微生物发酵与发酵工程课件

1、 . 微生物发酵与发酵工程一、 微生物发酵二、发酵工程概述三、应用举例 丙酮丁醇发酵1h一、 微生物发酵发酵(fermentation)没有空气的生活（life without air）- 巴斯德细胞在厌氧条件下代谢营养物获得能量的生化反应微生物生长并进行生物转化的过程2h发酵的目的获得生物量获得目的产物3h发酵的基本流程 保藏菌种 斜面（试管、茄子瓶） 摇瓶（12级） 种子发酵（1级或多级） 主发酵 后处理4h无菌操作接种间辐射灭菌化学灭菌空气过滤发酵罐高压蒸汽灭菌通气系统过滤灭菌TC 发酵温度 t hr连续灭菌间歇灭菌5h发酵过程的噬菌体问题现象：发酵不正常，产量、糖耗、pH、粘度、泡沫等

2、镜检：溶菌现象防治：定期检查设备、管道管件、过滤器等环境药物：鳌合剂、抗生素菌株：抗性菌株、菌株轮换6h发酵过程的主要控制参数温度pH营养溶氧通气量搅拌速度压力7h发酵类型I: 产物是初级能量代谢的结果，一般是糖的直接氧化产物。 A P or A B C P 例：乙醇发酵、乳酸发酵II: 产物通过能量代谢的间接途径得到。 A B C D E P 例：柠檬酸发酵、氨基酸发酵III:产物不是初级代谢形成的，与微生物细胞的物质代谢无关。 例：抗生素发酵8h发酵方式批式(batch)发酵补料流加(fed batch)发酵连续(continous)发酵9h批式发酵的产物形成生长结合型 (growth a

3、ssociated)：产物形成与生长的限制因子相同非生长结合型 (growth unassociated) ： 产物形成速度取决于微生物浓度产物形成速度由与比生长速度无关的其它因素决定，不能用动力学方程描述，但可对具体的发酵过程简化一些条件后建立数学方程 产乳酸发酵： 10h发酵的后处理后处理在发酵工业中的地位： 普通发酵产品，后处理成本 60% 基因工程发酵产品，后处理成本 80%后处理的一般流程： 发酵液 分离细胞 浓缩 粗分离 精分离 制成品后处理工艺的设计原则： 产品的性质 产品的要求 经济 环保 稳定11h细胞的分离与破碎 细胞的分离过滤（压滤、抽滤、膜分离）沉降（重力、离心）絮凝细

4、胞的破碎物理（超声、机械）化学生物12h膜分离微滤（ 0.1 - 10 ）超滤（MW1000 - 100000）13h固态发酵固态发酵：微生物在没有或很少游离水的潮湿固体培养基上生长与代谢的过程特点：投资少、能耗低、原料廉价 传热传质差、效率低应用：生物农药、饲料、粗酶、食品等14h发酵条件的优化确定优化目标 T S P + B + s产率: P ( g/L )转化率: P/(S s ) ( %, g/g )生产强度: P/T ( g/L.h )其他确定影响因素种子：种龄、接种量 培养基：组分、pH、灭菌条件环境：温度、pH、通气、搅拌、压力、设备15h二、发酵工程概述16h（一）发酵工程技术

5、发展及其意义 发酵？生理学角度：微生物的无氧呼吸和有氧呼吸以外的一种生物氧化作用有机化合物既是电子（或氢）供体又是电子（或氢）受体。工业生产角度：利微生物的机能进行物料加工以获得工业产品生产或为社会服务（环境保护）的过程，又称微生物工程。17h 发酵工程的历史过程发酵现象酿造食品工业非食品工业青霉素抗菌素发酵工业氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）基因工程菌动物细胞大规模培养植物细胞大规模培养藻类细胞大规模培养转基因动物18h发酵工业的第一个转折点：非食品工业发酵工业的第二个转折点：青霉素抗菌素发酵工业发酵工业的第三个转折点：切断支路代谢转折点:酶的活力调控,酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏),解

