高效液相色谱法简介课件

1、高效液相色谱法（high performance liquid chromatographyHPLC）2022/7/301分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%一、HPLC 与GC的比较主要差别：分析对象的差别和流动相的差别2022/7/302流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体流动相与

2、组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性2022/7/30(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。2022/7/30四、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素1. 涡流扩散项HeHe2dp参数气体液体扩散系数 Dm/cm2.s-1密度 /g.cm-3粘度/g(cm.s)-110-110-510-3110-410-22022/7/

3、30第一节 高效液相色谱仪2022/7/30液相色谱仪（2）2022/7/30液相色谱仪（3）2022/7/30液相色谱仪（4）2022/7/302022/7/30流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.流程2022/7/302.主要部件高压输液系统：一般由贮液器、高压泵、脱气、梯度洗脱装置高压泵为主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2022/7/30(2) 进

4、样装置 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：2022/7/30(3) 高效分离柱色谱柱是高效液相色谱仪的心脏，要求分离度高、柱容量大、分析速度快，高性能的色谱柱与固定相本身性能、柱结构、装填和使用技术有关。柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。标准柱型：内径4.6或3.9mm，长度为15-30cm不锈钢柱，填料5-10 mm，柱效7000-10000塔板数。2022/7/30(4) 检测系统 a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（

5、1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 2022/7/30b. 光电二极管阵列检测器(PDAD,photodiode array detector ) 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，能快速同时检测从200900nm范围的全谱信息。计算机快速处理，三维立体谱图。2022/7/30c. 示差折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；特点：

6、 通用型检测器； 灵敏度低；对温度敏感；不能用于梯度洗脱 2022/7/30示差折光检测器2022/7/30d. 荧光检测器（fluorescence detector）特点：选择性检测器；高灵敏度、高选择性； 适用对象：对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；2022/7/30通用型检测器，用于检测挥发性低于流动相的任何样品。可用于梯度洗脱对温度变化不敏感f. 蒸发激光光散射检测器（ELSD, Evaporation Laser scatter detector）2022/7/30质谱检测器（mass spectroscopy）h. 电化学检测器

7、：电导检测器、安培检测器等2022/7/30（一）、 液-固吸附色谱 固定相：固体吸附剂，如极性的硅胶和氧化铝，非极性的 苯乙烯-二乙烯苯基共聚物和石墨化炭黑微球，较常使用的是510m的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；第三节、 高效液相色谱法的主要类型选择2022/7/30 1. 环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.

8、5mm(内径) 检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。2022/7/30（二）、 液-液分配色谱liquid- liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 正相色谱：固定相-亲水性填料；流动相-疏水性溶剂或混合物 反向色谱：固定相-疏水性填料；流动相-亲水性溶剂或混合物 正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱,ODS），氰基柱（正相）。2

9、022/7/30（3）化学键合固定相 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： SiC d. 硅氮键型： SiN2022/7/302022/7/302. 稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器2022/7/30（三）、 离子交换色谱ion-exchange chromatogr

10、aphy 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。2022/7/30（四）、 离子色谱（ion chromatography， IC）固定相： 离子交换树脂流动相：电解质溶液检测器：电

11、导检测器R-OH- +Na+Br -交换洗脱R-Br - +Na+OH -R-H +Na+OH -RNa + +H2O R-H +Na+Br -RNa + +HBr 抑制柱上的反应分离柱：2022/7/30离子色谱的优点（1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；（2）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱2022/7/303、离子色谱的应用 阴离子分析: 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm), 流动相：0.003molL-1 N

12、aHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。 七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。2022/7/30（五）、 离子对色谱ion pair chromatography 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或

13、乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。2022/7/302022/7/302022/7/30（六）、 排阻色谱色谱size- exclusion chromatography 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 组分全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 2022/7/302022/7/30（七）、 亲和色谱(AC) Affinit

14、y chromatography 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。2022/7/30二、分离类型选择 choice of separation types2022/7/30根据相对分子量选择分子量十分低的，挥发性好的样品，一般用气相色谱；标准液相色谱类型（液固吸附色谱、液液分配色谱、离子交换色谱、离子色谱、离子对色谱）最适合的相对分子量范围是200-2000；分子量大于20

15、00的，用排阻色谱。2022/7/30根据溶解度选择样品溶解与水且属于能离解物质：离子色谱、离子交换色谱、离子对色谱样品可溶于烃类（苯或异辛烷）：液固吸附色谱样品溶解于四氯化碳：常规的分配和吸附色谱样品溶于水和异丙醇：常采用反相液液分配色谱2022/7/30根据分子结构选择异构体的分离：液固吸附色谱不同官能团的化合物、同系物的分离：液液分配色谱能离解的化合物：高分子聚合物：尺寸排阻色谱2022/7/30第四节 HPLC的应用 生物化学和生物工程医药领域食品卫生环境检测精细化工高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚

