动物细胞工程制药的研究进展(共6页)

1、动物细胞工程(gngchng)制药的研究进展程庆佳（云南大学(yn nn d xu)，生命科学学院，生物技术，20091070004）摘要(zhiyo)：动物细胞工程制药是动物细胞在制药产业中的应用，本文主要介绍动物细胞工程最新的制药研究进展，包括动物细胞融合技术，细胞核移植技术，转基因动物技术，细胞大规模培养技术等，同时讨论动物细胞制药的发展方向和发展前景。英文摘要：Animal Cell Engineering is animal cells in the pharmaceutical industry in the application. This paper describes th

2、e latest pharmaceutical animal cell engineering research, including animal cell fusion techniques, monoclonal antibodies, transgenic animal technology, large-scale cell culture technology, Also discussed animal cell engineering pharmaceutical development prospects.关键词：动物细胞融合技术，单克隆抗体的制备，转基因动物技术，细胞大规模

3、培养技术，发展前景英文关键词：Animal cell fusion techniques, monoclonal antibodies, transgenic animal technology, large-scale cell culture technology, development prospects所谓动物细胞工程就是以动物细胞为基本单位在体外条件下进行培养、繁殖和人为操作，使细胞产生某些人们所需要的生物学特性，从而改良品质，加速繁殖动物个体或获得有用品系的技术。这种技术在制药业中起到关键的作用，目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过8 0，例如蛋白质、单克隆抗体、

4、疫苗等。当前动物细胞工程制药所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞核移植技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术等方面。本文就是以细胞工程为基础阐述动物细胞工程制药的技术与发展前景。用于制药业的动物细胞系目前用于生物制药的动物细胞有4类，即原代细胞、传代细胞系，转化细胞系和融合的或重组的工程细胞系。1.1 原代细胞原代细胞是直接取自动物组织器官，经过粉碎消化而获得的细胞悬液。动物细胞生产生物药品的早期，一般用原代培养的细胞来生产疫苗，如鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞等，Ender最先用原代培养的猴肾组织细胞来生产脊髓灰质炎灭活疫苗。原代细胞增殖能力有限，需要大量动物才能增加产量

5、，费钱费力，限制了它的应用。1.2 传代细胞系传代细胞系是二倍体细胞在传代繁殖过程中，有些细胞发生改变，不仅形态发生变化，且生长更快，能以少量的细胞起始培养。由一个这样的细胞得到的细胞克隆，与它起源的细胞株大不相同，它能无限期地生存，这样的细胞克隆称为传代。许多传代细胞系建立于50年代，用它们来生产疫苗不仅可以降低实验动物的量，并且因为所用的细胞性质均一，通过体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量，避免了动物个体差异产生的疫苗质量不稳定问题。但传代细胞系在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处，有时是从肿瘤细胞衍生而来，由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性，因而数十年间未允许传代细胞系用

6、于生产。7 O年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性，wI一38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系。二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取，有明显的贴壁和接触抑制特性，有正常细胞的核型，一般可传代培养5 0代。且无致瘤性，现在传代细胞系已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但仍不是理想的生产细胞。1.3 转化(zhunhu)细胞系通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化细胞系具有长期培养，倍增时间(shjin)短，对培养条件和生长因子等要求较低的特点，适于大规模工业化生产。在生物制药中，可通过改造宿主细胞特性，如延长细胞周期提高

7、工程细胞原始表达水平等来提高药物的产量。李红艳等研究空间环境对CH0(dhfr)细胞生长特性的影响，结果表明空间诱变致生长减慢的细胞株有利于提高目的蛋白的产量，为筛选优化的生物工程制药细胞提供(tgng)可能o 31。目前cHo(dhfr)作为重要的基因表达受体细胞，已成功应用于表达促红细胞生成素(EPO)、重组乙型肝炎疫苗等生物制药领域。1.4 工程细胞系工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。用于构建工程细胞的动物细胞有BHK一2l，CHOdhfr、Namalwa、Vero、SP2O，Sf一9等细胞系。sP20