6、除菌体自身的反馈调节,特殊调节控制的利用突变株的应用,前体、终产物、副产物等发酵工业的近代转折点：基因、动物、海洋19h 发酵现象的早期认识1680年制成显微镜 微生物的存在1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精 酶20h 发酵工程的早期阶段 人们的对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。 20世纪初期，1916年英国采用梭状芽孢杆菌生产丙酮丁醇，德国采用亚硫酸盐法生产甘油（第一次世界大战）由食品工业向非食品工业发展21h好氧发酵技术：速酿法从乙醇生产醋酸，通气法大量繁殖酵

7、母，用米曲霉的麸曲代替麦芽糖作糖化剂生产酒靖，用微小毛霉生产干酪。 1933年等人发明了摇瓶培养法代替了传统的静置培养法。生长均匀，增殖时间短。22h 发酵工程的重大转折点 二十世纪四十年代初，第二次世界大战爆发，青霉素的发现，迅速形成工业大规摸生产。1928年由 Fleming发现青霉素 1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究 表面培养：1升扁瓶或锥形瓶，内装200mL麦麸培养基 40u/ml1943年沉浸培养： 5m3 200u/ml当今： 100m3200m3 5-7万u/ml 链霉素、金霉素、新霉索、红霉素23h24h主要的技术进展：通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。抗杂菌

8、污染的纯种培养技术：无菌空气、培养 基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。意义：抗生素工业的发展建立了一套完整的好氧发酵技术，大型搅拌发酵罐培养方法推动了整个发酵工业的深入发展为现代发酵工程奠定了基础25h学科发展与属性 微生物利用工业的迅速发展产生了生化工程学科发酵工程的三大学科基础微生物学、生物化学及生化工程26h现代生物技术分子生物学与发酵工程20世纪50年代：氨基酸发酵工业谷氨酸、赖氨酸核酸发酵工业肌苷酸、乌苷酸微生物变异株通过代谢调节代谢控制发酵技术 切断支路代谢转折点: 酶的活力调控, 酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏) 解除菌体自身的反馈调节,特殊调节控制的利用,

9、突变株的应用,前体、终产物、副产物等27h20世纪70年代 细胞融合技术、基因操作技术等生物技术发展，打破了生物种间障碍，能定向地制造出新的有用的微生物：增加微生物体内控制代谢产物产量的基因拷贝数，可以大幅度地提高目标产物的产量将动、植物或某些微生物特有产物的控制基因植入细 胞中，快速经济地大量生产这些产物将具有不同性能的多种质粒植入，使新菌株在清除污染或以非粮食物质为原料进行发酵生产或环境保护28h人类基因组测序完成的后向功能基因组学转变 功能基因及其表达产物的获得。细胞大规模培养的优化技术对当前生物技术产业以及今后的潜在发展具有重要影响。29h 发 酵 工 程 利用微生物进行产品生产效益与

10、意义抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等医药、轻工、食品、农业、环保等行业基因工程药物、疫苗及抗体产品 化学工程 生物化工 生物加工行业传统生物技术现代生物技术基因工程菌发酵30h（二）发酵过程生产方式31h发酵生产的基本类型 固体发酵 液体发酵 基本操作模式 沙土或冷冻保贮菌株斜面菌种培养菌体或孢子悬浮液制备种子扩大培养发酵发酵液处理提取与精制制剂制造成品检验与包装出厂32h固体发酵 将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支持物（载体）上，通过微生物代谢活动，使发酵原料转化为发酵产品 浅层发酵、转桶发酵和厚层通气发酵优点：设备简单、方法简便、能耗低

11、、原料粗放、不易污染、产物回收耗溶剂少，所生废水少。缺点：占地面积大、劳动强度大、传质传热困难、产率和收率低、副产物多、培养过程质量控制难、不适合一些复杂调控操作发酵33h液体发酵生产 发酵原料制成液体培养基，表面发酵和深层发酵 深层发酵：菌体或菌丝体均匀分散在液体培养基中，通气或不通气优点： 占地面积少，生产规模大； 发酵速度快，生产效率高； 生产机械化，易于自动化控制，劳动生产率高； 发酵设备紧凑，传热传质良好，生产便于管理； 副产物少，有利于产品提取，产品质量高 类型：分批发酵，补料分批发酵，连续发酵34h分批发酵 一次性投入有限数量营养物，灭菌后接种入所要培养的微生物，然后控制适宜的发

