药物分析学：第十六章 抗生素类药物的分析

1、第十六章抗生素类药物的分析Antibiotics 生物在其生命活动中产生的，能在低微浓度下有选择性的抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称 WHO推荐的抗生素院内使用率为30%，英美发达国家的使用率仅为22%25%，但WHO检测报告显示，我国住院患者的抗生素使用率高达80%，其中广谱抗生素和联合使用的占到58%，且半数以上为多种抗生素合用，在住院的感染病患者中，耐药菌感染的病死率为11.7%，普通感染的病死率只有5.4%。 新华社消息称，截至2007年底，我国听力语言残疾人数达2000多万人，其中，儿童患者约为200万人 。造成儿童耳聋的主要原因是：药物中毒 、病毒感染、遗传、出生时的缺氧以及

2、噪声刺激等。而在药物中毒这一成因中，抗生素使用不当已经成为致聋的罪魁祸首。发达国家不合理使用抗生素造成耳聋的比例不到1%，中国听力残疾中60%到80%的致聋原因与使用抗生素有关 2013年中国抗生素使用量惊人，一年使用16.2万吨抗生素，约占世界用量的一半，其中52%为兽用，48%为人用，超过5万吨抗生素被排放进入水土环境中。 中国河流总体抗生素浓度较高，测量浓度最高达7560纳克/升，平均也有303纳克/升，意大利仅为9纳克/升，美国为120纳克/升，德国20纳克/升。 大多数抗生素是细菌、放线菌和真菌等微生物的代谢产物。生物合成（发酵）化学合成或半合成抗生素的来源多粘菌素45%链霉菌类青霉

3、素青霉素（丝状菌）三级发酵工艺流程 冷冻管（25，孢子培养，7天）斜面母瓶（25 ，孢子培养，7天）大米孢子（26 ，种子培养56h）一级种子培养液（27 ，种子培养，24h）二级种子培养液（2726,发酵,7天） 发酵液 抗生素质量的复杂性 3.产品稳定性差2.生产工艺复杂，活性组分易发生变异 发酵过程不易控制易受污染:无机盐、各种降解产物、色素、热原、毒性物质1.化学纯度较低同系物多、异构体多、降解物多 分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用抗生素药物的分类1.根据来源2.根据作用对象3.根据作用机制细菌-杆菌肽（地衣芽孢杆菌） 真菌-青霉素（青霉菌）放线菌-红霉素（暗红产

4、色链霉菌）植物-黄连素抗G+抗生素:如青霉素和头孢菌素。抗G-抗生素:如利福平 。广谱抗生素:如四环类抗菌素和氯霉素。抗真菌抗生素:如制霉菌素。抗原虫抗生素:如甲硝唑.抗癌抗生素:如阿霉素抗病毒抗生素:如植物抗生素板蓝根，广谱抗生素中氯霉素和四环类抗生素 。抑制细胞壁合成：青霉素抑制细胞膜功能：多粘菌素 抑制蛋白质合成：链霉素、庆大霉素、红霉素 抑制细胞核酸：丝裂霉素 4.根据化学结构(1) -内酰胺类抗生素:主要有青霉素，头孢菌素，单环-内酰胺抗生素、青霉烯类和碳青霉烯类抗生素等，(2) 四环素类抗生素:四环素、土霉素等(3) 氨基糖苷类抗生素:主要有链霉素、庆大霉素等。(4)大环内酯类抗生

5、素:如红霉素、螺旋霉素(5) 多烯大环类抗生素:主要是七烯类抗生素。如两性霉素B和制霉菌素。(6) 多肽类抗生素:多肽类抗生素的结构中含有多种氨基酸，经肽键缩合成线状、环状或带侧链的环状多肤类抗生素。如万古霉素 (7) 其他类抗生素：氯霉素、丝裂霉素、克林霉素等抗生素的细菌耐药性耐药性：细菌产生的对抗菌药不敏感的现象，是细菌自身生存过程的一种特殊表现。 随着抗菌药物的大量使用，细菌的耐药能力不断强化，逐步从单一耐药到多重耐药甚至泛耐药，最终对临床各种抗菌药物都变得耐药，遂被称为“超级细菌”。也就是说，一旦感染“超级细菌”，能用于治疗的药物非常少，绝对有效的甚至没有。“超级细菌”泛指临床上出现的

