微生物的生长和遗传变异课件

1、1第七章 微生物的生长和遗传变异第一节 微生物的生长及其特性第二节 微生物的遗传第三节 微生物的变异第四节 遗传工程第五节 微生物的驯化与保藏2第一节 微生物的生长及其特性一、生长与繁殖的基本概念二、微生物生长的测定方法三、微生物的生长特性四、微生物膜的生长特性3一、生长与繁殖的基本概念何谓生长？同化作用大于异化作用时，细胞质量增加，表现在细胞体积或重量的不断增加，这种现象称生长。何谓繁殖？生长一定程度后细胞分裂，这就是细菌的繁殖。个体的生长和繁殖体现为群体的生长。（微生物重量或数目的增加）。 群体生长个体生长个体繁殖在微生物学中“只有群体的重复”才更有意义，因此“生长”一般指群体生长。第一节

2、 微生物的生长及其特性4二、微生物生长的测定方法第一节 微生物的生长及其特性生理指标法计数法生物量法定量测定方法直接计数法（显微镜）间接计数法（关注：活细胞染色法、特定细胞计数法）体积法重量法（湿重法、干重法）组分法元素法呼吸强度耗氧量酶活性生物热51. 计数法（1）直接计数法（显微镜）涂片染色法： 一定量样品涂布在载玻片的已知面积内，染色后计数。滤膜染色法： 一定量样品过滤到滤膜上，然后染色计数。计数之前都需把样品预处理分散第一节 微生物的生长及其特性6计数器法: 如血球计数板法比例计数法： 将已知颗粒浓度的液体与待测菌液按一定比例混合后在显微镜下，测各自的数目。（特点：不需测量体积）第一节

3、 微生物的生长及其特性7全细胞染色法（死活不分）：DAPI染色，DTAF染色第一节 微生物的生长及其特性DNA2Cl-H2N+NH2CNHH2N -CNH2DAPI：4,6-二脒基-2-苯基吲哚（2）染色计数法OOHOOHOOHNHNNClNClDTAF：二氯三嗪基氨基荧光素8美蓝染色法（酵母活细胞计数）活细胞：无色死细胞：蓝色吖啶橙染色法（紫外显微镜）活细胞：橙色荧光死细胞：绿色荧光活细胞染色法第一节 微生物的生长及其特性9FormazanNHRNNRNRCH甲撍化合物Tetrazolium chlorideNRRNNNCl-+R四氮唑化合物（染料）四氮唑化合物（染料）染色法第一节 微生物的

4、生长及其特性10TTC：2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride）CNNNN+Cl-无色；被还原后生成红色的2,3,5-三苯基甲撍（TF）：Triphenyl formazanCNNHNN2H+HCl第一节 微生物的生长及其特性常用的四氮唑化合物（染料）11CTC : 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chlorideCTCCl-NNNNCNCN3+CN3H第一节 微生物的生长及其特性CTCFNHNNNCCNCN3CN3CTCF : CTC-formazane12双重染色法DTAF和CTC双重染色法10m第一节 微

5、生物的生长及其特性13（3）间接计数法（活菌计数法）平板计数法：根据每个活的微生物能长出一个菌落的原理设定的。 测定菌落数（注意：可培养的微生物很少） 描述：CFU（colony formation unit） 液体计数法（MPN法，most probable number法）： 又称最可能数法，是根据统计学原理设计的。 主要用于在平板培养基上不易形成菌落的菌 （硝化菌、反硝化菌、硫酸还原菌）第一节 微生物的生长及其特性14平板计数法15液膜法：过滤到滤膜上（把膜放在固体培养基上培养）适用空气或饮用水等微生物含量较低的样品。微孔滤膜不让微生物（细菌以上）通过，滤菌，将膜放在固体培养基表面培养，

