生物学检验 菌落总数测定GB/T 4789.3-2008食品卫生微生物学检验 大肠菌群计数GB/T 4789.4-2008食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验GB/T 4789.7-2008食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验GB/T 4789.8-2008食品卫生微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验GB/T 4789.9-2008食品卫生微生物学检验 空肠弯曲菌检验GB/T 4789.10-2008食品卫生微生物

2、学检验 金黄色葡萄球菌检验GB/T 4789.27-2008食品卫生微生物学检验 鲜乳中抗生素残留检验GB/T 4789.30-2008食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T 4789.34-2008食品卫生微生物学检验 双歧杆菌检验GB/T 4789.35-2008食品卫生微生物学检验 食品中乳酸菌检验GB/T 4789.36-2008食品卫生微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验GB/T 4789.37-2008食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌计数GB/T 4789.38-2008食品卫生微生物学检验 大肠杆菌计数GB/T 4789.39-2008食品卫生

3、微生物学检验 粪大肠菌群计数GB/T 4789.40-2008食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验菌落总数测定大肠菌群计数霉菌和酵母菌计数沙门氏菌检验志贺氏菌检验副溶血弧菌检验金黄色葡萄球菌检验试验器材准备样品处理和接种增菌培养选择性分离平板分离培养挑选菌落并进行生化试验生化结果及血清学试验初步判断试验器材准备玻璃器皿清洁新购的器皿：流水冲洗12%（工业用）盐酸浸泡26h 流水冲洗用过的器皿：直接清洗；高压灭菌后清洗试验器材准备消毒和灭菌湿热灭菌：高压蒸汽灭菌法适用于耐热的物品干热灭菌：干烤箱适用于在高温下不损坏、不变质、不蒸发的物品（160170持续2h）试验器材准备过滤除菌：滤器适用于对温

4、度不耐受的某些添加物紫外线：200-275nm，250-270nm；10m2无菌室需装30w紫外灯1只（距台面1m）试验器材准备高压蒸汽灭菌效果测定：留点温度计测试法：160，50化学指示剂测试法：OK试纸微生物学测试法：可直接取得灭菌效果的数据，是最可靠的方法嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞菌片（每片含1-5106），溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水试验器材准备紫外线消毒要求：保持灯管无尘定期用酒精棉球擦拭紫外线辐射强度不低于70w/cm2，照射时间25min 经常检测紫外线强度。紫外线强度仪使用时间1000h时定期更换灯管菌落总数测定定义：食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH

5、、需氧性质等），所得1mL（或1g）检样中形成菌落的总数菌落总数测定只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数不包括厌氧菌、微需氧菌和嗜冷菌及有特殊营养要求的菌菌落总数测定计算公式：N=C/（n1+0.1n2）dN-样品中菌落数；C-平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1-第一个适宜稀释度平板上的菌落数；n2-第二个适宜稀释度平板上的菌落数；d-稀释因子（第一稀释度）菌落总数测定-涂布法大肠菌群计数定义大肠菌群：一群在36条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。最可能数（MPN）：基于泊松分布的一种间接计数方法埃希菌属柠檬酸

6、杆菌属肠杆菌属克雷伯菌属大肠菌群计数MPN检索表MPN值：表示样品中活菌密度的估测数，是细菌密度的估计值MPN测定的最理想结果应是最低稀释度的全部管为阳性，最高稀释度的全部管为阴性大肠菌群计数检索表为10倍稀释，设3个稀释度：当按10倍加大或减少接种量时，所得结果按表内数值相应降低或增加10倍当怀疑水样有严重污染时，可用10倍稀释系列接种3个以上稀释度应做到最高稀释度至少有1管阴性表:不同稀释样品确定MPN所需乘积倍数举例实例阳性反应管数选择编码结果确定MPN乘积倍数51ml50.1ml50.01ml50.001ml50.0001ml1552005-2-01002554105-4-110035

7、30005-3-0104555315-3-110005010000-1-010大肠菌群计数当从表上查不到所得到的阳性管组合时，最好是重新检测或查阅更完整的MPN检索表表内所列阳性管组合是最为常见的，出现机率为99%以上，未列出的阳性组合，其总数不到1%大肠菌群计数MPN法还可用于测定食品中其它细菌，如沙门菌、粪链球菌、亚硫酸盐还原菌等须选用适合其生物特性的选择性培养基霉菌和酵母菌计数培养时间：3d开始，5d结束培养温度：2528计数方法：选择菌落数在10150之间的平皿计数霉菌和酵母菌计数生长特征 霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延霉菌和酵母菌计数