12、酵罐条件（温度、通气、搅拌速度、pH等） 非恒态培养，营养成分不断减少，微生物相应生长，产物不断形成35h补料分批发酵 分批发酵中间歇地或连续地补加含有限制性营养物的培养基，到某一定时间产物才从罐内放出。优点： 通过调节在发酵罐中的营养物浓度，可避免代谢调 节中的抑制、阻遏或毒性对生长的抑制； 可避免一次投料过多，造成细胞大量生长，溶解不 足，通气搅拌无法适应； 营养缺陷型菌的营养物量的控制，高效率积累产物； 挥发性物质的低浓度控制；36h半连续（代放）发酵 在补料分批发酵基础上以一定的间隔时间从发酵罐中多次放出一定体积的发酵液，直到发酵终结才全部放出发酵液。优点： 具有补料分批发酵的优点；

13、控制比生长速率使菌体代谢酶体系处于最优； 提高发酵罐的生产能力（发酵指数）； 适合于菌体生长较快的半关联生长的次级代谢产物； 适用于多罐发酵车间的代放安排集中分离提取。37h连续培养 以一定速度向发酵罐内连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产场的培养液以相同速度从发酵罐内放出，发酵罐内液量维持恒定。 经过一定时问培养后，培养物就近似于恒定状态的生长和代谢，这时所有物质（营养物、产物、微生物细胞等）的浓度、环境的物理状态（如pH、DO）以及比生长速率等始终维持不变，即稳定状态。38h特点： 恒定的生理状态（比生长速率恒定），有利于微生 物生理特性和遗传特性的研究-动力学和最适培养条件的研究；

14、 基质在发酵罐中停留时间短，原材料转化率低，只能适用在生长快的微生物菌体； 在长时间培养过程中菌种易变异，有可能产生适应特殊环境的负变异菌株，而且易于染菌。39h 发酵过程的重要环节菌种来源：生产菌的筛选、单菌和混合菌、筛选方案的设计、含微生物材料的选择与预处理、分离培养基、菌种的平板培养（不同温度和时间）、菌落的选择。菌种选育：自然选育、诱变选育、杂交杂育、原生质体融合、基因工程改造、DNA突变技术。培养基成分及来源：碳源、氮源、无机盐及微量元素、前体促进剂和抑制剂；斜面、摇瓶、种子、发酵40h纯种发酵与无菌技术：培养基灭菌、无菌空气、密闭设备与罐压、无污染接种种子扩大培养：一级或多级种子制

15、备、种子质量控制发酵工艺控制：温度、通气量、搅拌、消泡沫、pH、DO、培养基配比、菌丝形态、放罐时间、接种量、其他各种操作发酵罐与计算机控制：通气、搅拌、密闭、各种高级控制41h辅助设备公用系统：空压房、冷冻设备、锅炉房、水系统、污水处理、发电厂原材料仓库与配料间：后提取车间与成品仓库：菌种保存与种子制备实验室：中间分析实验室：42h发酵车间设计工艺流程：菌种、种子培养、发酵、控制条件（温度、时间、）、技术水平设备平衡：生产能力、经济指标、技术指标、设备平衡计算43h车间设计：平面与立面布置、管路设针厂区设计：风向、绿化、人流与物流、生活区与工厂区人员岗位与运行管理设计：基建及施工设计：44h