6、多种耐药菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、抗万古霉素肠球菌（VRE）、耐多药肺炎链球菌（MDRSP）、多重抗药性结核杆菌（MDR-TB），以及碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（KPC）等。 新发现的“产NDM-1耐药细菌”与传统“超级细菌”相比，其耐药性已经不再是仅仅针对数种抗生素具有“多重耐药性”，而是对绝大多数抗生素均不敏感，这被称为 “泛耐药性”（pan- drug resistance, PDR）。 超级病菌能在人身上造成浓疮和毒疱，甚至逐渐让人的肌肉坏死。更可怕的是，抗生素药物对它不起作用，病人会因为感染而引起可怕的炎症，高烧、痉挛、昏迷直到最后死亡。1.耐药性的种类 1.1固有耐药

7、性：基因决定、不会改变 链球菌氨基糖苷类 肠道G-杆菌青霉素G 铜绿假单胞菌多数抗生素（头孢他啶 ）1.2获得耐药性：由质粒介导，改变自身的代谢途径；可消失、也可遗传。 质粒(P1asmld)是细菌染色体外具有遗传功能的双链脱氧核糖核酸，携带有耐药性基因的质粒称为耐药性质粒，简称R质粒。 2.耐药的机制2.1产生灭活酶： 内酰胺酶、钝化酶2.2作用靶位发生改变： 某些肺炎球菌、淋球菌对青霉素G耐药，以及金葡菌对甲氧苯青霉素耐药，是因细菌突变引起青霉素结合蛋白（PBPs）改变，使药物不易与之结合。 2.3改变细菌外膜通透性 如细菌对四环素耐药主要由于所带的耐药质粒可诱导产生三种新的蛋白，阻塞了细

8、胞壁水孔，使药物无法进入。2.4 影响主动流出系统 细菌利用体内的主动流出系统将进入体内的抗生素泵出菌体四、抗生素的质量分析 （一）鉴别试验1.官能团的显色反应-内酰胺环的羟肟酸铁反应链霉素的麦芽酚反应、坂口反应2.光谱法 UV&IRIR时注意抗生素存在多晶形现象相同溶剂同时重结晶供试品和对照品3.色谱法 TLC&HPLC 标准品对照法 4.生物学法 检查抗生素灭活前后的抑菌能力，并与对照品比较（二）检查 1.影响产品稳定性的指标结晶性、酸碱度、水分、干燥失重2.控制有机和无机杂质的指标溶液的澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属3.安全性指标异常毒性、热原或内毒素、降压物质、无菌

9、4.其他 多组分抗生素组分分析Inj普鲁卡因青霉素悬浮时间与抽针试验氨苄西林钠吸碘物质四环素类杂质吸收度-内酰胺类抗生素聚合物取本品l瓶，按每40万单位加水lml使成混悬液，摇匀,静置2分钟，不得有颗粒下沉或明显的分层。用装有4.5号针头的注射器抽取，应能顺利通过，不得阻塞。取本品0.1g，精密称定，置碘瓶中，加水20ml使溶解，加1M盐酸溶液0.5ml ，精密加入碘滴定液(0.02M)25ml,摇匀，立即用硫代硫酸钠滴定液(0.02M) 滴定，至近终点时，加淀粉指示液数滴，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml碘滴定液(0.02M) 相当于0.7392mg的吸碘物质。按无水