6、计数类似平板计数法。16（4）特定微生物计数法平板法液体法e.g. Cr6+耐性微生物抗生素抗性菌亚硝酸菌、硝酸菌的计数FISH（荧光杂交法）Fluoreseuce In situ hybridization 16sRNA的碱基组成设计特异的探针（probe） 选择性培养基法第一节 微生物的生长及其特性17Principle of fluorescent in situ hybridization (FISH技术的原理)rRNAOligonucleotide probeFluorescence第一节 微生物的生长及其特性18FISH方法的步骤萤光标示探针(Probe)渗透rRNA細胞Hybri

7、dization萤光显微镜观察、计数第一节 微生物的生长及其特性1910mFISH法DTAF染色案例：土壤中微生物的测定微生物同视野第一节 微生物的生长及其特性202. 生物量法（1）测体积：离心或自然沉降后观察体积(粗放的方法)（2）测细胞干重：离心法、过滤法两种 105110C下干燥后称重（干重约为湿重的1020%）活性污泥浓度测定方法：MLSS（mixed liquid suspended solid）混合悬浮固体MLVSS（mixed liquid volatile suspended solid）挥发性悬浮固体 550C、2h、马福炉（3）比浊法/光密度法 OD（optical de

8、nsity）450660nm, 可见光第一节 微生物的生长及其特性21（5）细胞含氮量 细菌含氮量12.5%、酵母为7.5% 粗蛋白量6.25N量（6）DNA、蛋白质 同一微生物的DNA和蛋白质含量相对稳定， 所以可以通过测量DNA、蛋白质的量评价生物量。（7）ATP、RNA可以反映活性微生物的量（8）微生物呼吸醌类 1g活性污泥细胞平均约含1mol呼吸醌类。（4）测细胞含碳量TOC（total organic carbon）：总有机碳DOC（dissolved organic carbon）：溶解性有机碳第一节 微生物的生长及其特性22三、微生物的生长特性1、间歇培养（batch culti

9、vation）和生长曲线（growth curve）接种第一节 微生物的生长及其特性间歇培养：将少量微生物接种于一定量的液体培养基内，在一定条件下培养。培养过程不投加或取出任何东西。这种培养方式叫间歇培养。生长曲线：细胞量随时间的变化曲线称生长曲线。23时间活微生物重量生长率上升阶段生长率下降阶段内源呼吸阶段微生物生长曲线（按微生物重量绘制）第一节 微生物的生长及其特性2400时间微生物数生长速度缓慢期对数期稳定期衰亡期活菌数总菌数微生物生长曲线（按微生物数目的对数绘制）25缓慢期(亦称延滞期, lag phase）影响缓慢期长短的因素： 接种龄：种子（inoculum）处于什么生长期。 、

10、接种量：即初期微生物浓度与基质浓度的比。 培养基成分产生缓慢期的原因：缺乏分解有关基质的酶； 缺乏充足的代谢中间产物 总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数特点： 细胞形态变大 rRNA含量增高 合成代谢较活跃第一节 微生物的生长及其特性262）对数期（stationary phase） 亦称指数期（exponential phase）总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数 特点：生长速率最大，世代时间（generation time） 倍加时间（doubling time）酶系活跃、代谢旺盛细胞进行平衡生长，体内各成分最为均匀 第一节 微生物的生长及其特性细胞数（量）以指数形式增加的时间段。

11、273）稳定期（stationary phase）： 亦称恒定期、最高生长期、生长速率下降期等特点：净增长速度接近零繁殖与死亡速度几乎相等正生长与负生长几乎相等出现稳定期的原因： 营养物尤其是生长因子耗尽 营养物比例失调 代谢物的积累 pH、DO、氧化还原电位的变化第一节 微生物的生长及其特性应用：发酵产物形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量284）衰亡期（decline phase, death phase）又称内源呼吸期（endogenous respiration phase）内源呼吸：体内贮藏物质酶等一部分细胞物质的氧化特点： 细胞形态多型化 细胞会发生自

