分子实验 生物工程(共18页)

1、 实验(shyn)一 植物(zhw)基因组DNA的提取及其定性(dng xng)、定量分析【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的

2、多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L

3、 DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 g/mL，ssDNA 33 g/mL和ssRNA 40 g/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。【仪器、材料与试剂】 一

4、、仪器及耗材离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 L量程各一支)、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套。二、药品三羟甲基氨基(nj)甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基(wn j)三甲基溴化铵)、-巯基乙醇、氯仿(l fn)、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。三、试剂1. 2CTAB buffer【1】70

5、%乙醇【2】RNaseA (天根)【3】0.5TBE缓冲液(工作浓度) 【4】6loading buffer【5】6. 核酸染料(赛百盛)7. DNA marker DL 2000(Takara)8. 酚/氯仿 (1:1, V/V) 【6】【实验步骤】 1. 取约100 mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5 mL EP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。2. 加入0.6 mL 2CTAB提取液（用前加入0.2的巯基乙醇），混匀，65 水浴30 min，每10 min颠倒混匀一次。3. 取出离心管，冷却后加入0.6 mL酚氯仿混合液，混匀。4. 11,500 rpm室温离心8 min(若没离好可重复一次

6、)。5. 将上清液(约400 L)转移到另一新的1.5 mL离心管中。6. 加入与上清等体积的氯仿，混匀，11,500 rpm 离心8 min，取上清(约350 L)。7. 加入600 L无水乙醇，上下颠倒混匀，-80放置30 min。8. 4，15,800 rpm离心20 min，弃上清。9. 1 mL 70乙醇(预冷)洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能vortex，7,000 g离心3 min，弃上清，风干。10. 加入30 L无菌水(含20 g/mL RNase A)，37 溶解DNA 30 min。11. 取5 L DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：(1) 制备琼脂糖凝胶称取0.3 g

7、琼脂糖，放入三角瓶中，加入30 mL 0.5 TBE缓冲液，置微波炉中加热至完全熔化，取出摇匀，则为1琼脂糖凝胶液。(2) 胶板的制备 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙），形成一个模具。 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定(gdng)位置放好样品梳子。 待琼脂糖凝胶液冷却(lngqu)到60 左右时，加入(jir)核酸染料1.5 L，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30-45 min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。 加入

8、0.5 TBE电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1 mm。(3) 加样在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1。用10 L微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNA marker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 (4) 电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此，最高电压不超过5V/cm。 当溴酚蓝染料移

9、动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存。12.紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度：(1) 用0.1TE对待测DNA样品按1:20或合适的倍数稀释。(2) 开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready”时，进入核酸测定窗口。(3) 调零。先用0.1TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键，仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。(4) 吸70 L已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很少，可以用5-7 L的石英样

10、品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260 nm和280 nm处的光密度（OD值）及A260/A280 nm和A280/A260 nm的比率以及DNA样品的浓度等。(5) 打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入下一个待测样品。(6) DNA纯度(chnd)：以A260/ A280比值(bzh)来反映。当A260 /A280比值(bzh)2.0，说明样品存在RNA污染，可以用RNA酶处理样品去除RNA。注意事项：1、磨样时要反复插入液氮中冷冻，但要避免液氮进入管中；2、取酚氯仿混合液时要吸取下层；3、加入酚氯仿和氯仿时要充分混匀；4、

11、氯仿抽提后取上清时不要吸到蛋白层；5、晾干沉淀时，要尽可能的吸除酒精。【实验结果】样品260280260/28010.0310.0241.291 20.0240.0211.142 30.0330.0201.650 40.0280.0231.217 50.0450.0311.452 测定OD值：M 1 2 3 4 5 本组共提取5个拟南芥样品，1.2和4未出现条带，3和5提出DNA（如图），但颜色不够亮。模板没条带说明提取的DNA量很少或没有提取出来，而且OD值显示1.2和4的A260/A280比值较小，蛋白污染啊严重，3和5的OD值较小，蛋白污染较小。可能存在的原因是： 1.拟南芥未充分研磨，

