一定要这样(共7页)

1、 将上述试剂加入经DEPC处理过的0.2mlEP管中，快速(kui s)离心混匀，PCR仪中37反应(fnyng)60min，95 5min灭活MMLV，可于4保存(bocn)2h。(5) Real-time PCR扩增反应1) 引物设计引物设计基本原则：引物与模板的序列要紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)，因此需要考虑引物长度、产物长度、Tm、G、二聚体、发夹结构的能值、GC含量等。设计的引物送上海生物工程有限公司合成，具体如表7。将以上反应体系依次加入0.2ml的EP管中(冰浴上进行)，短暂离心后进行PCR扩增反应

2、。反应参数如下：反应结束后确定Real-TimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量作标准曲线。此实验重复三次，分别为A组、B组、C组记录数据进行统计分析。经100 ng/ml的IL-17处理24小时后，PCR结果提示：SGC-7901组细胞上皮间质标志物E-cadherin较对照组下降74%，P=0.034；N-cadherin较对照组上升65%，P=0.045，Vimentin较对照组上升48%，P=0.034；MGC-803组细胞上皮间质标志物E-cadherin较对照组下降74%，P=0.034；N-cadherin较对照组上升65%，P=0.045，Vimentin较对照组上升

3、48%，P=0.034，结果表明，在RNA水平，IL-17能够降低E-cadherin的表达，增加N-cadherin，Vimentin的表达，差异具有统计学意义。如表9，图所示。 (4) DEPC 水配制：1000ml ddH2O 加入 1mlDEPC原液，混匀，15 磅高压 20min，4保存备用。(5) 1TBE 电泳缓冲液：Tris 121g，EDTA 7.4g，硼酸 53.4 g，ddH2O 定容至 1000ml，用 HCl 调 PH 至 8.0，4保存备用。(6) 15%SDS分离胶：(5ml) 配制30%丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙烯酰胺 2.5ml 1.5M TrisHCl(pH

4、8.8) 1.3ml ddH2O 1.1ml 10%SDS 50ul 10%过硫酸铵 50ulTEMED 2ul(7) 5%SDS积层胶：(3ml) 配制(pizh)30%丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙烯酰胺0.5ml 1.5M TrisHCl(Ph6.8) 0.38ml ddH2O 2.1ml 10%SDS 30ul 10%过硫酸铵 30ul TEMED 3ul(8) 2SDS样品缓冲液配制：SDS 800mg；DTT 0.616g；甘油 4ml；0.5M TrisHCl(Ph6.8)2ml；溴芬兰(fn ln)少许(0.1%)加蒸馏水至 20ml。混匀，4保存(bocn)。 (9) 1SDS电

5、泳缓冲液配制：甘胺酸 94g；Tris 碱 15.1g；10%SDS 50ml；用蒸馏水定容至 5000ml，不必调校 PH 值，常温保存备用。 (10) SDS电泳转移缓冲液：Tris 碱 5.8g，甘氨酸 2.9g，SDS 0.37g，甲醇200ml，ddH2O定容至 1000ml，常温保存备用。 (11) 10TBS：24.2g Tris 碱，80g NaCl，用盐酸调校 pH 至 7.6，去离子水定容至1000ml，常温保存备用。 (12) TBST：1TBS 1000ml，Tween20 1ml，混匀，常温保存备用。 (13) 5%封闭液：5g 脱脂奶粉，100ml TBST，混匀，

6、常温保存备用。(14) 甲醛变性胶：0.26g 琼脂糖，17.5mlDEPC水，5.5ml 10MOPS(3-玛琳代丙磺酸)，5ml甲醛。先将琼脂糖溶于DEPC水中，微波炉加热溶解，冷却后加入MOPS和甲醛，混合后制板供总RNA电泳。(15) 5甲醛凝胶电泳缓冲液：MOPS0.1mol/L，pH 7.0乙酸钠0.04mol/LEDTANa2 5mmol/L用2mol/L的NaOH或HCl调pH至7.0(16) 3%过氧化氢(u yn hu qn)溶液：30%H2O2 1份+蒸馏水9份混合(hnh)而成。 研究(ynji)方法(1) 取冻存细胞，复苏，操作步骤同前。将两种细胞株传代至12孔板，每