8、霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色霉菌和酵母菌计数霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落霉菌和酵母菌计数大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜 肠杆菌科、弧菌科及金葡菌检测培养特性观察形态结构观察生理生化试验血清学试验平板划线分离培养特性观察固体培养基液体培养基半固体培养基菌落大小形态颜色（色素是水溶性还是脂溶性）光泽度透明度质地隆起形状边缘特征及迁移性等表面生长情况（菌膜、环）

9、混浊度沉淀色素运动扩散培养特性观察1. 铜绿假单胞菌2.志贺氏菌 3.枯草芽孢杆菌 形态结构观察 染色特性形状大小排列方式细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等） 革兰染色革兰染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。革兰染色G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经石炭酸复红复染后就成红色革兰染色G+菌细胞壁中肽聚糖

10、层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色革兰染色生理生化试验-沙门氏菌TSI：-/+赖氨酸脱羧酶：+靛基质：-（如为+则需甘露醇+山梨醇+）尿素（pH7.2）：-KCN：-生理生化试验-沙门氏菌三糖铁（TSI）试验 肠道杆菌科为革兰氏阴性菌，可发酵葡萄糖产酸。三糖铁琼脂试验是利用糖类发酵的不同与硫化氢产生与否，将肠道杆菌科各组细菌或各菌属加以初步区分生理生化试验-沙门氏菌使用接种针先穿刺至底部，而后于斜面作划线接种，培养18-24小时生理生化试验-沙门氏菌生理生化试验-沙门氏菌三糖铁琼脂斜面培养基含有1乳糖及蔗糖与0.1葡萄糖

11、作为发酵基质，且以酚红作为酸碱指示剂，如培养基由橘红转为黄色，表示有糖类发酵。生理生化试验-沙门氏菌斜面碱性（红色-）底部酸性（黄色+）产气或不产气（或-产气时会造成琼脂裂开）：表示仅葡萄糖发酵。因微生物优先分解葡萄糖产酸，使培养基变黄生理生化试验-沙门氏菌但因葡萄糖含量低，斜面上产生的微量酸立即氧化而呈碱性反应，同时培养基中的蛋白质也随之利用而产碱，培养基底部则因氧张力较小，且微生物生长较慢，故仍维持酸性反应生理生化试验-沙门氏菌斜面酸性（黄色+）底部酸性（黄色+）产气或不产气（或-） ：表示除了葡萄糖发酵外，乳糖与（或）蔗糖也发酵。由于乳糖与蔗糖浓度高，经继续发酵，可维持培养基斜面与底部保

12、持酸性反应。生理生化试验-沙门氏菌斜面碱性（红色-）底部碱性（红色-）或无变化（橘红色）：表示无糖类发酵。而蛋白质则于有氧或厌氧条件下进行代谢产生氨，而使培养基呈碱性反应，如有氧与厌氧均发生蛋白质分解，则斜面与底部均呈碱性反应生理生化试验-沙门氏菌 三糖铁琼脂培养基中含有硫代硫酸钠作为产生硫化氢的基质，且含硫酸亚铁作为检测此无色产物之指示剂，若微生物有硫化氢产生，会与亚铁离子作用生成不溶性硫化亚铁之沉淀，进而使培养基变黑培养基变黑斜面红色，底面黄色制好的培养基培养基全黄色斜面、底部黄色，并产生H2S斜面红色，底部黄色，产生H2S底面黄色，并产生CO2对照管生理生化试验-沙门氏菌为使结果准确，应

13、于接种培养18-24小时内观察结果，以确保糖类尚未用尽，且蛋白质分解之碱性终产物尚未产生。生理生化试验-沙门氏菌赖氨酸脱羧酶试验原理：细菌（如阴沟肠杆菌）含有氨基酸脱羧酶，使羧基释出，生成胺类和二氧化碳。此反应在偏酸的条件下进行。当培养基含胺类时呈碱性反应，使指示剂变色。生理生化试验-沙门氏菌接种：用幼龄培养液作为菌种，直接接种。接种后封液体石蜡，对照管与测定管同时接种封油。肠杆菌科的细菌于37培养4天观察结果：阳性-先黄色后变为紫色或带红色调的紫色；阴性-黄色；对照管-黄色生理生化试验-沙门氏菌生理生化试验-沙门氏菌靛基质（吲哚）试验原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质，与对二甲氨基苯