16、（三）发酵工程研究的主要现状和问题提高产品的市场竞争能力，降低成本，提高产品质量： 控制不同的操作条件时，有完全不同的产量和质量结果 优化 从小罐放大到生产罐，有很大差异，可能要失败 放大45h 菌种选育 基因工程菌的构建 忽视了生物反应器中工程问题所必须加以考虑的工艺变化和过程优化。 采用人工经验为主的静态操作背景46h 过程优化发酵过程计算机控制 传感器：DO、pH、排气成份分析系统 计算机控制系统：单片智能、工控机、pLC 、 DCS 执行器件：杯式补料系统参数自动控制回路温度自动控制；通气流量自动控制；罐压自动控制pH调节（手控或自控）；DO与转速、通气流量程序串级调节 背景47h 发

17、酵工程控制 “内部控制”：如何改变细胞的遗传组成和“发酵工程控制” 细胞的代谢生理特性 “外部控制”：物理和化学环境条件控制外部控制是基于内部控制调节，但是在研究和过渡的方法上又是不同的。 48h 生化工程所面临的任务 就是在已提供高产菌株的基础上，如何把这些高产菌种在培养过程中进一步考察它的生理生化特性，稳定或改进微生物反应工艺过程，这里不仅要求对生物物性的动态有详尽的了解，对生化反应做定量的和动力学方面的考察，还需具有工程学的技巧，才能充分发掘和利用生物体系的潜力。49h另一方面，计算机技术的高度发展也在客观上为分析和优化控制这种复杂的发酵过程提供基础，因此，借助于计算机系统对发酵过程进行

18、数据处理，分析和控制就愈来愈成为人们的迫切要求。50h生理生化特性微生物生长和反应过程研究 微生物的生长反应特性是发酵过程优化的最重要的出发点。 基质进入细胞、胞内反应、代谢产物的胞内外分泌等全过程进行分析 胞内反应中分解代谢、合成代谢和大分子物质合成之间的物质和能量的关系51h发酵过程的化学计量学和热力学研究 经过1000多步胞内反应才能转化为代谢产物和细胞成分，一般把细胞看作一个开放的黑箱系统 化学计量学主要研究有关发酵过程中反应组分组成变化的规律，把生物反应器中微生物细胞活动用化学元素的平衡式来表示 52h热力学研究只强调系统的起始态和终止态，给出反应可能进行到的最大程度。在发酵工程中常

19、以得率系数概念Yi/j对各种基质形成菌体或产物的潜力进行评价53h微生物反应动力学与生物反应工程 微生物反应动力学是发酵过程优化研究的核心内容，主要研究生物反应的速率及其影响因素 通过基质消耗、细胞生长和产物形成的数学描述，反映微生物系统的状态特征 54h提出了许多数学模型：经验模型、机理模型；统计模型和非统计模型；结构模型和非结构模型 实际发酵过程是在生物反应器中进行，这就是宏观动力学研究，逐渐发展成生物反应工程55h 数学模型静态和动态优化系统识别自适应控制专家系统、模糊控制、神经元网络各种混沌现象的研究 实际工厂生产 效果不明显背景56h现代控制理论的应用数学模型静态和动态优化系统识别自

20、适应控制专家系统、模糊控制、神经元网络各种混沌现象的研究 实际工厂生产 效果不明显57h过程放大因次分析法经验法则法数学模拟法时间常数法几何相似流体运动学相似流体动力学相似 同时满足这些相似条件是不可能的 当在小试研究时某一个对生产产生影响的重要因素设有被观察到，而这个因素恰恰在放大时成为关键因子时，就会造成整个发酵过程的失败。 背景58h微生物学生物化学分子生物学发酵工艺学化学工程现代控制理论各种工程开发参数检测(自动或手工检测)综合性研究：定性和定量的措述工业生产生化工程传感器与计算机数据处理作为一个独立的技术领域被人们重视在线计算机多学科发展与综合59h仍旧局限于寻求培养基配方和最佳的温

