基因工程载体教学课件

1、基因工程载体Made by lionchp第1页，共24页。一 分类依功能：克隆载体、表达载体、转录载体克隆、表达的基本流程： 克隆载体 转录载体DNA DNA RNA 蛋白质 表达载体第2页，共24页。依组成：质粒、噬菌体、病毒、粘性载体、 人工染色体可承载基因量：依次增大第3页，共24页。依类型：原核载体：质粒、噬菌体真核载体：酵母、病毒两类载体分泌型载体：传导入受体细胞后，表达产生 蛋白产物释放出来的载体穿梭载体：传导入受体细胞后，可在各细胞 间传递的载体第4页，共24页。二 要求可独立复制：有复制子含多个酶切位点：利于双酶切含抗性标记基因：利于重组体筛选质量数小：可接合外源DNA的量大

2、第5页，共24页。三 结构组成复制区：一个载体就是一个复制子启动子：基因可表达标志基因（例如抗药基因）：标志基因的作用：第6页，共24页。四 质粒载体结构：cccDNA（闭合、环状、共价）分类：根据复制类型严紧型：一个细菌中不能有过多的该种质粒松弛型：一个细菌中可有多个该种质粒（20个）根据移动性（接合性）转移型（接合型）：可通过性菌毛进入另一细菌非转移型（非接合型）：不可通过性菌毛进入另一 细菌第7页，共24页。根据作用F质粒：R质粒：Col质粒：第8页，共24页。命名：PBR322为例P：质粒BR：发现、构建该质粒的实验室/作者名首字 母简写322：该质粒的实验编号第9页，共24页。特征：

3、一个质粒就是一个复制子不相容性：有相同复制起点和分配区的质 粒不能共存于一个宿主细胞中第10页，共24页。几种常见的质粒载体PBR322：第11页，共24页。PUC18/19：第12页，共24页。PGEM-3Z：第13页，共24页。PGEM-4Z：第14页，共24页。标志基因的应用双酶切方法：用两种不同的内切酶分别切目的片段 与载体，各自得到两个不同的黏性末 端作用：目的片段可按顺序接合到载体上，单 酶切的载体两边是两个相同的黏性末 端，目的片段结合到载体上的顺序不 确定第15页，共24页。抗性筛选插入失活：目的基因插入载体时，插入到载 体的标记基因当中，破坏了该基 因，使此载体失去对应的抗性

4、应避免插入失活的原因：不插入失活时，培养的细胞菌落培养基中加入一种抗生素（载体上有对应抗性基因），能继续生长的菌落为阳性克隆，即我们要的菌落第16页，共24页。插入失活后的筛选：影印法培养细胞（A、B两个培养基中菌落位置分别相等），A中加入A抗生素，B中加入B抗生素筛选出有A、B两抗性基因，但A被插入失活的重组载体：A中的且B中不死的菌落为阳性克 隆，即我们要的菌落第17页，共24页。蓝白斑筛选原理：IPTG诱导LacZ（乳糖操纵子中）表 达出的酶可与X-gal成蓝色吲哚产物互补：载体上有片段，菌体基因组中有LacZ（LacZ缺片段），阳性克隆菌便有完整LacZ，可加IPTG诱导产生酶，加X-gal成蓝色吲哚产物蓝斑，阴性克隆菌成白斑第18页，共24页。五 噬菌体载体噬菌体载体：M130噬菌体载体：第19页，共24页。六 黏性载体 第20页，共24页。七 病毒载