10、物计算，含吸碘物质不得过5.0 。四环类抗生素多为黄色结晶性粉末；而异构体、降解产物颜色较深，此类杂质的存在均可使四环素类抗生素的外观色泽变深。含量测定方法（一）微生物学方法 测定抗生素对微生物的杀伤和抑制程度，作为衡量效价的标准原理：量反应平行线原理方法：浊度法 管碟琼脂扩散法当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系 缺点优点1.灵敏度高、用量少、结果直观2.与临床效果一

11、致3.适用范围广，对纯度要求低4.对同一类型抗生素不需分离5.不要求有明确的分子结构1、操作繁琐2、培养时间长3、测定误差大(管、碟、人）（二）理化方法 根据抗生素分子的化学结构特点利用其特有的化学性质及反应而进行的优点1.准确度高、有一定的专属性2.简单、快速测定结果为总的含量，不一定代表生物效价2.易受含相同官能团杂质的干扰3.要求化学结构明确的纯品缺点抗生素活性表示方法 效价单位（U、g）每毫升或毫克中含某种抗生素的有效成分的多少如：1mg青霉素钠=1670U 80万U青霉素钠=479mg第二节 内酰胺类抗生素 青霉素类A B A-内酰胺环B- 氢化噻唑环NSCH3CH3COOHOHN4

12、321567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）青霉素（Penicillin）（青霉素G、苄青霉素）头孢菌素类A BA-内酰胺环B-氢化噻嗪环7612345NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）RCO头孢氨苄（Cefalexin）结构与性质一、Na与碱金属或生物碱成盐（一）羧基酸性（二）旋光性手性C （三） UV头孢菌素类 母核有共轭体系 干燥纯净 稳定水溶液 不稳定 不稳定性因素四元环张力大 酰胺键易水解 （四）内酰胺环利用药物最大吸收波长鉴定利用水解产物的最大吸收波长鉴定（二）光谱法 IR&UV法（一）色谱法 TLC、HPLC 二、鉴别1. 异羟肟酸铁反应 -内酰胺类NaOH，C

13、2H5OH-b2HClNOHH内酰胺类呈色异羟肟酸Fe3+/3H+.（三）呈色反应H+Fe3+/3 （红、棕、褐）2. 茚三酮、双缩脲反应蓝紫色头孢类茚三酮紫红色碱性酒石酸铜青霉素类（开环分解）3、与H2SO4 - HNO3反应黄色红棕亮黄头孢氨苄头孢噻吩钠头孢噻肟钠H2SO4-HNO34. 与变色酸-硫酸反应活泼“-CH2-”HCHOCH-SOH422”羰基侧链含“（分解）变色酸显色5. 与重氮苯磺酸反应酚羟基橙黄色重氮苯磺酸（偶合）头孢哌酮6. 与铜盐反应CuSO4HAc头孢氨苄橄榄绿色NaOH专属反应（四）盐的反应1.K+、Na+反应2.重氮化 - 偶合反应芳伯氨基3.沉淀反应 (盐 生

14、物碱）三、检查 （一）高分子聚合物分子排阻色谱法原理：凝胶色谱柱的分子筛机制方法：主成分自身对照法 面积归一化法；限量法 自身对照外标法 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。（二）

15、有关物质、异构体 通常采用色谱法（三）杂质吸光度 青霉素钠：A280nm0.10（四）有机溶剂 GC法（五）结晶性 偏光显微镜法 消光位：当处理好样品后，通过偏光显微镜可以看到很多亮晶的晶体，盯住其中一点看，慢慢连续转动偏光显微镜载物台，这个亮点会由亮变暗又变亮，周而复始。 双折射：由于每个晶体都会产生两束折射光，所以会看到闪闪发光。X射线粉末衍射法 结晶质衍射图显尖锐的衍射峰 非结晶质衍射图呈弥散状四、含量测定（一）HPLC法第三节 氨基糖苷类抗生素苷苷元 + 糖缩合链霉素苷元链霉双糖胺氨基糖链霉胍 + 链霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺性质1.羟基-与水形