21、度、pH、 DO等缺乏微观的实时的代谢调控代谢调控研究代谢工程研究发酵过程酶学研究的困难过程数据采集和处理的困难发酵工艺优化研究的基本思路发酵罐60h测量参数及其变化的意义缺乏理解最佳工艺控制点为依据的静态操作方法，只是化学工程宏观动力学概念在发酵工程上的简单延伸，缺乏以细胞代谢流分析与控制为核心的研究内容背景和原理61h发酵过程优化与放大仍是一个令人困惑的问题？ 对于活体细胞调控来说，采用传统的生物学方法或化学工程的调控方法，存在很大的问题，国内外都没有很好解决。背景62h三、发酵举例制造微生物生物量PHB发酵黄原胶发酵二元酸发酵丙酮酸发酵乙醇发酵Vc发酵63h制造微生物生物量单细胞蛋白 假

22、丝酵母(Candida sp.)等面包酵母 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)微生物肥料 根瘤菌(Rizobium sp.)微生物农药 苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)三次采油 解烃棒杆菌(C.hydrocarboclastus) 等环境治理 芽孢杆菌(Bacillus sp.)等卡介苗 无毒结核分枝菌(Mycobacterium tuberculosis)64hPHB发酵 (glycolysis)Glucose pyruvate acetyl-CoA TCA 3-ketothiolase acetate acetoacetyl-CoA re

23、ductase R-(-)-3-hydroxybutyryl-CoA PHA synthesis 氮源限制 PHB65h黄原胶发酵野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）产生的胞外多糖，发酵液粘度可达7000cp非牛顿型发酵66h二元酸发酵CH3(CH2)nCH3 -oxidationCH3(CH2)nCOOH CH3(CH2)n-2COOH -oxidationHOOC(CH2)nCOOH水、油、气、固多相反应-氧化与 -氧化67h丙酮酸发酵 Glu Lat Pyr EtOH TCA营养（维生素、氨基酸）限制溶氧控制68h乙醇发酵产物抑制问题原料成本问题69hVc二步法

24、发酵 弱氧化醋杆菌 “大、小”菌混合山梨醇 山梨糖 2-酮基-L-古龙酸70h丙酮丁醇发酵丙酮丁醇是良好的有机溶剂机合成工业的重要原料。 1861年巴斯德发现细菌能产生丁醇。1866年英国最早用丁二烯作为合成橡胶的原料加速了丙酮丁醇工业的商品化生产。19081911年汽车工业需要橡胶，制造人造橡胶的丙酮丁醇需要量大增。1914年Chain Weizmann分离到丙酮丁醇菌， 丙酮丁醇产量提高4倍，使该行业开始进入工业发酵生产阶段。71h1916年在第一次世界大战期间，丙酮用于制造无烟火药，需量剧增，于是着手研究发酵法生产的改进，直到1930年完成生产工艺。发酵法生产丙酮丁醇一直是当时的主要方法

25、。1960年后，由于以石油为原料的化学合成丙酮丁醇更经济，美国和其它一些国家相继停止了发酵生产。我国现在是两种方法并用。72h一、 丙酮丁醇的生产方法 (一)合成法 例如，用稀酒精催化制丙酮，用石油气中的丙烯制成异丙醇，再经氧化脱氢制丙酮；用丙烯与苯制成异丙苯，再氧化制丙酮及苯酚。丁醇的合成有乙醛缩合加氢、丙烯羧化加氢和乙醇直接合成丁醇等。（如下式）73h74h(二)发酵法 和酒精发酵样，以淀粉质、纸浆废液、糖蜜和野生植物等为原料，利用丙酮丁醇菌所分泌的酶来分解淀粉成糖类再经过复杂的生物化学变化，生成丙酮、丁醇和乙醇等产物，同时还产生大量的CO2棚H2等副产品。75h二、 淀粉质原料的丙酮丁醇

26、发酵丙酮丁醇菌在广义上属于丁酸菌族。丁酸菌是嫌气性的，有鞭毛，能运动的杆菌在产生孢子时成为纺锤状或鼓槌状。细胞内含有淀粉拉，能被碘液染成深蓝色。丙酮丁醇菌除具有丁酸菌的通性外，还具有能发酵产生丙酮、丁醇等中性产品的能力。76h在中性培养基中发酵时，一般丁酸菌和丙酮菌均能产生丁酸和醛酸、当培养基的酸度增加到一定数值后，一般丁酸菌即停止发酵，并且菌体的繁殖也停止但是丙醇丁醇菌则不然，当培养基的酸度达到最高点后，由于有脱羧能力，酸度反而下降，并且产生中性的产品-丙酮、丁醇、乙醇等(图31)。77h78h由于丙酮丁醇菌的上述持性，为区别于般丁酸菌，将能引起丙酮、丁醇发酵的细菌命名为丙酮丁醇菌。几种与丙

