《蛋白质分离技术》教学课件

1、蛋白质分离技术(一)第1页，共49页。一实验目的蛋白质的分离技术；掌握凝胶过滤技术的原理及应用,凝胶的分类;商品名;型号;吸水值;掌握凝胶过滤技术分离分血红蛋白与鱼精蛋白的操作过程,装柱,上样,洗脱,Hb的制备;掌握盐析的概念,分离蛋白质的基本原理；掌握硫酸铵分级盐析的基本操作技术第2页，共49页。2022/8/32Biochemistry Experiments二实验项目蛋白质的盐析与透析凝胶过滤法分离Hb与核黄素(B2)第3页，共49页。2022/8/33Biochemistry Experiments（一）蛋白质的盐析与透析盐析实验原理: 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为

2、“盐析”。蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水化膜和电荷。中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即形成沉淀。第4页，共49页。2022/8/34Biochemistry Experiments蛋白质的盐析与透析-原理第5页，共49页。2022/8/35Biochemistry Experiments蛋白质的盐析与透析-原理不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉

3、淀。第6页，共49页。2022/8/36Biochemistry Experiments第7页，共49页。2022/8/37Biochemistry Experiments蛋白质的盐析与透析-原理盐析实验原理: 蛋白质是大分子物质，它不能透过透析膜，而小分子物质（无机盐、单糖等）可以自由通过透析膜与周围的缓冲溶液进行溶质交换，进入到透析液中。 在实验室分离纯化蛋白质的过程中，常利用透析的方法除去蛋白质溶液中的小分子物质。 第8页，共49页。2022/8/38Biochemistry Experiments按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留分子量。第9页，共49页。2022/8/39Bi

4、ochemistry Experiments蛋白质的盐析与透析-实验操作盐析血清1ml 逐渐加入饱和(NH4)2SO4 溶液1ml ，边加边搅拌。 离心 rpm 10分钟 上清 沉淀（球蛋白）逐渐加入固体(NH4)2SO4 HCl 1-2滴离心分钟沉淀（清蛋白）第10页，共49页。2022/8/310Biochemistry Experiments蛋白质的盐析与透析-实验操作透析制备透析袋装样：取透析袋，将一端固定，由开口端加入含有硫酸铵的蛋白沉淀。透析：取10倍以上蛋白质体积的去离子水，将装好样品的透析袋悬于大烧杯中部。更换洗脱溶液数次（约30min一次），至达到透析平衡为止。检查：（按教材

5、步骤操作）检查洗出液中是否有NH4；支试管蛋白检测：支试管第11页，共49页。2022/8/311Biochemistry Experiments（二）凝胶过滤法分离血红蛋白与鱼精蛋白层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得

6、名为“色谱法”（Chromatography) 。 第12页，共49页。2022/8/312Biochemistry Experiments1.层析技术分类名称操作方式固定相流动相分离依据分配层析纸层析薄层层析液体液体溶解度离子交换层析离子交换柱层析固体液体带电性静电引力吸附层析吸附薄层层析气体吸附层析固体固体液体气体吸附力亲和层析酶与底物抗原与抗体固体液体配体专一性凝胶层析 凝胶过滤固体液体分子大小第13页，共49页。2022/8/313Biochemistry Experiments常用的层析原理-分配层析原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分

7、配系数（）。 固定相内溶质的浓度 流动相内溶质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂 =第14页，共49页。2022/8/314Biochemistry Experiments常用的层析原理-离子交换层析原理： 离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。 第15页，共49页。2022/8/315Biochemistry Experiments常用的层析原理-离子交换层析低盐浓度 洗脱液高盐浓度 洗脱液各试管进行连续收集混合蛋白质+ 离子交换层析分离蛋白质示意图第16页，共49页。2022/8/316Bio

8、chemistry Experiments 离子交换层析分离蛋白质示意图常用的层析原理-离子交换层析用低浓度的阴离子洗脱用高浓度的阴洗脱离子阴离子交换剂带负电荷的蛋白少的先洗脱下来带负电荷的蛋白多的后洗脱下来第17页，共49页。2022/8/317Biochemistry Experiments常用的层析原理-吸附层析原理： 利用吸附剂对混合试样各组分吸附力不同而使各组分分离。吸附现象形成的原因： 被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力(形成离子键)、氢键及范德华引力等。第18页，共49页。2022/8/318Biochemistry Experiments常用的层析原理-吸附层

9、析 吸附剂易吸附分子不易吸附分子吸附剂： 氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、 淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。第19页，共49页。2022/8/319Biochemistry Experiments常用的层析原理-亲和层析原理： 是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。专一亲和力分子对： 酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体。第20页，共49页。2022/8/320Biochemistry Experiments常用的层析原理-亲和层析第21页，共49页。2022/8/321Biochemistry Experiments常用的层

10、析原理-亲和层析第22页，共49页。2022/8/322Biochemistry Experiments常用的层析原理-凝胶过滤原理： 又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开。 物质进入凝胶柱之后有两种运动方式,垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。第23页，共49页。2022/8/323Biochemistry Experiments凝胶过滤-原理第24页，共49

11、页。2022/8/324Biochemistry Experiments凝胶过滤-原理第25页，共49页。2022/8/325Biochemistry Experiments相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。凝胶过滤-原理第26页，共49页。2022/8/326Biochemistry Experiments凝胶过滤-原理中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗

12、透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。第27页，共49页。2022/8/327Biochemistry Experiments 混合物中某一被分离成分在一定的凝胶层析柱内的洗脱，通常用分配系数(Kd)来表示。其定义为： Kd=（Ve一V0）/ Vi Ve，某一被分离物成分被洗脱时所用洗脱液的体积 Vo，凝胶颗粒间自由空间的总体积 Vi，胶颗粒内部孔穴的总容积 大分子物质，其Kd=0，小分子能全部进人胶粒内的Kd=1，中等大小分子，Kd在O1之

