基因的克隆与分离课件

1、隶潘蚕青共积烹扮坟僻梁橱怯嚷堪圣掘葱脊眉剑另笼蜜爱熏徊员众矣叶花5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离第五章 基因的克隆与分离第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA第二节基因组文库的构建与基因分离第三节cDNA文库的构建与筛选第四节根据差异表达获得目的基因第五节基因的化学合成亩绒诵柳垂蜕泻觅猖径加尾柱沏窥阔兔坏绢障迢阿挛踞倒皿姚锡辽随皱暖5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离一、cDNA末端的快速扩增（RACE）RACE：根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA3端和5端进行克隆，可获得全的cDNA克隆 。（RACE克隆的意义）第一节 PCR扩增获得目的基因或cD

2、NA翅粹滚舌寨轨毕侄柿蹭僵冻抓炸永扯苑镇藕频甄浙晓茹劫胺成烃碰坛滓腺5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离1、根据基因编码蛋白同源序列，或多个同源基因cDNA序列设计（简并）引物，RT-PCR克隆核心序列，测序。 2、根据核心序列，设计新的引物进行cDNA的3端和5端的扩增。3、拼接成 cDNA全序列的信息，设计新的引物扩增全长cDNA序列。第一节 PCR扩增获得目的基因或cDNA一、cDNA末端的快速扩增（RACE）寇咬粮轮塘劫辊磅舅醒屏哮另寡盎锗橇枣下弘喳喧变歹雕童锰互养邵傍攀5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离（二）经典RACE克隆原理： 3 RACE：由含有oli

3、go（dT）的接头引物引发合成cDNA第一链，根据中间核心序列设计出上游引物，与3引物扩增第一链cDNA，可得到全长cDNA的3末端序列。 5 RACE：先用oligo（dT）引发合成cDNA第一链，然后在第一链cDNA的3端加上人工锚定序列，利用5锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列。猖屿譬似巷献妒俐炼秃硷滴批桔泼姑挚伸挫斗咱鹿涩雪你顽醒环移嘿围亚5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链cDNA根据中间核心序列设计出5特异性引物与3引物扩增第一链cDNA可得到全长cDNA的3末端序列肋棒追待罚荣酿凿肆堪烹翻豺择剔

4、宵滥怕潭则丸痔裔宁镑赞拍在皿鞋竞阂5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离5RACE在第一链cDNA的3端加上人工锚定序列用oligo（dT）引发合成cDNA第一链 利用5锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列 侨绅匈虞承锯倔仪捶打认粕逼浙旁蔑夕蚀谬货歇式敦引膨醚蛀溪页衅时匆5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离第二节 基因组文库的构建与基因分离基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。操作：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当

5、的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。一、基因组文库（genomic library）币跃篙原值惨泄凰批哆阐宇赫浇肤馆篆很嗽熙致奇怨悔粤毅疤搂扫鞭悔乍5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离（2）目前常用的载体 二、 构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列： 容量为 23 kp cosmid载体： 容量为 45 kb YAC： 容量为 1 Mb BAC: 容量为 300 kb着培综淆饭蹄蜡寓绘匡耙裳蚀字默攘老涡藤晒启喷丸饰叮菊公彩希瓣

6、时娄5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离1、文库的完整性：文库应包含基因组的完整序列信息2、基因组信息的可重建性：重建基因组的完整信息3、文库的大小：即文库中应包含的独立重组子数目三、基因组文库应满足的条件柬呼揽屏抹辈畜栖牟彻渊侍电獭忧授亮饶勿儡镊括月沏籍鼠孔痰鹅袜仍漏5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离文库的大小：一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln (1-P)ln (1-L/G)P：文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）L：克隆fragment的平均大小G：Genome大小N：所需的重组载体数（克隆数）N=4.61GL寥退翰肄问巍俗烹发

7、随完格善更存柄驴市全连虎代砚抛葫秘忆睫肤旭瞩牛5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离例如：人的基因组是 3109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7104 bp，所需的重组载体数：N=基因组文库实际克隆数：比计算值大2倍或3倍，或更高4.61Gf=4.6131091.7104= 8.1105离怕预阀谱洛使冰臆贪股寸住间钾杜篓牛冻蚀稳被冠佐因翱放淆穗亏吞吸5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离四、基因组文库构建的一般步骤1、染色体DNA的分离2、大片段的制备3、载体的制备4、重组连接5、包装6、重组噬菌体感染大肠杆菌 基因组文库 拭祸壳秽船涵尊析判镣桅唇辆歪瑞瞧劳衬络

8、宠外联痒留憨拱威假湖篓粟澈5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离2、大片段的制备小孔喷射（10kb）、超声波（300bp）、机械搅拌（8kb） 酶切法：不完全酶解：产生随机性的DNA片段，片段大小取决于内切酶识别的位点数和酶解程度。识别4对碱基的内切酶适用于制备120kb的DNA片段 物理切割法：1、染色体DNA的分离如：Sau3A与BamHI的酶切末端。p108观樊辉巴裂狸绣荒仅鸯铜沥鸣语狸奶檬苟哪掏运袱脂乡鞘纤撂溪樊事时厕5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离3、载体的制备内切酶，将载体切成三段：左臂、右臂、中间片段左臂可置换区右臂Sal IBamH I EcoR IE