27、酮丁醇茵类似的梭菌简述如表31。 79h80h(1)丙酮丁梭菌：能发酵玉米、马铃薯等淀粉质原料和蔗糖等糖质原料而产生溶剂，CO2，H2和少量有机酸。溶剂的比例为：6份丁醇3份丙酮：1份乙醇，即B：A：E6:3:1，不同的变异株有不同的比例数。发酵温度为35-36用玉米发酵时玉米浓度为5一8，用马铃薯时，发酵醪中鲜马铃薯量为20，在4860 h就可以发酵结束。81h二、 淀粉质原料生产丙酮丁醇的流程82h三、种母的培养与制备(一) 丙酮丁醇菌的分离与纯化方法在土壤、细泥、粪便中及新鲜果实、蔬菜的表面上均有丙酮丁醇菌存在。利用它的孢子的嫌气性和耐热性，可以采用热淘汰法和单细胞分离法以获得优良的菌种

28、。由于丙酮、丁醇发酵时，易受杂菌侵染而导致酸败所以，丙酮丁醇工厂须经常进行菌种的分离与纯化工作，以保证正常生产。 83h所谓热淘汰法，即将含有丙酮丁醇菌的试样接入5的玉米醪试管内再放在沸水浴中1-15min，杀死不耐热的杂菌和热抵抗力较差的孢子，而保留对热抵抗力较强的丙酮丁醇菌孢子，然后在爆气状态下培养。培养液产生大量气体，这时可转接到新鲜培养基试管内，同法进行热淘汰和嫌气培养，如此反复多次，即可获得较好的菌株。84h欲获得纯培养或者需从发酵醪中选取优良菌株，可用嫌气平板进行单菌落分离。如用有明胶或碳酸钙的培养基，则可能出现溶解圈。然后接入玉米醪中测定气体产生量和丙酮产量。获得的优良菌种用沙土

29、管保存。85h1 试管菌种的培养：选取优良菌种的砂土孢子12g，接入10 m l 5浓度的玉米醪中，并将此管在100 C沸水中热处理12 min，急速冷却至37然后置于真空干燥器内进行培养(2666 Pa以下温度保持在3739 )。 86h2种母瓶培养：将一支试管菌种接种到盛有5浓度的玉米醪液的种母瓶中，在常压下培养24h，即可接入第一种母瓶。一船丙酮丁醇菌孢子萌发时，要求嫌气条件较高，营养体繁殖时，由于本身产生的H2和CO2已能满足嫌气条件。87h3第一种母罐：其中盛有6浓度的玉米醪接入种母瓶的醪液培养12一15h后，即可按入第二种母罐。 4第二种母罐：其中盛有8浓度的玉米酵，接入第一种母罐

30、酵液，培养20 h左右，然后将总量l3一12送入发酵罐。 制备种醪的方法有间歇调制种醪法，半连续调制种酵法，利用部分发酵醪制种醪法。88h四、发酵(一)发酵醪制备 目前国内都以8玉米粉作发酵酵。原料经粉碎蒸煮即可。蒸煮发酵醪时常加入一定量的废醪(10-25%)，这不仅增加部分营养，而且降低粘度。蒸煮过程也是灭菌过程，因而蒸煮多以高温连续蒸煮为主(方法同酒精发酵)然后冷却进入发酵罐，制备好的种醪也从种母罐同时流入发酵罐。89h(二)发酵过程生化变化 发酵过程通常经过三个阶段，即前发酵期、主发酵期和后发酵期，整个发酵过程经40一72h结束。1前发酵期：主要为种菌繁殖期。细胞数激增，酸度增加，所以又