8、一Ag l 4工程细胞系是通过融合的方法，从抗羊红细胞活性的BALBc的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系P3x63A98融合杂交瘤sP2NLAg亚克隆中分离获得，可用于生产单克隆抗体幢l。目前用重组DNA技术改造的C H O细胞生产干扰素，白介素，E P O、单克隆抗体、诊断试剂以及其它各种蛋白质类药品已成为国际医药市场上的热销产品，但这些产品的生产规模普遍较小(大多为550升的小型培养罐)。动物细胞工程制药技术2.1 细胞融合技术细胞融合(cell fusion)，是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞的过程。可用于产生新的物种或品系及产生单克隆抗体，苗等生物制品的

9、生产等。在动物体细胞融合技术的基础上Kohler G和Milstein C将能产生特异性抗体的原代B淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合，创立了单克隆抗体制备的方法。其中淋巴细胞杂交瘤在国内已普遍开展，并培育了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌产生在诊断和治疗病症方面发挥重要作用的单克隆抗体。由于技术已趋成熟，目前许多单克隆抗体已经进入产业化的生产阶段。根据来源的不同，单克隆抗体大体上可分为4类，即鼠源化单克隆抗体、人鼠嵌合体单克隆抗体、人源化单克隆抗体、全人源化单克隆抗体。其英文名称中表示来源的词缀含义及中文译名见表1根据用途的不同，单克隆抗体大体上可分为(fn wi)3类，即诊断用单克

10、隆抗体(如妊娠试验用单克隆抗体、肝炎化验用单克隆抗体等)、治疗用单克隆抗体、“生物导弹”用单克隆抗体。单克隆抗体为人类疾病的防治和诊断、肿瘤体内定位、靶向药物的制备、防止移植物的排异反应、新型疫苗的研制提供(tgng)了较为理想的手段。根据美国药物研究和生产者协会的调查报告，目前正在进行开发和已经投入市场的抗体性药物主要有以下几种用途：器官移植排斥反应的逆转；肿瘤免疫诊断；肿瘤免疫显像；肿瘤导向治疗；哮喘；牛皮癣、类风湿性关节炎、红斑狼疮、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病；脓毒症；急性心梗；抗独特型抗体作为分子(fnz)瘤苗治疗肿瘤；多功能抗体(双特异抗体、三特异抗体、抗体细胞因子融合蛋白、抗

11、体酶等)的特殊用途。另外细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一，已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。单克隆抗体是细胞融合技术应用的一个重要部分，除此之外，细胞融合技术还为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学。2.2细胞核移植技术细胞核移植是指将动物早期胚胎卵裂球或动物体细胞的细胞核移植到去核的(同种或异种)受精卵或成熟的卵母细胞质中，从而获得重构卵，并使其恢复细胞分裂，继续发育为与供体细胞基因型完全同的后代的技术。科学家们已经先后在绵羊，小鼠、牛

12、、猪、山羊等动物上获得胚胎细胞核移植后代，目前，体细胞克隆也在牛、山羊，小鼠等物种上均获得了成功。细胞核移植技术在现代制药、方面起到了关键性的作用，：人类可以利用克隆技术与转基因技术制备各种药物。用转基因技术制成的转基因动物被称为“活的生物反应器”。这样将外源基因直接引入或组人受体细胞中获得表达，其细胞分化后发育成的动物可以按照人类的需要进行生产。将这种昂贵的转基因动物繁衍下去的最好办法就是无性繁殖。人类可以利用克隆技术将携带特定基因的转基因动物“复制”下来，获得大量“活体药物工厂”。例如1988年DNX公司通过将人的血红蛋白基因转入猪细胞，实现了转基因猪生产人血红蛋白。这种方法比单纯使用转基

