课题2　月季的花药培养 (11)

1、植物组织培养技术菊花组织培养概述一、基础知识1.植物组织培养的基本过程组织培养定义组织培养的发展历程组织培养理论基础全能性组织培养的实际应用2.影响植物组织培养的因素二、实验操作三、结果分析与评价四、课题延伸组织培养定义 组织培养是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养。.组织培养的发展植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术。 它的发展经历了四个发展阶段：（一）萌芽阶段（从20世纪初到30年代中）： 1902年德国植物生理学家Haberlandt (哈勃兰特）提出细胞全能性概念，并首次进行离体细胞培养，但没有成功。 1904

2、年，Hanning （汉宁）最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson（克努森） 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。（二）奠基阶段（从20世纪30年代末到50年代中）： 1934年，White（怀特） 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。 1939年，Gautherete培养胡萝卜根小外植体成功。 1943年，White （怀特）提出了植物细胞“全能性”学说，标志组织培养成为一门新兴学科。1952-1953年：美国科学家Steward F.C. （斯图尔德）用胡萝卜根的细胞悬浮培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完整植抹

3、。证实了植物细胞“全能性”学说。（三）快速发展和应用阶段（从20世纪50年代末到现在） 1960年以来组织培养理论、实践、技术和方法不断完善和发展，并广泛应用于生物学的许多分支学科。 1960年，Cocking（科金）酶解法分离原生质体获得成功，使植物细胞可以象动物细胞一样进行细胞融合。 1960年，Morel（莫雷尔）等人通过对兰花茎尖进行培养，获得了快速繁殖的脱毒兰花，随后在国内外进行了“兰花试管苗产业化”。 1964年，印度学者Guha（古哈）和Maheshwari（马赫施瓦里）成功地培养曼陀罗花药获得单倍体再生植株，从而促进了植物花药培养单倍体育种技术的发展。.植物组织培养的基础理论植

4、物细胞的全能性定义：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。差异：（1） 受精卵的全能性最高； （2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞 的全能性比生殖细胞的低。植物全能性的表达离体的植物器官、组织、细胞 游离单细胞或原生质体胚状体（课本38页）根、芽 愈伤组织 人工种子再生植株 脱分化 再分化培养条件：基本培养基和适宜的植物生长调节物质，适宜的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。按培养方法分为固体培

5、养 液体培养看护培养 微室培养初代培养继代培养按培养过程分为初代培养（外植体最初几代）继代培养（对外植体换新鲜培养液不断分割分离多代培养）植物组织培养应用快速繁殖： 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株，而且均来自一单一的个体，遗传性状一致。例如一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。种苗脱毒：由于病毒的感染严重影响作物的产量和品质，而利用组织培养技术可以有效地除去植物体内的病毒，得到大量的无病毒种苗。主要的方法是培养植物茎尖分生组织，也可以采用热处理或加入化学试剂的方法达到脱毒的效果。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。填表比较根尖分生组织和

6、愈伤组织的异同： 组织类型细胞来源细胞形态细胞结构细胞排列细胞去向根尖分生组织受精卵正方形无液泡紧密分化成多种组织细胞愈伤组织高度分化细胞无定形高度液泡化疏松再分化成新个体相同点都通过有丝分裂进行细胞增殖远缘杂交：利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。tomatopotatopomato泡马豆突变育种：采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种基因工程：基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生 生物制品：有些极其昂贵的生物制品，可以用大规模培养植物细胞来直接生产 种质保存：繁殖量大，省空

7、间，保存时间长2.影响植物组织培养的因素 1、外植体的选取 2、培养基的配制(MS培养基) 3、a、按照不同的顺序使用这两类激素，会得到不同的实验结果： b、当同时使用这两类激素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向： 4、消毒 在培养的整个过程中，都需要是一个无菌环境原因5、pH、温度、光照 菊花：pH=58温度控制在18-22每日光照12h。3.【实验材料及仪器】实验材料：菊花植株的幼芽、叶片、茎段实验器材：高压灭菌锅，超净工作台，电子天 平，酒精灯， 三角瓶，镊子，剪刀， 烧杯实验药品：MS培养基，蔗糖，琼脂，0.1%升 汞，NAA，6-BA，NaOH，HCl， CPPU，TDZ【实验

8、步骤】1.MS培养基母液的配制 按照表1配制MS培养基母液成分母液MS培养基大量元素NH4NO3KNO3CaCl2H2OKH2PO4 MgSO47H2O mg/L(100)165000190000440001700037000mg/L16501900440170370 微量元素mg/L(100)mg/LMnSO44H2OZnSO44H2OH3BO3KINa2MoO42H2OCuSO45H2O CoCl26H2O 223086062083252.52.5 22.38.66.20.830.250.0250.025 铁盐mg/L(100)mg/LNa2EDTA FeSO47H2O37252785 3

9、7.2527.85有机物质mg/L(100)mg/L甘氨酸硫胺素烟酸盐酸吡哆醇 肌醇 200405050100002.00.40.50.5100MS培养基的配制取1000ml烧杯，分别取各种成分的母液100ml，加入烧杯，称取蔗糖30g，琼脂6.5g，按照需要的浓度分别加入各种植物生长调节剂，加水至800ml。加热使琼脂溶解，定容至1000ml，用10NaOH调节pH至5.65.8。培养基的灭菌将配好的培养基迅速分装至50ml三角瓶中，用棉花塞好，用牛皮纸或报纸包扎。放入高压灭菌锅中，121、灭菌20min。植物材料的消毒选取野生外植体材料，用水洗净，用70酒精浸泡15-30s，然后放入0.1

10、的升汞溶液中浸泡1-2min，进行材料消毒，然后用无菌水反复冲洗多次。接种将消毒好的外植体材料在超净工作台中用镊子接种于已灭菌的培养基中，光照下进行培养。【注意事项】1、实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因 染菌导致实验失败；2、配制贮存母液时，要计算好各种成分扩大倍数后逐次加入，在第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。有机成分配好后要装入棕色瓶中在冰箱内保存，其它三种母液可在常温下保存，但最多不能超过一个月；3、pH值对培养基的硬度有影响，pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值；4、材料消毒时不要在酒精中停留过长时间；5、接种后进行培养时，为确保实验成功，可以首先进行7- 10d的暗培养，然后再进行光照培养。三、结果分析与评价 1、对接种操作中污染情况的分析；2、是否完成了对植物组织的脱分化和再分化；3、是否进行了统计、对照与记录；4、生根苗的移栽是否合格。