12、溶现象（autolysis） 往往产生芽孢出现衰亡期的原因： 营养物不足（代谢产物的积累） 外界条件恶化总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数第一节 微生物的生长及其特性292、连续培养（continuous cultivation）一种连续进料又连续出料的培养方式根据控制因素的不同分为恒浊连续培养（turbidostat）恒化连续培养（chemostat）进料速度保持一定第一节 微生物的生长及其特性污水处理的大部分方法都是恒化连续培养过程3031微生物生长期与废水生物处理：（活性污泥等混合微生物群，也有类似的生长曲线。) 水处理中如何避免缓慢期接种对数期或代谢旺盛的污泥增加接种量污泥驯化（以

13、后详细讲）微生物维持在对数期可获得高的处理能力，即分解速率，但处理效果 不一定好菌活力大，不易凝聚和沉淀需要充足的营养物，故得不到好的水质第一节 微生物的生长及其特性32处于稳定期污泥虽然生长速度有所下降，但有一定的代谢活性，细胞内开始积累储藏物质，絮凝沉降性能好，故传统的活性污泥法常运行在这个范围。 衰亡期只出现在某些特殊的水处理场合， 如延时曝气及污泥消化。第一节 微生物的生长及其特性33四 、 微生物膜的生长特性1. 生物膜的生长生物膜是粘附于固体表面，被微生物胞外多聚物包裹的有组织的微生物群体。第一节 微生物的生长及其特性成分： 水 （97%） 微生物 分泌物 营养物质 代谢产物 微生

14、物裂解产物34从单位固体表面积上的微生物量(mg/cm2)上看可分为6个阶段a. 延滞期b. 加速增长期c. 恒速增长期d. 减速增长期e. 安定期f. 脱落期第一节 微生物的生长及其特性微生物膜的生长模式图35微生物膜的生长过程中密度的变化随着膜厚的增加，密度也发生变化第一节 微生物的生长及其特性36（1）延滞期：细胞吸附在固体表面上的过程（沉降）影响吸附速度的因子：材质、表面性质、形状、细胞的性质、操作条件（2）加速增长期：还没有形成完整的膜（3）恒速增长期： 活性细胞量达到最大，形成完整的膜。膜表面凹凸不平。第一节 微生物的生长及其特性37（4）减速增长期： 恒速增长期与安定期的过渡期，

15、持续时间短。（5）安定期： 增长速度与脱落速度相平衡，膜量及膜厚达到最大值。（6）脱落期： 外因：流体的剪切力 内因：微生物的死亡、气泡的形成，细胞外高分子量的变化。第一节 微生物的生长及其特性382. 生物膜的特性 有效膜厚生物膜并不是全部有活性基质的扩散细胞的死亡70200m（平均100 m），并不是越厚越好。第一节 微生物的生长及其特性39生物膜菌群的空间分布的测定试验方法荧光原位杂交技术（FISH） 激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）用途：荧光信号的定位检测和定量分析。名称EUB338NONNso190NIT3序列5-3GCT GCC TCC CGT AGG AGTACT CCT ACG

16、 GGA GGC AGCCGA TCC CCT GCT TTT CTC CCCT GTG CTC CAT GCT CCG特异性大部分细菌(Domain bacteria）不和任何细菌杂交氨氧化细菌（-subgroup ammonia oxidizing bacteria）硝化细菌（Nitrobacter spp.）荧光颜色试验所用荧光探针的性质40生物膜内微生物总体的空间分布生物膜载体水相z0硝化菌群主要存在于厚度为2035m左右的表层硝化菌群沿生物膜厚度（z方向）的分布情况生物膜厚度约为80120m左右41第七章 微生物的生长和遗传变异第二节 微生物的遗传遗传的物质基础及其存在形式遗传物质的