12、加入液体时发现有大块存在。 2.研磨速度不够快，而且研磨途中没有及时液氮速冻。 3.提取核酸时，没有进行2次抽提蛋白。 4.离心后，吸取上清可能吸取到中间层。 实验(shyn)二 PCR扩增目的(md)片段【实验(shyn)目的】通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。【实验原理】聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。典型的PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNT

13、P、两个合成的DNA引物、耐热DNA聚合酶。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。整个扩增过程分三步： 变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段； 退火，快速降低温度至50-60 后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段； 延伸，溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP)，按53方向复制出互补DNA ，即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一

14、倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25-30个循环后，DNA可扩增106-109倍。PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材PCR热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（0.1-2.5 L）、200 L PCR管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000 L量程各一支）、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、吸头、PE手套和乳胶手套。二、试剂1. 10 缓冲液2. DNA 模板 1 ng/L（以实验一 提取的拟南芥基因组DNA为模板）3. dNTP Mix (Takara)4

15、引物 P3： 5-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3P5： 5-ACT CTA GAT GAG TAA AAC AGA GGA GGG TCT CAC-3引物溶液(rngy)浓度：2 M 5. rTaq 酶 5 U/L6. 低熔点(rngdin)琼脂糖7. 去离子水或TE（pH7.6）【7】【实验(shyn)步骤】 1在200 L PCR 管内配制20 L 反应体系：反应物 体积/LddH2O 11.3 10PCR 缓冲液 2.0dNTP 1.6（终浓度20200 M） 引物1 2.0（引物终浓度0.2 M）引物2 2.0（引物终浓度0.2

16、 M）模板DNA 1.0rTag 酶 0.1 Total 20 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反应成分集于管底。3. PCR反应热循环程序设置： 94 预变性 3 min; 94 变性 30 sec; 64 退火 30 sec; 30 cycles 72 延伸 1 min; 72 延伸 10min; 16 pause反应结束后短暂离心，置4 保存备用。4. 配制1的琼脂糖凝胶。5. 取5 L PCR产物，加1 L的6 loading buffer(上样缓冲液)，轻弹混匀后进行电泳检测。6. 如

17、果PCR产物非常特异，可以直接用于与载体的重组连接。注意事项：1、加样时要精确用移液器。2、检查PCR仪是否热盖。 3、每种试剂弹化后要离心；做MIX时，最后加酶，分装之前要混匀；分装(fn zhun)后需离心混匀。【实验(shyn)结果】 本实验(shyn)扩增片段长652 bp。M 1 2 3 4750bp 如图所示：本组2和3有条带，1和4未出现条带。条带大小在750bp的mark下方，目的条带是2bp，认为PCR结果是目的条带。实验结果分析：模板量太多或者太少均得不到很亮的条带。DNA模板不纯。可能是操作不当，比如MIX没有混匀，PCR产物没有甩一下就直接点样。加酶后，没有弹匀。注意事

18、项：1、加样时要精确用移液器。2、检查PCR仪是否热盖。 3、每种试剂弹化后要离心；做MIX时，最后加酶，分装之前要混匀；分装后需离心混匀。 实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化效率检测【实验目的】 通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。【实验原理】 体外连接(linji)的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行(jnxng)复制、增殖和表达。研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞(xbo)会使细胞易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCl2法。CaCl

19、2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0C、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42C 短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。本实验以E.coli DH5菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，之后通过转化实验检测感受态细胞的转化效率。【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅、超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、-80冰箱、4/-20 冰箱、制冰机、50 mL 离心管、小指管、试管、培养皿、锥形瓶等、玻璃涂棒、镊子、牙签、酒精灯、微量移液器（10、100、1