13、因方法的效率要高得多。若将转基因与细胞核移植技术获得的克隆动物工厂相结合，在生物制药方面具有巨大的潜在应用价值。1998年，Rohl等用非静息期胎儿或纤维细胞成功克隆出3只健康，同类的携带外源标记基因的转基因克隆。Schnieke等118l用此法成功克隆出3只携带有人凝血因子I X基因转染绵羊早期胎儿成纤维细胞，以该细胞系为供体移植到去核卵母细胞中，经过电和化学刺激后，将卵母细胞植入假孕母绵羊体内发育，获得这3只绵羊，这3只绵羊能高水平地表达人凝血因子I X(125 Il gm1)。Cibelli等同样也获得3头转基因牛。这些研究展示了转基因克隆动物技术的可能性，为细胞工程制药带来了光明前景。

14、2.3转基因动物(dngw)技术转基因动物是指通过重组DNA技术，将外源基因导人生物体内，外源性基因稳定整合在染色体基因组上并传给下一代。转基因动物可作为医用或食用蛋白的生物反应器。因为乳腺是一个(y )外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器，所以用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊、牛等产量高的动物就相当于一座药物工厂。目前应用比较广泛的是动物乳腺生物反应器来大规模生产供人类疾病治疗和保健用的药用蛋白或其他生物活性物质。转基

15、因动物的乳腺可代替细菌和细胞等生物发酵，并且可以有效地对所产出的蛋白质进行后加工和修饰。因而，动物乳腺生物反应器被国际上公认为是转基因动物研究中最具有发展前景的方向之一，也是实现(shxin)基因工程制药的重要途径。据美国遗传学会预测，到2010年，所有基因工程药物中利用动物乳房生物反应器生产的份额将高达9 5。国外现已有数十家以动物乳腺反应器为核心技术的公司，可生产a l一抗胰蛋白酶、人红细胞生成素，乳铁蛋白、人血清白蛋白、人血红蛋白及人凝血因子，和抗凝血酶、血纤维蛋白原、tP A等十余种稀有药品，但只有为数极少的几种药用蛋白上市。2006年6月，由美国Genzyme转基因公司研制成功的世界

16、上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物重组人抗凝血酶已经获准上市。我国自l 998年在国家“863。计划中将“转基因动物乳腺生物反应器”作为重大研究项目以来，也取得了一些较好的成绩。l 996年研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子，EP0的转基因羊；l998年曾溢滔等获得了能表达人血清白蛋白的转基因奶牛，2000年中国农业大学与北京兴绿原生物技术中心合作，成功获得了我国首例转有人al一抗胰蛋白酶基因的转基因羊113l2005年中国农业大学和北京济普霖生物技术有限公司联合研制的人乳铁蛋白和人乳清白蛋白转基因奶牛均获得高效表达，含量分别达到34克升和15克升。标志了我国首次获得可

17、商业化生产的动物乳腺生物反应器重组人类蛋白。目前科学家们正在加紧开展重组蛋白纯化，临床前试验和临床试验等研究，力争早日实现我国动物乳腺生物反应器制药技术产业化。转基因动物除了可在生产基因工程药物方面发挥重要作用外，还可用于建立诊断和治疗人类疾病的动物模型、生产可用于人体器官移植的动物器官等方面。高科技展览中展示的长有“人耳”的小鼠显示了这方面的良好前景，这将有效地解决器官异体移植的生理适应难度大的问题和大幅度地降低器官异体移植的成本。2.4细胞大规模培养(piyng)技术动物细胞培养开始于本世纪60年代初，发展至今已成为生物、医学(yxu)研究和应用中广泛采用的技术(jsh)方法。最近几年，动

18、物细胞培养发展迅猛，能够自由扩大培养并且已经用于工业化生产。许多生物活性物质、疫苗、载体，如药用蛋白质、单克隆抗体、流感疫苗等，都能利用动物细胞大规模培养来获得。这些高技术产品大致可分为：疫苗、干扰素、单克隆抗体、基因工程产品。由此可见动物细胞的大规模高效培养技术是生物制药的关键技术。目前用于动物细胞体外培养的生物反应器有机械搅拌式、气升式，中空纤维式，回转生物反应器等。国外占主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，为提高细胞的产率，可采用流加或灌注培养及微载体培养等相关技术。美国Genentech公司使用cHO细胞以12，000L搅拌式生物反应器培养槽生产tPA重组蛋白以及治疗癌症的生物药物。