7、组细胞传代3复孔，按照前述步骤进行换液，待细胞生长至 85融合时，弃培养基，PBS 清洗，实验组分别加入终浓度为10 ng/ml的IL-17，以加入等量PBS为对照组，培养24小时。(2) 细胞总蛋白提取1) 用加样枪吸净 PBS 后每孔加入200 ul 0.25%胰酶，消化约 5 分钟，每孔加入 1ml PBS，吹打，用吸管将细胞悬液转移至离心管，2000 转/分，10 分钟后弃上清，每管加入 RIPA 250 ul，PMSF 5ul，置于冰上消化 10 分钟。 2) 将所有细胞悬液转移至 1.5mlEP 管中，进行超声裂解细胞。 3) 4低温高速离心，12000g，30 分钟。 4) 吸取

8、上清，并做好标记。 5) 蛋白定量：(法蛋白定量)准确称取 10mg 的标准蛋白(常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白)加蒸馏水溶解，定容到 100ml。取 6 支试管分别编号为 05，分别加入标准蛋白溶液 0，20，40，60，80，100ul，并用蒸馏水补足体积到 100ul。各试管加入工作液 2ml，混匀，37水浴保温 30min。在分光光度计上，以 0 管为参比，测定各管样品在 562nm 的吸光度值。以蛋白浓度为横座标,吸光度为纵座标，绘制标准曲线。取样品溶液 100ul，将测得的吸光度值代入上述标准曲线，并计算蛋白浓度。如果样品的浓度过高，可用水做适当的稀释。 (3) Western 印

9、记 1) 制备分离胶及浓缩胶，按顺序每个加样孔加入 10g 蛋白样品，3ul Marker，并做好标记。 2) 电泳时先 80V 30 分钟，再 100V 1 小时 30 分钟。3) 用转移缓冲液洗涤胶和膜，将膜铺在胶上，用 5ml 的移液管在胶上来回的滚动驱除所有的气泡，在胶/膜外再包一张 3mm 的滤纸(预先用转移缓冲液侵泡)，将胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。将此滤纸/胶/膜滤纸放入电泳槽中，胶面向阴极。将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没胶，低温电泳(4 )，100V，1 小时30 分钟。 4) 含 3% BSA 的 PBS 封闭(fngb) 3 小时。 5) 将 PVDF

10、 膜放入湿盒内，附一抗，4过夜(guy)。一抗浓度(nngd)为： 1：500 6) 1%TBST 洗膜，5分钟，6次 7) 二抗浓度均为 1：2000，室温放置1小时 8) 1%TBST 洗膜，5分钟，6次， 9) 辣根过氧化酶显色 10) Quantity One 软件分析目的基因和内参基因光密度值。统计方法同上。在提取总蛋白后，我们采用Western Blot方法观察EMT相关标志物在蛋白水平的改变。经100 ng/ml的IL-17处理24小时后，WB结果提示，SGC-7901细胞上皮间质标志物E-cadherin较对照组下降34%，P=0.026；N-cadherin较对照组上升45%

11、，P=0.035，N-cadherin较对照组上升31%，P=0.024，MGC-803细胞上皮间质标志物E-cadherin较对照组下降34%，P=0.026；N-cadherin较对照组上升45%，P=0.035，VIMENTIN较对照组上升31%，P=0.024。结果表明，在蛋白水平，IL-17能够降低E-cadherin的表达，增加N-cadherin，Vimentin的表达，与RNA水平表现一致。表11 IL-17诱导后胃癌SGC-7901细胞E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白表统计学处理采用SPSS 18.0软件处理系统进行统计分析，实验数据以S表示，