20、000 L量程各一支）、吸头、1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套。二、药品胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠(NaCl) 、氯化钙(CaCl2) 。三、试剂1. 1 mol / L CaCl2 溶液【8】2. 1 mol / L MgCl2 溶液【9】3. 75% 甘油【10】4. LB 液体培养基【11】【实验步骤】 1. 从大肠杆菌DH5 平板上挑取一个单菌落接于2 mL LB液体培养基的试管中，37 210 rpm 振荡培养过夜。2. 次日，按1:100(V/V)，即取1 mL菌液转接到一个含有100 mL LB液体培养基锥形瓶中，37 振荡培养2-3 hr。（此时，OD 600 0.3

21、-0.5，此为实验成功的关键）。3. 将菌液转移到50 mL冰浴好的离心管中，冰上放置10 min。4. 4 ，3,500 rpm/min，离心10 min，回收细胞。5. 倒出培养液，将管倒置，以便培养液流尽。6. 将菌体重(tzhng)悬于5mL 的MIX, （务必(wb)放冰上）。MIX【12】为1/10体积(tj)的终浓度为20 mM CaCl2 和 80 mM MgCl2的混合溶液中。7. 4 ，3,500 rpm/min，离心10 min，回收细胞。8. 将菌体重悬于1mL的MIX（务必放冰上）。此细胞为感受态细胞。分装为到1.5 mL的离心管中，每份100L。置于-80保存。MI

22、X【13】为1/50体积冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液。 【实验结果】 从大肠杆菌DH5a平板上挑取的单菌落在2mlLB液体培养基的试管里培养，次日OD值为0.311，在要求范围之内，大肠杆菌感受态细胞生长良好。注意事项：1：摇大体积菌液时，一定要严格控制OD 600在0.3到0.5之间。 2：所用到的所有的离心管都要冰浴。 3、MIX、MIX重悬都要在冰上操作。 4、离心时都用4低温离心。实验四 目的片段和载体的连接【实验目的】 通过本实验掌握DNA重组连接方法。【实验原理】外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。DNA重组本质是一个酶促反应过程。

23、即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5端磷酸和3端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。pMD19-T Vector是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体。它含有Amp抗性基因、半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸(肽链)的片断基因，在这段基因中插入一个多克隆位点（DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案），其中有EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T”而成。这款载体含有的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30 min）完成连接反应，连接

24、反应的温度在37 时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度12-16，最多可以连接12-16hr（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。【仪器、材料(cilio)与试剂】 一、仪器(yq)及耗材移液器、吸头、恒温(hngwn)水浴锅、温度计、微量移液器(10、100、1000 L量程各一支)、吸头、0.5 mL/1.5mL离心管或200 L PCR管、PE手套和乳胶手套、制冰机。二、药品及试剂1. pMD-19 T 连接试剂盒（含pMD-19 T载体、连接试剂）2. PCR扩增回收片段。【实验步骤】1. 在灭菌的Ep

25、pendorf 管中，加入：pMD-19 T载体 0.5 L目的PCR片段 4.5 LSolution 5 L共10 L体系，混匀，16 连接30min。DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3-10倍。2. 盖好盖子，用手指轻弹EP管数次，并于台式离心机离心2 sec以集中溶液。3. 将反应管放入16 连接过夜（1216hr）。4. 取出约25 ng的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定连接结果，以未经连接的质粒DNA片段和PCR片段为对照进行电泳检测.【实验结果】 经过37摄氏度24h，处理组生长了很多白色菌落，蓝色菌落较少，且菌落直接较小，白菌落为DNA重组子或为假阳性，需要进一步

26、鉴定。 实验(shyn)五 重组(zhn z)质粒的转化【实验(shyn)目的】 通过本实验，掌握重组质粒的转化方法和原理。【实验原理】 转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基钙磷酸复合物，此复合物粘附于感受态细胞表面。42 短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37 培养过夜形成单克隆。在这个过程中包含两种筛选方法，一种是抗性筛选，一种是蓝白斑筛选。载体中含有