13、间。 凝胶过滤-原理第28页，共49页。2022/8/328Biochemistry Experiments凝胶过滤-原理 Ve - Vo Kd = Vi （1）Kd = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排阻于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相分布为0,而最先流出。 （2）当Kd = 1时,Ve = Vo + Vi,意味着该分子完全不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的比值为1,而最后流出. （3）当0 Kd 1现象说明凝胶对组分有吸附作用,此时VeVo + Vi,例如一些芳香族化合物的洗脱体积远远超出理论计算的最大值,这些化合

14、物的Kd 1如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 第29页，共49页。2022/8/329Biochemistry Experiments凝胶过滤-常用凝胶的结构和性质 常用的凝胶有：天然凝胶：琼脂糖凝胶人工合成凝胶 ： 葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶离子交换剂 聚丙烯酰胺凝胶 第30页，共49页。2022/8/330Biochemistry Experiments基本骨架是葡聚糖，以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子间主要是-1,6-糖苷键，分枝为l，3-糖苷键，以1-氯-2，3-环氧丙烷为交联剂将链壮结构连接为三维空间的网状结构的高分子化合物1葡聚糖凝胶 （Sephadex）第31页，共49页。2022/8/3

15、31Biochemistry Experiments葡聚糖凝胶- G值 调节葡聚糖和交联剂配比，可以获得网眼大小不同，型号各异的凝胶。葡聚糖分子量越小，交联剂用量越大，则交联度越大，凝胶网眼越小，吸水量越小，G值也越小。G值表示每克干胶吸水量（mL）的十倍。 例如Sephadex G-25 其吸水量应为 2.5mL/g 干胶。常用的葡聚糖凝胶有多种规格，如G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100等。实验中选用何种型号应根据被分离的混合物分子的大小及工作目的来确定。第32页，共49页。2022/8/332Biochemistry Experiments葡聚糖凝胶-型号与参数型

16、号VtV0ViG-1020.81G-1531.11.5G-25522.5G-501045G-751357G-10017610G-20030920第33页，共49页。2022/8/333Biochemistry Experiments2葡聚糖凝胶离子交换剂 在G类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制得各种葡聚糖凝胶离子交换剂 。 引入 磺乙基（SE-Sephadex） 羧甲基（CM-Sephadex） 二乙胺基乙基（DEAE-Sephadex A） 葡聚糖凝胶离子交换剂具有离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非特异性吸附很少，层析时流速易控制，特别适用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等的分离

17、纯化，以及生化制剂的除热原。 第34页，共49页。2022/8/334Biochemistry Experiments3聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶也是一种人工合成凝胶，其商品名为生物凝胶P（Bio-gel-P），其由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺通过自由基引发聚会形成聚丙烯酰胺凝胶。只要控制单体用量和交联剂的比例，就能得到不同型号的凝胶。 第35页，共49页。2022/8/335Biochemistry Experiments 根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P

18、后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度。目前，美国Bio-Rad Laboratories生产并出售多种规格的Bio-Gel P。聚丙烯酰胺凝胶-型号第36页，共49页。2022/8/336Biochemistry Experiments4琼脂糖凝胶（Sepharose） 可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量108，其结构是-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳糖相结合的链状多糖。第37页，共49页。2022/8/337Biochemistry Experiments 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝

19、胶。它的商品名因生产厂家不同而异。 瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号，即Sepharose 2B，4B和6B（同中国相同）。阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。 美国的为BioGA，有6个型号，即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。 。琼脂糖凝胶-型号第38页，共49页。2022/8/338Biochemistry Experiments 英国的称为Sagavac，又分为Sagavac 2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。

20、丹麦的称为Gelarose，有5种类型，即2，4，6%，8和10。 琼脂糖凝胶-型号第39页，共49页。2022/8/339Biochemistry Experiments 在洗脱过程中，所有组分一般都可被洗脱下来，所以装好柱后，可反复使用，无需特殊的再生处理。但多次使用后，凝胶颗粒可能逐渐沉积压紧，流速变慢。这时只需将凝胶自柱内倒出，重新填装。或使用反冲法，使凝胶松散冲起，然后自然沉降，形成新的柱床。凝胶过滤-再生和保养 第40页，共49页。2022/8/340Biochemistry Experiments生物大分子的纯化分子量测定脱盐及去除小分子杂质去热源物质 溶液的浓缩凝胶过滤-应用第

21、41页，共49页。2022/8/341Biochemistry Experiments凝胶层析法分离蛋白质- 原理 血红蛋白（Hb，分子量64480左右）与二硝基苯核黄素（分子量376）混合物，由于分子大小不同，通过Sephadex G50层析受阻滞程度有差异，从而达到分离。第42页，共49页。2022/8/342Biochemistry Experiments凝胶层析法分离蛋白质-器材层析柱（1.525ml） 等试剂1.样品液：VB2、Hb2.Sephadex G-50 第43页，共49页。2022/8/343Biochemistry Experiments凝胶层析法分离蛋白质-操作凝胶的制备与装柱： 向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的1/3时，关闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的Sephadex G-50悬液，待底部凝胶沉积12cm时，打开出口，凝胶加至凝胶沉积离层析柱口约3cm后，用35倍体积洗脱缓冲液平衡。 装柱注意点： 不得有气泡和分层； 凝胶表面应平整； 柱床体积稳定； 不能让凝胶表面露出水面。第44页，共49页。2022/8/344Biochemistry Experiments凝胶层析法分离蛋白质-操作2.加样： 将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面