16、物、染料及药物等物质的分离和分析。2022/7/302022/7/302022/7/302022/7/302022/7/30医药研究方面的应用2022/7/30食品分析中的应用糖类酸类物质维生素类合成色素食品污染物2022/7/302022/7/302022/7/302022/7/302022/7/302022/7/302022/7/302022/7/302022/7/302022/7/302022/7/303.9 制备型液相色谱 制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备柱：内径2050mm，柱长50cm。2022/7/30液相制备色谱 pre

17、parative liquid chromatography 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。 半制备柱（内径8mm，长度15 30cm），一次制备量.1mg；1.色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。2022/7/302. 液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率； （2）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制

18、备。 2022/7/30高效液相色谱实验技术 一、色谱柱的保养 二、色谱柱的再生 三、实验前准备工作 四、样品处理技术 2022/7/30色谱柱的保养 在正常情况下，色谱柱至少可以使用36个月，能完成数百次以上的分离。但是，若操作不慎，将使色谱柱很易损坏而不能使用。因此为了保持柱效、柱容量及渗透性，必须对色谱柱进行仔细地保养。 2022/7/30 1、色谱柱极易被微小的颗粒杂质培塞，使操作压力速升高而无法使用，因此必须将流动相仔细地蒸馏或用0.45m孔径的滤膜过滤。在流动相组贮槽与色谱柱间，安装0.45m孔径的过滤器。在柱子上端接头处装上多孔过滤片，以防止固体颗粒进入色谱柱中。在水溶液流动相中

19、，细菌容易生长，可能堵塞筛板加入0.01NaOH能防止能防止细菌生长。2022/7/30 2、最好使用进祥阀进样，以防止注射器进样时、注射隔膜碎屑堵塞柱子入口。 2022/7/30 3、对硅胶基键合相填科，水溶液流动相的pH值不得超出285的范围，使温度不宜过高。柱子在酸性或碱性条件下使用之后，应依次用水、甲醇清洗，对暂时不用而需要较长时间保存的柱子，要用纯甲清洗，柱子两端用金属螺帽封闭，保存于干净的有机溶剂中。 2022/7/30 4、要防止色谱柱被振动或撞击，否则柱内填料床层产生裂缝和空隙，会使色谱峰出现“驼峰”或“对峰”。 5、要防止流动相逆向流动，否则将使固定相层位移，柱效下降。 20

20、22/7/30 6、使用保护柱。连续注射含有未被洗脱样品时，会使柱效下降，保留值改变。为了延长柱寿命，在进样阀和分析柱间加上保护柱，其长度一般为35cm，填充与分析柱性质相似的表面多孔型固定相，因此可干法填装。而且价廉、更换容易。实验表明，使用保护柱后，除了使扩为零的组分的塔板数减少外，其柱效下降很少。2022/7/30色谱柱的再生 一般情况下，硅胶和ODS等化学键合固定相再生是困难的。有时，采用下述方法可能提高柱效。 2022/7/30 1、由于杂质微粒等因素，使柱上端固定相变色，柱效下降。这时，可仔细地将变色部分除去(约3mm左右)，再补充新的固定相。 2、当色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效

21、将明显下降，可选择合适的溶剂进行洗净。 2022/7/30 3、对离子交换树脂柱，先经1molL HCI相1mol NaOH溶液洗净，再以12mol/L NaCl水溶液平衡，以超声波发生器进行清洗，通常可获良好的效果。 4、当采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再生。2022/7/30实验前准备工作 1流动相溶剂的处理 2试样溶液的制备 2022/7/30流动相溶剂的处理 (1) 水 将一般的蒸馏水，加入少许高锰酸钾，在pH910的条件蒸馏，可用于常规洗脱。用于梯度洗脱的水，应进行二次蒸馏。 2022/7/30(2) 有机溶剂的提纯 通常用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。将溶剂通过氧化铝或硅胶柱可除去极性化合物。氯仿中含有的少量甲醇，可先经水洗再经蒸馏提纯。试剂级的四氢呋喃由于含抗氧剂丁基甲苯酚而强烈吸收紫外线，可经蒸馏除去难挥发的丁基甲苯酚。为了防止爆炸，蒸馏终止时，在蒸馏瓶中必须剩余一定量的液体。2022/7/30(3) 溶剂的过滤和脱气 流动相溶剂在使用前必须先用0.45