27、耐药基因，可以使转化成功的受体细胞具有抗药性，能够在含有相应药物的琼脂平板上形成单克隆菌落。通过这种方法就可以筛选转化成功的受体细胞。而能进行蓝白筛选是因为载体中有一段大肠杆菌-半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸（肽链）的片断基因。宿主具有编码半乳糖苷酶的C端基因。当二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为互补。在诱导物IPTG（乳糖类似物，不会被-半乳糖苷酶摧化降解）的作用下，由互补形成的具有功能活性的-半乳糖苷酶，可分解培养物中的X-gal（它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和蓝色底物），使其呈蓝色反应 。如果外源基因插入位于LacZ基因内部的多克隆酶切位点中，就会破坏肽

28、链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的-半乳糖苷酶相互补的活性肽链，导致不能编码-半乳糖苷酶，菌落呈正常的白色。而没有插入外源片断的则是蓝色的。因此，按照菌落的颜色就可以确定载体上是否插入了外源基因。【仪器、材料与试剂】一、仪器及耗材超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、恒温水浴器、EP管、培养皿、玻璃涂棒、镊子、牙签、酒精灯、-20冰箱、高压蒸汽灭菌锅、pH计、电子天平冰及冰盒、制冰机。二、试剂胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠（NaCl)、氨苄青霉素、二甲基甲酰胺、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖）、IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）、75%酒精【14】、大肠杆菌DH5感受态

29、细胞、连接产物。【实验步骤】1. 取实验(shyn)三重组质粒10 L加入(jir)100 L感受态细胞(xbo)，混匀（轻弹，感受态很脆弱），冰浴30 min（静置，勿动，确保DNA吸附在感受态细胞表面）。2. 将管放到42 水浴锅中，热激90 sec（准确，防止LB液体进入细胞中）。3. 冰浴2 min（使得感受态细胞膜收缩，磷脂双分子层的运动）。 4. 加500 L LB 液体培养基（在超净台中进行），轻轻混匀。5. 37 温育45 min ，130 rpm慢摇（必须保证前20 min的转速，因为大肠杆菌42 min左右繁殖一代，第一代的细胞较脆弱，防止细胞破碎）。6. 在预制的LB 琼

30、脂平板上，加40 L 20 mg/mL X-gal 【15】和16 L 50 mg/mL IPTG【16】 溶液。7. 用灭菌玻璃棒（酒精灯上烧后冷却）均匀涂布。 8. 37 温箱中放置30 min（使有毒物质挥发）。9. 3,500 rpm，离心2 min。10. 弃约500 L上清，将剩余菌液轻轻吹打混匀涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，晾至液体被吸收。11. 倒置平皿37 培养12-16hr，出现单菌落（培养皿上会长出蓝色和白色菌落，其中白色菌落为含有重组DNA 质粒的菌落）。注意事项：连接结束约3min时取出感受态，插入冰中，尽量避免晃动。连接产物打入感受态中后轻弹混匀。冰浴静置时勿动。

31、热激后要立即放入冰中冰浴。涂IPTG、X-Gal后的LB平板 正放入培养箱，涂菌后倒置。 实验六 菌落的PCR鉴定【实验目的】通过本实验学习菌落PCR的基本原理与实验技术。【实验原理】重组子经过蓝白斑筛选后（具有假阳性），接下来可通过菌落PCR方法对重组子进一步进行快速鉴定。用灭菌后的牙签轻轻粘取白色菌落的部分菌体，在准备好的双蒸水中洗一下，充分混匀，取一定量加入PCR反应体系，在PCR反应循环中，95 加热可以使细菌破裂，释放出重组质粒作为PCR扩增模板。采用外源基因特异性引物进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。【仪器(yq)、材料与试剂】 一、仪器(yq