17、复制遗传信息的传递和表达基因表达的调控42 遗传性：亲代性状在子代重现，使其子代的性状与亲代基本上一致的现象。一、遗传的基本概念第二节 微生物的遗传遗传具有保守性优点：保障优良性状稳定遗传缺点：环境变化无法适应而死亡43第二节 微生物的遗传同其他生物一样，微生物有其固有的遗传性。微生物的遗传是在系统发育过程中形成的，系统发育愈久的微生物，其遗传的保守程度愈大，越不易受外界环境条件的影响。老龄菌遗传保守程度比幼龄菌大，高等生物遗传保守程度比低等生物大。44第二节 微生物的遗传金丝猴的后代仍然是金丝猴与遗传有关的俗语或谚语有哪些？1.种瓜得瓜，种豆得豆；2.龙生龙，凤生凤， 老鼠儿子会打洞；3.虎

18、父无犬子；45二、遗传的物质基础及其存在形式遗传的物质基础 一切生物遗传的物质基础是核酸（DNA or RNA） 核酸的结构：双螺旋结构2. 遗传物质在细胞内存在部位和方式（1）细胞水平DNA集中在拟核中。（真核微生物：细胞核）杆菌细胞内大多存在两个拟核，而球菌一般只有一个。第二节 微生物的遗传46（2）细胞核水平原核微生物：无核膜包裹，呈松散无定型状态，染色体 中DNA不与蛋白质结合。真核微生物：有核膜，DNA与蛋白质结合。核外染色体（能自主复制）：广义上讲称质粒（plasmid）第二节 微生物的遗传47（3）染色体水平原核微生物：每一个核质体中只有一个裸露的、在光学 显微镜下无法看到的环状

19、染色体。真核微生物：往往有不同数目的染色体。 酵母菌属（saccharomycs）17个。染色体的套数：只有一套相同功能的染色体时称之为 单倍体，有两套时称双倍体。（4）核酸水平绝大多数的微生物的遗传物质为DNA，只有部分病毒才是RNA。第二节 微生物的遗传48蓝藻细菌动植物噬菌体流感病毒艾滋病毒烟草花叶病毒如流感病毒、爱滋病病毒、烟草花叶病毒等以RNA为遗传物质仅含RNA的生物：含DNA的生物：以DNA为遗传物质如真核生物、原核生物和只含DNA的病毒等49（5）基因水平（功能单位）基因：一切具有自主复制能力的遗传功能单位。是一核酸片段，长度一般为1000bp（碱基对），是最小的遗传单位，包括

20、调控序列，转录序列和其它在该基因表达过程中起作用的序列。基因的分类调节基因（regulator）：控制结构基因的活性结构基因（structure gene）：表达非调控因子的基因第二节 微生物的遗传50第二节 微生物的遗传原核基因（上）和真核基因的结构（下）结构基因调节基因51第二节 微生物的遗传单顺反子：一个基因产物受到一套调控蛋白和调控序列的调控，大部分基因通过这种方式调控。多顺反子：多个基因产物受到一套调控蛋白和调控序列的调控，编码这些基因产物的序列往往是相邻的，且是完成某一功能所需的一系列蛋白，微生物特有。微生物基因组中的多顺反子常被称为操纵子启动基因（promotor）操纵基因（op

21、erator）结构基因（structure）操纵子（operon）大肠杆菌的乳糖(Lactose)操纵子: 包括降解乳糖所需的3个酶，由 基因lacZ, lacY和lacA编码所得 。看看大肠杆菌是如何调控自身对培养基中的乳糖的利用5253 遗传密码：DNA上各个核苷酸的特定排列顺序。 每个密码子由3个核苷酸顺序来决定。（7）核苷酸水平核苷酸腺嘌呤A鸟嘌呤G胞嘧啶C胸腺嘧啶T或尿嘧啶U戊糖碱基磷酸核苷（6）密码水平（信息单位）（最低交换单位、突变单位）第二节 微生物的遗传脱氧核糖磷酸碱基54細胞染色體蛋白質基因ATGC55质粒（plasmid）定义：游离于染色体外，具有独立复制能力的小型共价闭