14、甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈色结果：阴性（液面黄）；阳性（液面玫瑰红）生理生化试验-沙门氏菌生理生化试验-沙门氏菌尿素酶试验原理：细菌产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。其活性最适pH为7.2结果：阴性-黄；阳性-红生理生化试验-沙门氏菌生理生化试验-沙门氏菌氰化钾试验 原理：KCN可抑制某些细菌的呼吸酶系统。细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶以铁卟啉作为辅基，KCN能与铁卟啉结合使这些酶失去活性从而抑制细菌的生长生理生化试验-沙门氏菌结果：浑浊（未抑制）+；清亮（抑制）-接种时注意菌量不宜过多注意：氰化钾是剧毒药品，操作时必须小心。培养基用毕

15、，每管加几粒硫酸亚铁和0.5mL20KOH以解毒，然后清洗生理生化试验-沙门氏菌意义：当培养基中KCN含量为1：13300或1：10000时，肠杆菌科中沙门氏菌、志贺氏菌和大肠埃希菌的生长受到抑制而其他菌大多能生长生理生化试验-志贺氏菌TSI：-/+-葡萄糖半固体：动力-葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、赖氨酸脱羧酶、尿素、KCN、水杨苷和七叶苷：-生理生化试验-志贺氏菌葡萄糖铵利用原理：当细菌可以利用铵盐作为唯一氮源且不需要尼克酸和某些氨基酸作为生长因子时，可以在葡萄糖铵培养基上生长。生理生化试验-志贺氏菌结果：阳性者斜面上有正常大小的菌落生长，阴性者不生长或生长极微小的菌落意义大肠埃希菌可利用铵盐

16、作为唯一氮源，且不需要尼克酸作为生长因子-生长生理生化试验-志贺氏菌志贺菌属可利用铵盐作为唯一氮源，但需要尼克酸作为生长因子-不生长变形杆菌和摩根氏菌属不能利用铵盐作为唯一氮源，补给尼克酸也不能生长-不生长生理生化试验-志贺氏菌西蒙氏柠檬酸盐利用原理：当细菌可以利用铵盐作为唯一氮源，同时利用柠檬酸盐为唯一碳源时，可以在葡萄糖铵培养基上生长。细菌生长时，分解柠檬酸生成碳酸盐，使培养基变碱生理生化试验-志贺氏菌结果：阳性者斜面上菌落生长，培养基由绿色转为蓝色，阴性者不生长意义肠杆菌科中大肠埃希菌属、志贺氏菌属、爱德华氏菌属和摩根氏菌属均为阴性其它菌属多为阳性生理生化试验-副溶血性弧菌3.5%氯化钠

17、TSI：-/+-氧化酶试验：+革兰氏染色：-，棒状、弧状、卵原状等多形态，无芽胞，有鞭毛生理生化试验-副溶血性弧菌嗜盐试验：在无氯化钠和10%氯化钠胰胨水不生长或微弱生长，在7%氯化钠胰胨水生长良好生理生化试验-副溶血性弧菌氧化酶试验 氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应生理生化试验-副溶血性弧菌注意：盐酸二甲基对苯二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。生理生化试验-副溶血性弧菌铁、镍铬丝等金属可催化盐酸二甲基对苯二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，

18、会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔生理生化试验-副溶血性弧菌在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性意义：是区分肠杆菌科细菌和弧菌科细菌的重要试验生理生化试验-副溶血性弧菌嗜盐试验观察渗透压对细菌生长的影响。由于不同菌类耐盐性不同，故常以此作为鉴别特征。生理生化试验-副溶血性弧菌一般可根据不同种类的菌株，选择其适合生长的培养基，在其中加入不同量的NaCl，接种后观察其生长与否，以判断其耐盐性注意：接种的细菌量不宜过多生理生化试验-金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板血浆凝固酶试验：+过氧化氢酶试验：+生理

19、生化试验-金黄色葡萄球菌过氧化氢酶试验 过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解为水和氧。试剂：3过氧化氢溶液（H2O2）生理生化试验-金黄色葡萄球菌注意：过氧化氢酶是1种以正铁血红素作为辅基的酶，所以测试菌所生长的培养基不可含有血红素或红血球。血清学试验 血清学反应：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。 血清学试验血清学反应的特点 抗原抗体的结合具有特异性，当有共同抗原存在时，会出现交叉反应抗原抗体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的血清学试验抗原抗体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应血清学试验血清学反应的两个阶段第一