16、成氢键-水溶性 氨基-碱性-与矿酸成盐2.氨基糖结构-旋光性3. UV-链霉素max=2304.苷键的性质：水解酸性：链霉素链霉胍 + 甲基葡萄糖胺链霉糖麦芽酚链霉胍+链霉双糖胺链霉糖+甲基葡萄糖胺碱性：二、鉴别（一）茚三酮反应 CHP-硫酸小诺米星羟基胺结构& -氨基酸蓝紫色茚三酮硫酸小诺米星（二）Molisch反应有五碳糖或六碳糖结构的氨基糖苷类酸水解盐酸（硫酸） 脱水糠醛（五碳糖）羟甲基糠醛（六碳糖）-萘酚 蒽酮呈色（Elson-Morgan反应）N-甲基葡萄糖胺药物水解HCl乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛樱桃红色（三） N-甲基葡萄糖胺反应（四）麦芽酚反应链霉糖特有反应H+分

17、子重排消除N-甲基葡萄糖胺 链霉胍麦芽酚紫红色+3Fe链霉糖链霉素-OH（五）坂口反应链霉胍特有反应链霉胍+次溴酸钠产物I8-羟基喹啉（-萘酚）I+II橙红色产物+次溴酸钠产物IIN-甲基葡萄糖胺反应麦芽酚反应坂口反应（八） UV法IR法庆大霉素无UV吸收（六） 反应（七）色谱法方法 TLC和HPLC特点 发酵中产生 生物活性低（一）链霉素B的检查三、检查对微生物的活性无明显差异毒副作用和耐药性不同发酵菌种不同工艺差别C组分比例不一致规定控制各组分的相对百分含量ChPUSPBPJP（二）庆大霉素C组分的测定max = 330nm1.样品处理 庆大霉素无紫外吸收，当采用紫外检测器时，需进行衍生化

18、处理 USP离子对HPLC 庚烷磺酸钠为反离子方法 2.规定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%计算 3.%XXXXX%CCCCCiiaa100+=2211讨论：1.柱效以C2峰计理论塔板数不低于12002.流动相极性的控制3.衍生化试剂与衍生物的稳定性差4.离子对试剂浓度影响庆大霉素邻苯二醛衍生物的保留值四、含量测定微生物检定法HPLC法：离子交换、离子对、RP（四）硫酸盐测定 EDTA络合滴定法电化学检测器（Electrochemical detect，ECD）： 主要有安培、极谱、库仑和电导四种检测器。前三种统称为伏安检测器，用于具有氧化还原性质的化合物的检

19、测，电导检测器主要用于离子检测。 应用范围广，凡具氧化还原活性的物质如含硝基、氨基等有机化合物及无机阴、阳离子等物质都能进行检测，本身没有氧化还原活性的物质经过衍生化后也能进行检测。 优点：灵敏度很高，尤其适用于痕量组分分析。 缺点：干扰比较多，如生物样品或流动相中的杂质、流动相中溶解的氧气及温度的变化等都会对其产生较大的影响。 电极寿命有限，对温度和流速的变化比较敏感。 蒸发光散射检测器(Evaportive light Scattering Detector, ELSD) 原理为首先将柱洗脱液雾化形成气溶胶，然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发，最后余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测

20、。 ELSD最大的优越性在于能检测不含发色团的化合物，如：碳水化合物、脂类、聚合物等，并在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物 。 ELSD UV MS应用范围 通用 有光吸收的化合物 通用响应 质量相关 化学相关 质量相关灵敏度 高 高 高未知物检测 能 不 能流动相影响/梯度 不影响 本底影响 不影响基线稳定性 好 较好 好第四节 四环素类抗生素123456789101112ABCD四环素（TC）tetracycline一、 结构与性质酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性二甲氨基 弱碱性(二）旋光性（一）两性1.与酸、碱均能成盐2.强酸或强碱中溶解度3.结晶性物质，具引湿性（510）