22、合环状DNA分子，即cccDNA (circular covalently closed DNA)。仅发现于原核生物和真核生物中的酵母。结构：环状、超级螺旋结构和线形，分子量106108道尔顿(10010000kbp)第二节 微生物的遗传5657质粒的基本特性：可移动性：异种间转移Genther F. J.(1998): 69种环境中的细菌中，38能从实验室的细菌接受R因子。可整合性：可整合到染色体上可重组性：质粒之间，质粒和染色体之间可消除性：不影响宿主的生存，失去质粒控制的表现型性状第二节 微生物的遗传5820世纪50年代在日本发现的一种质粒（从患痢疾但被抗生素治疗后的病人中分离出的痢疾志

23、贺氏菌中），而且能把抗药性转移到E.coli。1）R因子R质粒（resistance plasmid，耐药性质粒）沙门氏菌属（Salmonalla）芽孢杆菌属（Bacillus）假单胞菌属（Pseudomonas）葡萄球菌属（Staphulococcus）曾发现R因子的细菌 R因子在细胞中的数目12几十个。 对多种抗生素有抗性。 具有R因子的细菌在自然界中的存活率高。第二节 微生物的遗传592）F因子（Fertility factor）/致育因子、性因子是E.coli中决定性别的质粒。62106Da，94.5kbpF+F+F+F -接合（conjugation）特点：有时能够插入染色体，使染色

24、体的长度增长。有F因子的细菌：F+ 雄菌没有F因子的细菌： F - 雌菌第二节 微生物的遗传603）降解性质粒二甲苯质粒：XYL（Xylene）辛烷质粒：OCT（Octane）甲苯质粒：TOL（Toluene）萘质粒：NAP（Napthalene）樟脑质粒：CAM（Camphor）水杨酸质粒：SAL（Salicylate）在环保中有重要的意义：超级工程菌的获得。含有能降解复杂物质的基因，从而使细菌能降解难降解有机物。大多在假单胞菌属中发现。 至今发现的主要降解质粒（以其所能分解的底物命名）第二节 微生物的遗传614. 细胞器DNA真核微生物中，染色体之外的遗传物质的另一种存在形式。与其他物质一

25、起构成细胞器（如：叶绿体、线粒体等）主要特性：结构复杂多样功能不一数目多少不一自我复制可消除性（一旦消失，后代细胞中不再出现）质粒和细胞器DNA的异同点？第二节 微生物的遗传625. 转座因子可在染色体不同部位之间移动的DNA片断插入序列：能插入染色体或质粒的许多位点，并能改换位点转座子：能插入染色体或质粒的不同位点的一般DNA序列，可以转移到不同的位点上，本身也可复制。大小位几个kb。第二节 微生物的遗传63第七章 微生物的生长和遗传变异第三节 微生物的变异基因突变基因重组64变异：任何一种生物，亲代和子代之间在生理、形态方面都有一定的差异，这种现象叫变异（个体形态、菌落形态、生理生化特性、

26、代谢产物）第三节 微生物的变异一、变异的基本概念“一龙生九子，九子各不同”65细菌易变异：细菌繁殖快，又与外界环境接触面积大环境条件在短时期内对菌体产生大的影响，在受物理、化学因素影响后，易产生适应新环境的酶（诱导酶）等，从而改变原有的特性，即产生了变异。变异形态变异菌落形态变异生理生化特性变异变异不一定都有遗传性第三节 微生物的变异66有目的地控制微生物的生长条件，使其向人类需要的方向变异。在污水生物处理中称为驯化（acclimation、adaption）有毒有害废水、难降解废水处理：通过驯化，增强微生物的降解能力，提高处理效果。定向培育：第三节 微生物的变异67二、基因变异基因突变基因重