32、)及耗材PCR热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统(xtng)、移液器（0.1-2.5 L）、200 L PCR管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000 L量程各一支）、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、吸头、PE手套和乳胶手套。二、试剂1. 10 缓冲液2. DNA 模板 （以菌体热解后暴露的DNA为模板）3. dNTP Mix4. 引物 P3： 5-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3P5： 5-ACT CTA GAT GAG TAA AAC AGA GGA GGG TCT

33、CAC-3引物溶液浓度：2 M 5. rTaq 酶 5 U/L6. 去离子水或TE（pH7.6）【实验步骤】 用200 L的移液器头挑取转化平板上白色的单菌落于15 L无菌水中，从中取2 L菌液作为菌落PCR模板。1在200 L PCR 管内配制20 L 反应体系：反应物 体积/LddH2O 10.3 10PCR 缓冲液 2.0dNTP 1.6 引物 2.0 引物2 2.0菌液 2.0rTag 酶 0.1 Total 20 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反应成分集于管底。3. PCR反应(fn

34、yng)热循环程序设置： 94 预变性(binxng) 3 min; 94 变性(binxng) 30 sec; 64 退火 30 sec; 30 cycles 72 延伸 1 min; 72 延伸 3 min; 16 pause反应结束后短暂离心，置4 保存备用。4. 配制1的琼脂糖凝胶。5. 取5 L PCR产物，加1 L的6loading buffer，轻弹混匀后进行电泳检测。【实验结果】 本实验扩增片段长652 bp。注意事项：1、挑菌时，尽量不要挑到培养基，吹打多次混匀。 2、避免剧烈操作。 3、其他注意事项同实验二。【实验结果】625bp750bp M 1 2 3 4 5 本组共做

35、5个菌落PCR，其中3和5出现结果，3的条带较暗。1，2和4没有出现条带，第一个甬道未发现任何核酸存在。试验结果讨论： PCR成功的条带大小与M比，在750bp之下，且俩条条带高度几乎一致，可以认为是目的条带635bp，同时说明重组质粒可能转入成功。而2和4没有出现条带，说明挑取的菌落是假阳性的。第一甬道里没有任何核酸存在，说明在做PCR，没有加入模板。接下来将重新挑取出条带菌落进一步测定。条带颜色较浅的3，可能由于挑取培养基量大，或者是菌落没有吹打开。 实验七 重组质粒DNA的提取及酶切鉴定【实验(shyn)原理】细菌(xjn)质粒是一类双链、闭环的DNA，大小(dxio)范围从1 kb至2

36、00 kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：培养细菌，使质粒DNA大量扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA

37、在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，在这样的条件下，尽管共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿

38、抽提纯化上清液中的质粒DNA。限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。其中类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。 限制性内切酶识别序列长度一般为4-8个呈回文序列的特异核苷酸对。一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。根据酶切

39、反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。本实验以EcoR和Hind III对本实验中提取的重组质粒进行小量酶切鉴定。在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压(goy)灭菌锅、EP管、水浴锅、离心管、移液器、吸头、制冰机、琼脂糖凝胶电泳设备(shbi)、微量移液器（10、100、1000 L量程(lingchng)各一支）1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套。二、试剂1. 质粒提取试剂盒（天根） 2. Spe和Nco I限制性内切核酸酶(Fermentas)3. 内切酶反应缓冲液4. 琼脂糖凝胶电泳相关试剂【实验步骤】 1. 将实验六第一步剩余的13 L菌液接于2 mL 含Amp ( 50 g/mL )的LB液体培养基中37 振荡（225 rpm）培养过夜。2. 取1.5 mL的过夜培养菌液，12,000 rpm离心1 min，弃上清，尽可能除去细菌沉淀里残留的液体培养基。3. 用250 L的P（含RNase A）充分悬浮细菌沉淀。注：注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。4. 加入250 L的P 轻轻地上下翻转混匀6-8次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。注：此步骤不宜超过5 min。