常见病原菌采样分离过程

1、金黄色葡萄球菌采样分离过程1、样本采集及初步分离（1）奶样的采集：采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳， 以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后LH、 右前RF、右后RH编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带 回。（2）乳房皮肤拭子用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话 先檫掉土。拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。（3）鼻腔拭子用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入 冰盒中，迅速

2、带回实验室处理。菌种的初步分离首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37r， 16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（BHI）肉汤35r培养18 小时左右。需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察， 因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。2、菌种的保存2mL灭菌离心管中加入400gL新鲜菌液+200gL60%灭菌甘油，-80 C （长期）或-20 C （临时）冻存。3、菌种的复苏如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂 平板上划

3、线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。肠球菌采样分离过程1、样本采集及初步分离（1）肛门拭子以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米 深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速 带回实验室处理。（2）泄殖腔拭子以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式 插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应 放于低温环境中迅速带回实验室处理。首次分离时，将样品在6.5%NaCl营养肉汤中，45C，18-24小时预增菌进行选择性培养 后，将上述培养物

4、以划线方式接种在肠球菌选择性培养基（叠氮钠结晶紫-七叶苷培养基， BEA）上，37C，培养18-24小时，从选择性培养基上挑取灰色，半透明，1-2mm大小的单 菌落，用脑心浸液（BHI）肉汤37C培养18小时左右。2、菌种的保存2mL灭菌离心管中加入400gL新鲜菌液+200gL60%灭菌甘油，-80 C （长期）或-20 C （临时）冻存。3、菌种的复苏如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在BEA琼脂平板上划线培养， 或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。需要注意的是由于BEA琼脂颜色的变化导致假阳性的发生，因此，可以将肠球菌疑似 菌株在BEA琼脂上进行二次筛选，提高分离准确

5、率。大肠杆菌采样分离过程1、样本采集及初步分离肛门拭子以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米 深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速 带回实验室处理。泄殖腔拭子以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式 插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应 放于低温环境中迅速带回实验室处理。首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉大肠杆菌显色平板上涂布接种，37，16-18 小时培养后，从显色平板上挑取蓝色的单菌落，用营养肉汤37C培养18小时左右。2、

6、菌种的保存2mL灭菌离心管中加入400gL新鲜菌液+200gL60%灭菌甘油，-80 C (长期)或-20 C (临时)冻存。3、菌种的复苏如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在琼脂平板上划线培养，或者 将保种的菌液直接接入液体培养基培养。沙门氏菌采样分离过程1、样本采集及初步分离肛门拭子以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米 深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速 带回实验室处理。泄殖腔拭子以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式 插入泄殖腔2-3厘米深，取出后

7、放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应 放于低温环境中迅速带回实验室处理。需要注意的是成年动物沙门氏菌携带率非常低，因此对于沙门氏菌的采集应以弱雏为主 要分离对象来提高分离率。首次分离时，将样品在$。肉汤(亚硒酸盐-半胱氨酸肉汤)中，37C，18-24小时预增菌 进行选择性培养后，将上述培养物以划线方式接种在沙门氏菌选择性培养基上，37C，培养 18-24小时，从选择性培养基上挑取紫色的单菌落，用脑心浸液(BHI)肉汤37C培养18小时 左右。2、菌种的保存2mL灭菌离心管中加入400gL新鲜菌液+200gL60%灭菌甘油，-80 C (长期)或-20 C (临时)冻存。3、菌种

8、的复苏如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在BEA琼脂平板上划线培养， 或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。弯曲杆菌采样分离过程2、样本采集及初步分离肛门拭子以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米 深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速 带回实验室处理。泄殖腔拭子以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式 插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应 放于低温环境中迅速带回实验室处理。需要注意的是因此对于弯曲杆菌的采集应以成

9、年鸡（大于20日龄）为主要分离对象来 提高分离率，因为小于20日龄的鸡无法检测到弯曲杆菌。首次分离时，用接种环直接勾取样品（盲肠内容物或粪便）在弯曲杆菌选择性培养基 （skirrow培养基，由sigma公司生产加5%无菌脱纤绵羊全血及配套增补剂）平板划线接种， 42 C，培养48h，初次分离有时可培养至72h。从选择性培养基上挑取不溶血，灰黄色或灰白 色，圆形凸起，边缘整齐，1-2mm大小，透明成水泡状的单菌落，直接在含有5%羊血的血 琼脂培养基或哥伦比亚血琼脂培养基上进行进一步纯化。2、菌种的保存2mL灭菌离心管中加入400gL的BHI肉汤+200gL60%灭菌甘油，将血琼脂上的纯培养 物直

10、接用灭菌棉棒刮取到上述制备好的甘油肉汤中，-80 C长期冻存。3、菌种的复苏如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在血琼脂平板或MH琼脂上 划线培养。需要注意的是初次分离弯曲菌时，粪便样品要直接接种在弯曲菌选择性培养基中，不能 增菌。为了提高分离率，可以采用Skirrow （42C ）和CCDA培养基（37C）（含有木炭-头孢 哌酮-两性霉素B选择性培养基）同时接种的方法。同时，弯曲菌在液体培养基中生长不良， 保存菌种最好不要用液体培养基进行培养保种。牛乳样品中常见病原菌采样分离过程1、隐性乳房炎检测一乳汁体细胞间接计数法隐性乳房炎快速诊断液弃去前几把乳，再将乳分别挤在盘中；诊断盘

11、倾斜45度，弃去多余乳汁，诊断盘中各皿 中再约留2毫升乳样。每个样品加2毫升诊断液，使诊断盘做水平同心圆摇动，上下倾斜摇动 50秒作判定。判定标准：“-”020万/mL，均质，流动无异常，黄绿色或稍有绿色；“土”2050万/mL，薄絮，稍有绿色，可疑；“ + ”50150万/mL，明显絮状，黄绿色，隐性乳房炎；“+” 150500万/mL，黏稠挂底，黄绿色；+” 500万/mL，胶冻样，深绿色。3、乳样采集消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样1-5ml，编 好编号，4个乳区按：左前LF、左后LH、右前RF、右后RH编号，采集后尽快返回实 验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。将10-20pL乳样涂布于血琼脂培养基上，37C培养18-24h后，挑取血琼脂培养基上各种不 同菌落形态的单一菌落，直接在不同选择性培