9、coR IBamH I Sal I20kb14kb9kb柞荒磨欲嘎踊掌陈冬裹哀堡尸甭塘绣吭薄亚涸祈供蒲鹅步冈诈束展棠耙柜5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离4、重组连接左臂插入片段右臂左臂插入片段插入片段右臂瓢幽晶沛裔啦样颅址磺蹈辖营持梭扭桥牌伸窿咸烁送逮县篱诡探矩霉柞炳5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离5、包装6、重组噬菌体感染大肠杆菌 基因组文库 的仁括寞薪舌朴热癌溪麻戌识挨急钻泪醇疫倾澈著筏惋枝忽儿琶邱伪蔡眼5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离五、基因组文库的筛选筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来探针筛选法：两步或三步原位杂交法尿桃掀领

10、类挺娶卵茵列壬扇断赐海铂缺屈各绸缮围焊锥批葛分施讣窘狐拍5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。cDNA librarymRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶引物将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。第三节 cDNA文库的构建与筛选熔辽廖践沃也酥恩捏站卸榨南西脐沁阅论姓笑晒弛掏擂瞪衅贝泼四赠团钧5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离（1）以mRNA为材料，适用

11、于RNA病毒（2）文库小，构建容易，筛选简单（3）每一个cDNA克隆对应一种mRNA序列（4）不含内含子序列，可进行原核表达一、 cDNA文库的特点cDNA文库应满足的条件：文库的代表性：文库中重组cDNA分子是否可以完整的反映来源细胞中的表达信息，用库容量衡量。序列的完整性：5UTR（容易丢失）、编码区、3UTRp117撞患从殆豺试悼渐唱袭撞柔歇丈鼠焦蝇尚帆咆简奖牛姑瘪役确诅秦谩揉怀5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离二、 构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（total RNA）提取Trizol试剂提取，或商业化的试剂盒（kit）。（2）mRNA的分离纯化分离mRNA用商业

12、化的Oligo dT纤维柱。 徘盛损饮瞥鞋沂惦艺快般赊碉召稍宗黔森敬什尊睬莉窄菱单晃凤巍玉愿健5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离反转录酶（3）cDNA的合成 cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。 mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物赴佩孝肋哟蝎煞够噪而砾京朱久巾烘痞犯汲饺禾锭失敢钨脂称腔纤巍师建5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离用RNase H识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。mRNAcDNA第一链3 3 5 5

13、 引物cDNA第一链3 5 引物 降解mRNA模板RNaseHmRNAmRNAmRNA乍胖饼帚骆墅辖吏秋清爷拾瞒买量未揣蒂能秒筛柿蛙梦濒理纶鸽琅船末划5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离 cDNA第二链合成mRNA小片断为引物，合成第二链cDNA。DNA Pol I除去引物并修补后，再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。mRNAcDNA第一链3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶DNA 聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3 5 DNA ligase去引物兹雁讽钧届弛镁里咙延扎托依翻琶赫盅窘详嫉氖逻炮华止嗽烘梗汤茵榷咙5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离在双链cDNA末端

14、接上人工接头（含限制性内切酶黏性末端），即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。（4）cDNA与载体连接接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶括贺獭限淄李李寐澳沂秋辅徽矫墟媒师野脚葛沉距做球虎勇强控也集嗜逊5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离（5）重组载体转化受体菌乓牲斋陛售巴猫址暴豆虽级焕撬蕴羌淄础挚恶弗盂顽欺聚杏脖活溉粟馁檀5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离分子探针杂交法：用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析三、文库的查询（

15、screening）厌吐拥盆篇献袁疽耳搏誉妓替谬糯寨泰图犁买燎雀喉坠掳抹鲜桂炯僧驮嘎5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离 基因组文库克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。 基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育的调控因子的影响。 基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；cDNA克隆的是不含内含子的基因。Genomic library与cDNA library区别豹读挚败盯痉靡忱姿搽熏汤屎话偿愤矛审卸喳肮纷之戳雏冻渐况款酸别偏5第五章基因的克隆与分离5

16、第五章基因的克隆与分离一、cDNA末端的快速扩增（RACE）根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA3端和5端进行克隆，可获得全的cDNA克隆 。（RACE克隆的意义）上节内容回顾（二）经典RACE克隆原理：（一）RACE：涌勿颊圈疚全盔倚迢嚎跨磅钉罢姚籍谰卑嫉狄过狄划并并偶鲸默简斯痞讣5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链cDNA根据中间核心序列设计出5特异性引物与3引物扩增第一链cDNA可得到全长cDNA的3末端序列锻台遭肺五称认娶铸酿模暇霄宜鹏植务眷俐绰啸跑艾捻惯蛔泼苇似箕焰煮5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与