31、称为增酸期，由于丙酮丁醇菌细胞活动的结果，也产生少量的溶剂，主要的发酵产品为醛酸、丁酸、氢气、二氧化碳等。90h此时淀粉的消耗量为30左右，丙酮丁醇菌和其它细菌不同，它所需的诱发期很短，很快即可增殖，通常前发酵期为开始发酵后的1518h。2主发酵期：丙酮丁醇菌已能旺盛发挥它的发酵特性，将前一阶段产生的醋酸、丁酸等变为丙酮、丁醇等溶剂的阶段 91h在此阶段气体发生量达到最高蜂，溶剂生成很快，酸度下降至原有酸度的12左右，所以又称减酸期，此时期在1840 h后。92h3后发酵期：酸度达最低后，又稍为上升，维持定水平至发酵结束，所以又称酸度复升期。此时所积聚的酸主要为不挥发酸，挥发酸量和溶剂也稍有增

32、加，但是由于丙酮丁醇菌在此时期开始自溶，以及部分丙酮丁醇菌产生孢子所以活动的丙酮丁醇菌逐渐减少，发酵逐渐衰弱以至结束。此时期在40一70 h。 93h(三)发酵的方法有间歇发酵法(包括一次加料法、分次流加法)串联式发酵法相连续发酵法，目前多采用串联法和连续发酵法。94h(四)影响发酵的主要因素 1温度：最适发育温度为3637 。正常生长时期最高温度为40 左右，有试验表明，当发酵温度增高时溶剂产量降低，残余糖量增加。 95h2培养基的PH值：培养基中性时，丙酮丁醇菌具有使淀粉发酵成丁酸、醋酸等的能力，而使pH下降，而在酸性培养基中具有将醋酸、丁酸变为丙酮丁醇的能力，丙酮丁醇菌繁殖的最适pH值为

33、5.57.0。96h3培养基的氧化还原值：丙酮丁醇菌是嫌气菌。氧对它有毒害作用。嫌气条件不仅和氧有关，而且更和培养基的氧化还原值有关。通常rH279能正常发酵，当rH2向氧化方面变动为102时则不能进入第二阶段发酵；当rH2再大时，菌种不仅不能发育而且逐渐死亡。97h当PH低于4或高于8时，细菌的繁殖完全停止，不同的生长阶段有所不同，第一阶段pH值可以较高，如果开始pH过低，丙酮丁醇菌会生长不良，在发酵第二阶段，最适PH值下降为4353较适合。98h丙酮丁醇菌因为发酵时能产生氢气、CO2，所以，只要开始发酵时能建立嫌气状态，以后则由于培养基继续为放出的氢和CO2所饱和，就能阻止空气中氧气入内，

34、并且醪液是胶状物，培养基的粘度和固体颗粒对造成嫌气条件也有帮助。 99h4醪液与发酵产物浓度：丙酮丁醇菌虽然能产生丙酮丁醇，但如果醪液中丙酮丁醇量过高时，对菌本身有毒害。所以丙酮丁醇发酵时所采用的醪液浓度般为8一10。100h在发酵醪内溶剂的最高浓度只能达到25g/L(25)。其中包括丙酮0.85丁醇1.5，乙醇0.15。发酵醪中丁醇量如超过15，对丙酮丁醇菌则有抑制作用因此丙酮丁醇发酵时，醪液的浓度需要配合菌种能忍耐溶剂的浓度来决定。 其它如发酵时产生的糠醛，原料中的单宁等对发酵都有一定影响。101h三、 如何提高溶剂产量 为了增强发酵法的竞争力，提高溶剂产量是根本任务。 1菌种选育。由于菌本身受溶剂的影响很大，特别是丁醇的浓度，在发酵液中一般达到1% 时，即为致命的水平(丙酮的毒性较低，一般菌能耐2.9的浓度)因此，溶剂产量的高低往往与菌株对丁醇的耐力有关。 102h在丁醇的存在下，采用常规的诱变手段(如亚硝基胍)，可以获得