19、美国Gibco公司建立的流加悬浮培养rcHO表达r D Gal系统，采用化学修饰的无蛋白CHO细胞培养基并增加TCA循环，生物反应器中活细胞密度最高可达107cellml。国内第四军医大学采用5L CelliGen反应器连续灌注培养杂交瘤细胞，培养第9天细胞密度达到8106 cellsml以上。目前国内未见有万升级的生物反应器用于生产的报道，同时我国有关商品化大规模动物细胞反应器产品还处于空白，有待于迸一步改进现有生物反应器设计或设计新型的生物反应器。发展前景根据目前医药业的发展现状和趋势，我国细胞工程制药应该将重点放在以下几个方面：3.1 人源化抗体的研制和生产抗体可以对抗各种病原体，亦可作

20、为导向器，但目前的单克隆抗体多为鼠源性抗体，注入人体后会产生抗体（抗抗体）或激发免疫反应。目前国外已研究噬菌体抗体技术、嵌合抗体技术、基因工程抗体技术等来解决人源化抗体问题。为了获得疗效更好、更适于人体使用的抗体，我国的细胞工程研究工作者也应该在这方面有所作为。3.2 实施“动物药厂”计划实施“动物药厂”计划在二十一世纪最具希望和发展潜力的制药方向当然是转基因动物生物反应器，尽管转基因动物生物反应器的生产应用仍处于初级阶段，尚有许多问题和限制因素存在，但是我们应该清楚地认识到应用转基因动物生物反应器生产药物的美好发展前景。目前利用转基因动物生物反应器生产药物在伦理学及商品化方面已不存在任何障碍

21、。虽然这项技术的难度较大，成功率较低，而且目前通过转基因动物生物反应器生产的药物尚未形成产业化，但预期在21世纪初它们就会鼎足于国际市场，使转基因动物的产业成为最具高额利润的新型产业。3.3 建立动物细胞大规模培养的技术平台该技术是转基因工程药物、单克隆抗体及疫苗等产品的关键技术，主要由以下几个要素构成：1)高效的真核细胞表达系统。中国仓鼠卵巢细胞(C H 0)作为宿主细胞表达的外源蛋白最接近其天然构象，是生物制药最为理想的表达系统，但也存在一些问题，如表达量低、大规模培养困难、生产成本高昂。我们应从工程细胞本身着手，对细胞本身的生理特征进行改造，除了要求目的蛋白的表达置高外，必须适应无血清培

22、养基培养，具有即抗细胞衰老凋亡能力。2)性能优越的、个性化的细胞培养基，包括(boku)低血清培养基无血清培养基。3)先进(xinjn)的生物反应设备。3.4启动(qdng)“分子药田”工程随着二十一世纪的到来，传统中药材在保障人类健康的社会医疗事业中的作用越来越重要。因为在传统中药材中包含着许多人们尚未认识和开发的具有新功能的化合物，其中不少有望成为新的药物。借助细胞工程技术，人们可望保存和繁殖那些濒临灭绝的药材资源，也可望扩增那些数量极少而又极有价值的新类型化合物，满足临床的需求，或在遗传上改变现存的传统药材的有效成分，附加新的遗传成分，成为“转基因药材”。从植物细胞工程方面来说，植物细胞的大量培养和天然药物的工厂化生产将是未来一段时间发展的重点，尤其是天然植物蕴藏量少、含量低、但临床效用高的成分，如藏红花、紫杉醇等，利用细胞工程方法进行大量培养生产。可以说，如何将植物细胞工程技术与我国传统中草药研究相结合，是我们面临的一个新的课题。结语综上所述，细胞工程不仅可大量工业生产天然稀有的药物，而且其产品具有高效性和对疾病鲜明的针对性。因而，细胞工程药物的发展必将给制药工业带来一次革命性飞跃，在人类的医疗保健中发挥越来越重要的作用。而我国动物细胞工程制药目前仍处于起步阶段，与欧美国家相比还有很大差距，虽然目前可