27、组基因突变（自发突变） 定义：DNA链上因碱基的缺乏、置换、插入而发生的碱基排列顺序的变化，从而导致表现型发生了可遗传的变化，这种现象叫基因突变。基因突变的类型点突变畸变第三节 微生物的变异68点突变：一个或数个碱基发生变化点突变碱基置换移码突变转换： AG,GCTT,T颠换AACC,G缺失：添加：ABCABCABCABCAAXBCAB第三节 微生物的变异嘌呤变嘌呤嘧啶变嘧啶嘌呤变嘧啶嘧啶变嘧啶69畸变缺失：添加易位：倒位：重复：插入：abcabcabcabcabcabcdefpqrdefpqrghighifdeghijkl畸 变：碱基片断发生变化第三节 微生物的变异70细菌基因突变的特点 无

28、定向性（不对应性） 稀有性：频率低 1051010 自发性 独立性：各细胞、基因间的变异没有必要的联系 稳定性：可遗传 可逆性：回复突变（back/reverse mutation） 诱变性：诱变剂可大大提高突变率（10105倍）自发突变、诱发突变（诱变） 诱变剂（mutagen）：亚硝酸、紫外线第三节 微生物的变异711）转化（transformation）供体的DNA片段（可在自然条件下产生）进入受体细胞内发生重组，受体细胞获得供体细胞的一部分遗传特性。无需细胞接触。细菌、放线菌、真菌中有转化现象。2、基因重组定义：两个不同性状的个体细胞（细胞水平），其中一个细胞（供体）DNA与另一个细胞

29、的DNA融合，使基因重新排列遗传给后代，产生新的遗传性状，称基因重组。 第三节 微生物的变异7274细胞核质粒F因子、降解性质粒可通过此形式传递。2）接合（conjugation ) 细胞直接接触而进行的基因重组。 大肠杆菌的接合是通过性纤毛（中空）进行的。第三节 微生物的变异75763）转导（transduction）通过噬菌体携带而转移的基因重组，无需细胞接触。在自然界中比较普遍。噬菌体进入供体细胞宿主的核染色体被切断成熟与包装之际形成不带噬菌体自身DNA的噬菌体（假噬菌体）（完全缺陷噬体）与受体接触感染a. 完全转导(complete transduction)第三节 微生物的变异78b

30、. 局部转导(specialized transduction)由部分缺陷的噬菌体把少数特定的基因携带到受体菌中，并获得转导的现象。4）原生质体融合（protoplast fusion）通过人为的方法使两个遗传性状不同的细胞的原生质体发生融合，得到同时具有双亲性状的、遗传稳定的融合子（fusion），该过程称原生质体融合。（20世纪70年代）第三节 微生物的变异79原核、真核高等植物、人体细胞 能进行原生质体融合的细胞非常广泛步骤：用脱壁酶去除细胞壁混合（加聚二醇PEG），或电脉冲促进融合培养，使之成为完整细胞鉴定特点：1）重组频率10-1.（远远大于诱变育种） 2）不同属、科间亦可融合。第三

31、节 微生物的变异8081第七章 微生物的生长和遗传变异第四节 遗传工程基因工程遗传工程及其在环境污染控制中的应用82一、基因工程（Genetic engineering）20世纪50年代遗传物质的研究20世纪70年代基因工程诞生1. 定义：用人为的方法把供体生物的DNA导入受体生物中，并在其中“安家落户”，进行正常的复制、表达，从而获新物种的一种育种技术。是一种分子水平上的基因重组技术。第四节 遗传工程83用人为的方法，把供体生物的DNA大分子提取出来； 在离体的条件下，用工具酶进行切割；之后把它与载体（vector）的DNA分子连接起来； 然后与载体一起导入受体生物。2. 步骤：第四节 遗传工程84目的基因的取得： 供体细胞中提取分离 合成载体的选择：对载体的要求 具有自我复制能力； 能在受体细胞内大量增殖； 最好只有一个限制性内切酶的切口（使供体DNA接合在一定位置上）； 有一种选择性遗传标志，以便追踪。常用载体：细菌质