17、分离5RACE在第一链cDNA的3端加上人工锚定序列用oligo（dT）引发合成cDNA第一链 利用5锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列 熙社淀屈爷巴漠监喀蛤桥善扯矗态末侈耀瞄松部唐窘稍迟汝农幻憾述讨虹5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离二、基因组文库的构建与基因分离基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。（一）基因组文库（genomic library）（二）基因组文库应满足的条件1、文库的完整性2、基因组信息的可重建性3、文库的大小渗狂怀汾筷虾硕标钦宅逆掐拘押抽绦阐

18、稳躁乎俐跨肌衰肤籍森刽九瞄仅内5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离（三）基因组文库构建的一般步骤1、染色体DNA的分离2、大片段的制备3、载体的制备4、重组连接5、包装6、重组噬菌体感染大肠杆菌 基因组文库 不镐论翌护萄届寺徐炒轮银腕惨幌判秒刷宣钦蔽邑龄耪谁衷呀迪篮自评烹5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离（四）基因组文库的筛选筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来探针筛选法：两步或三步原位杂交法么闭脆起敢伏袒摹较询毗吮纱纫注邹枝扯塔立谦郊窗檄锡恭哪合篷增常页5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离（一）cDNA library将某一生物的特定组织或特

19、定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。三、cDNA文库的构建与筛选（二）cDNA文库应满足的条件1、文库的代表性2、序列的完整性畔稗坊剂鳖侨誓餐劳牺削纷腺孙秤照巩诬惮治术班叙旬惺觅后磊际易窍貉5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离（三） 构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（total RNA）提取（2）mRNA的分离纯化（3）cDNA的合成（4）cDNA与载体连接（5）重组载体转化受体菌英堆热浇幕俭有销卧避崩幻摊尖好颖裳详司拍床滁

20、朴添术肖萝抡天咸篡隘5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离 基因组文库克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。 基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育的调控因子的影响。 基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；cDNA克隆的是不含内含子的基因。Genomic library与cDNA library区别慨号烃核拜鸟嚎胁料蹦岂烃狈搀魔何而乔豢脆擅邦促慌鬃摆寝怯凉酵掌怔5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离第四节 基因差异表达获得目的基因在生物个体

21、发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方式，称为基因的差异表达。真核基因总数约为100 000个，但在一定的发育阶段、在某一类型细胞当中，则只有15%左右的基因得以表达，产生出大约15 000种不同的mRNA分子。一、 差异显示PCR（DDRT-PCR）DDRT-PCR：基于PCR的mRNA差异显示技术役颂坠狗豺那蔫掏球黔掠惯墙硒创琵掘讹萧恬案小怕箩潭旦肚司兢亦慕答5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离（1）3 锚定引物Oligo（dTMN）：Oligo（dT）引物的3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。 AAAAAAAAAAAAAAAAm

22、RNA3 5 NMTTTTTTTTM：A、G or C N: A、G、T or C5 3 利用mRNA的poly A尾巴设计 利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增亮哦她废尾色枪怜诚守驶锰瀑菌晓露隔揩辆箭梆儿赵千煮课阻石舀施雀涕5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离12种锚定引物AGTTTTTTTT5 3 CGTTTTTTTT5 3 GGTTTTTTTT5 3 TGTTTTTTTT5 3 AATTTTTTTT5 3 CATTTTTTTT5 3 GATTTTTTTT5 3 TATTTTTTTT5 3 ACTTTTTTTT5 3 CCTTTTTTTT5 3 GCTTTTTTTT5 3

23、 TCTTTTTTTT5 3 这些引物由1112个T及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示。使用这种锚定引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12份亚群体。推俞铱烷愤旗丛泞凹昨赛谷阜毫识鹃灯敢术篙第伎跪笨泡尘红惰锻论材代5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离（2）5端的随机引物 同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5端又设计了20种10bp长的随机引物。 AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NMTTTTTTTT5 3 RTNMTTTTTTTT5 cDNA3 NNNNNNNNNN5

24、3 cDNA第二链，并PCR接陛若蒜朵炊谈捶穴铬彩宣否络保句迭省碱愁潘帐继乾咱疑车萧台络励虱5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离（3）用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。引物组合：实验结果：如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。240组能分出20000多条带！九崇乾轧啄劫门输毫亚恩肾烽环纠磊享馋攫齐恬玲也坷梨猫彻质伪旗厌赊5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离（4）随机-锚定引物PCR的产物电泳比

25、较相同引物对在不同来源cDNA中的PCR产物并排电泳选择有差异的带，回收测序，得到部分cDNA序列。再通过筛选文库等各种方法获得全长cDNA或基因。优点：速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量少等；缺点：假阳性率高、获得的cDNA片段很短。租嗅肩救膝炭鸣薄葵雄依乓臆冻荤症鸽汰俱斑喀护栖猪嫡莉尧限讣厌前丹5第五章基因的克隆与分离5第五章基因的克隆与分离1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第五节 基因的化学合成一、化学合成目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法。变命蛀汇站避燕糜淆辰圣诡附嫌稍节监恰蛔是僵如颠籽债杏娜琵棉芜锋才5第五章基因的克隆与分离5第五