12、运用单因素方差分析处理，两两比较用 T 检验，组间比较采用单因素方差分析。以 P 值0.05 为差异显著，P 值0.01 为差异非常显著，P 值0.05 为无统计学意义上的差异。后续实验中数据的统计方法与此相同。胃癌侵袭转移是临床(ln chun)治疗的重点与难点,侵袭转移是一个多步骤，多分子参与的复杂生物学过程,常伴有基因突变或者信号通路抑制或激活 ADDIN EN.CITE Herrero2014111117Herrero, R.Parsonnet, J.Greenberg, E. R.Section of Early Detection and Prevention, Internati

13、onal Agency for Research on Cancer, Lyon, France.Department of Medicine, Stanford University Medical Center, Stanford, California.Division of Public Health Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington.Prevention of gastric cancerJAMAJamaJAMAJamaJAMAJama1197-831212Health Poli

14、cyHelicobacter Infections/diagnosis/*drug therapyHumansRandomized Controlled Trials as TopicStomach Neoplasms/microbiology/*prevention & controlUnited States2014Sep 241538-3598 (Electronic)0098-7484 (Linking)25247512/pubmed/2524751210.1001/jama.2014.10498 HYPERLINK l _ENREF_1 o Herrero, 2014 #1 1,随着

15、胃癌研究不断深入,目前对发生侵袭转移的相关机制有了初步了解,大量研究证实,上皮间质转化(EMT)是肿瘤侵袭转移的关键步骤,通过对发生上皮间质转化相关信号通路进行干扰或抑制成为预防或治疗(zhlio)侵袭转移的重要方向之一,但肿瘤EMT发生机制十分复杂，基因突变(j yn t bin)、机体酸碱平衡紊乱、细菌、病毒感染、以及射线等理化因素均能导致上皮间质转化通路的激活,进而促进肿瘤侵袭转移的发生 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_17 o Peng, 2014 #15 17, HYPERLINK l _ENREF_18 o L

16、i, 2015 #51 18。近年来研究发现肿瘤细胞在炎症微环境可以促进肿瘤细胞发生EMT转化，但肿瘤微环境是一个复杂的分子网络结构，包含诸多炎症分子,有些分子是发挥抑癌作用，有些分子发挥促癌作用,甚至某些分子在肿瘤不同阶段发挥作用不同。因此，对炎性分子中作用比较突出的分子进行研究，明确在肿瘤侵袭过程中发挥的具体作用，为进一步发现胃癌诊断标志物，以及新的治疗靶点的研究具有重要的临床意义 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_19 o Liu, 2014 #17 19, HYPERLINK l _ENREF_20 o Takao,

17、 1991 #18 20。我们在前期研究中也发现IL-17在胃癌组织中高表达，且与胃癌浸润深度、淋巴结转移和TNM分期密切相关，高表达IL-17的胃癌患者预后较差 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_14 o Zhuang, 2012 #14 14,但其促进胃癌侵袭转移的机制尚不清楚。在本研究中，我们采用两种不同分化程度及恶性程度的胃癌细胞SGC-7901和MGC-803细胞在体外培养。研究中,我们验证IL-17是通过促进EMT发挥作用的,在本研究中采用real-time PCR方法及蛋白免疫印迹两种实验方法,分别从RNA水平

18、及蛋白水平研究了IL-17对EMT相关标志物E-cadherin、N-cadherin、VIMENTIN的影响,IL-17是一种重要的炎症分子，由155个氨基酸组成的相对分子质量为（15-22）103的同型二聚体，N端为信号多肽。IL-17细胞因子家族中至少有6个成员，包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（又称IL-25）和IL-17F，其中IL-17A是该家族的标志性细胞因子 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_21 o Wang, 2008 #19 21, HYPERLINK l _EN

19、REF_22 o Yang, 2013 #20 22。慢性炎症例如炎症性肠病（inflammatory bowel diseases)、幽门螺杆菌感染、乙肝病毒感染和病源不明的前列腺炎均可致肿瘤的发生，称为炎症相关性肿瘤，而在这类肿瘤中都发现有IL-17表达增高。并且相关报道表明，在结肠癌，肺癌，鼻咽癌等肿瘤淋巴结转移灶微环境中，均能检测出IL-17呈高表达 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_23 o Roussel, 2010 #21 23-25，我们在前期研究中也发现IL-17在胃癌组织中高表达，且与胃癌浸润深度、淋巴结