21、引湿性是药物粉末或冻干块状物在一定温度及湿度条件下吸收水分多少的特征。测定方法是固定温度、固定湿度，固定时间来测定的，测得是吸湿增重。引湿性特征的描述 引湿增重极易引湿 20%易引湿 1020%有引湿性 510略有引湿性 1%5与金属离子生成有色配位化合物Ca2+ Mg2+ Fe3+ Al3+ 共轭双键UV原药、降解产物荧光UV（三） UV和荧光（五）不稳定性 四环素类抗生素对各种氧化剂、酸、碱都不稳定。碱性水溶液特别容易氧化，颜色变深；干燥的游离碱及盐类较稳定，但在贮存中遇光时会被空气中氧所氧化，促使颜色变深 1.差向异构化淡黄黑蓝色荧光OHCONH2OOHOHOOHCH3HCH32NHO差

22、向四环素4（土霉素、多西环素不易差向异构化）54影响差向异构化速度的因素当ph2或ph9时差向化速度很小 随高价的无机酸或有机酸根阴离子的浓度增加，差向化速度增大2.降解反应（1）酸性下降解max = 445nmmax = 435nm脱水四环素6TCETCATCEATC（2）中性下降解 四环素类抗生素在中性甲醇或丙酮溶液中，室温放置也会因空气中氧的作用，氧化降解而产生一种紫红色物质。温度越高，变化越快。（3）碱性下降解（荧光）（一） TLC&HPLCEDTA 克服痕量金属造成的拖尾现象抗生素及降解产物在365nm产生荧光斑点检出（二） IR&UV二、 鉴别试验H2SO4反应（三）FeCl3反应

23、（四）三、检查 4-差向四环素（ETC） 脱水四环素（ATC） 差向脱水四环素（EATC） 盐酸金霉素（CTC） （一）盐酸四环素有关物质HPLC法（ChP2010版）标准品对照法引起临床毒性反应的主要物质（二）吸收度ETC).(Anm390360380控制杂质吸收度四、含量测定ChP、USPHPLC法（外标法）第五节、 高分子物质检查 引起抗生素不良反应速发性过敏反应（一）、定义、来源与分类药物中分子量大于药物本身的杂质的总称外源性杂质来自发酵工艺：蛋白、多肽、多糖等或抗生素与其结合物PG中的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽内源性杂质药物的自身聚合物 杂质控制重点二、基本结构与特点 1.结构（1）

24、青霉素族青霉噻唑多肽：发酵工艺产生青霉素的-内酰胺环+多肽上的伯氨基多肽类聚合物类抗原决定簇I多肽碎片抗原决定簇四氢噻唑环与多肽碎片形成的新抗原决定簇青霉素聚合物 聚合反应母核参与 侧链参与侧链有氨基侧链无氨基与母核有关的聚合物 与侧链有关的聚合物 青霉素聚合物反应速度 1.固体样品水分2.溶液溶液酸碱度 碱性中性、酸性3.水分、时间、温度促进聚合物形成（2）头孢菌素族 N型聚合物只与母核有关L型聚合物侧链参与与青霉素族区别不能形成类似于青霉噻唑基那样的头孢噻嗪基，而是进一步裂解732.高分子杂质的特点 2.1发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片均可带入产品中形成青霉噻唑多肽杂质2.2有不同聚合度和不同机理聚合反应形成的聚合物可发生不同程度降解2.3以异构体存在的样品，同聚和异聚反应可同时发生2.4高分子杂质的种类、数量与生产工艺密切相关三、杂质控制方法 葡聚糖凝胶色谱 凝胶色谱的分子筛作用小分子物质可以进入凝胶内部，出峰晚大分子物质直接从凝胶颗粒间流出，出峰早 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分