20、转移和TNM分期密切相关，高表达IL-17的胃癌患者预后较差。EMT是一种常见的生物学现象，其与胚胎发生，伤口愈合等具有(jyu)密切关系，同时，EMT也参与肿瘤的发生发展，随着细胞极性消失，粘附能力下降，细胞发生远处迁移的可能性也增大 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_26 o Cai, 2013 #24 26，在肝癌，乳腺癌，结直肠癌等诸多肿瘤细胞(xbo)中已经研究中证实EMT在肿瘤侵袭转移中的重要作用，EMT改变作为肿瘤发生转移的关键步骤这一观点被广泛接受 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DA

21、TA HYPERLINK l _ENREF_27 o de Herreros, 2010 #25 27。在上皮间质转化研究中,细胞的形态发生显著变化，细胞之间连接逐渐(zhjin)变疏松，部分细胞由多边多角形态变成梭形或者呈椭圆 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_15 o Jo, 2009 #26 15,本研究发现IL-17的刺激能显著改变胃癌细胞的形态，SGC-7901细胞及MGC-803均出现了相应的改变,细胞由多角紧密连接状态逐渐向连接松散，梭形形态转变，细胞粘附能力明显下降，其中,MGC-803细胞改变更为明显,可能

22、因为MGC-803细胞分化程度低,恶性程度高,更容易发生上皮间质转化。而SGC-7901细胞本身形态呈瓦片状，分角较少，所以改变先对较少，而对照组细胞并未观察到明显改变 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_16 o Huang, 2010 #27 16。在EMT的机制研究中，E-cadherin及Vimentin是研究较多的分子，一方面因为E-cadherin是细胞间连接的重要分子，当上皮间质转化发生时，细胞间粘附下降，Vimentin作为细胞骨架蛋白，在细胞运动过程中起支架作用，因此细胞发生上皮间质转化过程中，E-cadhe

23、rin表达会下调，而Vimentin表达上调是重要的标志性分子 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_28 o Zhou, 2011 #28 28。我们研究结果也提示，经IL-17处理后，SGC-7901细胞以及MGC-803细胞发生了一致性的改变，这与前一部分实验结果一致，E-cadherin表达下调,而Vimentin表达上调，证明IL-17能够促进胃癌细胞发生上皮间质转化。前面迁移侵袭实验也证实,IL-17能够增强细胞的迁移侵袭能力,在本研究中,划痕实验结果发现,IL-17能够显著提高SGC-7901细胞和MGC-803细

24、胞迁移能力,Transwell小室也证实,与实验对照组相比,经IL-17处理过细胞侵袭能力更强,穿膜细胞数量更多,这与相关文献报道一致 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_4 o Yan, 2015 #4 4, HYPERLINK l _ENREF_29 o Wang, 2013 #29 29。 EMT发生的细胞信号调控机制较为复杂，目前众多信号通路均参与到EMT的调控之中，如NOTCH，WNT，TGF-等 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_30 o Gao

25、, 2015 #30 30, HYPERLINK l _ENREF_31 o Wang, 2014 #31 31。但IL-17通过何种途径影响胃癌细胞EMT尚不清楚。查阅大量文献,我们发现, Stat3可能是潜在的上游分子之一。Stat3是Stat家族的重要成员，这些成员是一类双功能分子，不但参与信号转导，同时也激活基因表达。目前认为，Stat3是与恶性肿瘤的发生密切相关的信号转导通路之一，STAT3的过度激活会表现出促进肿瘤EMT转化的作用, 它的转录活性是调节肿瘤侵袭转移的先决条件 ADDIN EN.CITE Zhang20153232323217Zhang, C.Guo, F.Xu, G.Ma, J.Shao, F.Department of Hepatic Surgery, Affiliated Provincial Hospital, Anhui Medical University, Hefei, Anhui 230001, P.R. China.Department of Anesthesiology, Affiliated Provincial Hospital, Anhui