细菌感染的实验室诊断课件

1、第三章 细菌感染的病原学诊断第一节 标本的采集和处理原则一、标本采集的一般原则1.早期采集2.无菌采集 无菌部位:严格无菌操作有正常菌群部位：明确目的菌；选择合适的选择培养基3.采用不同方法采集需氧菌或兼性厌氧菌厌氧菌：穿刺法采集4.采集适量标本和适当标本采集有明显病变的标本根据病程采集不同的临床标本5.安全采集二、标本的处理1.及时送检2.运送与保存 1）根据待检菌特点对标本进行冷藏、保 温或保持厌氧状态 2）注意安全防护第二节 细菌形态学检查显微镜种类1.普通光学显微镜（light microscope） 光源：可见光2. 暗视野显微镜（ darkfield microscope ） 暗背

2、景，菌体发光用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察3. 相差显微镜 检查不染色活细菌的形态及某些内部结构4. 荧光显微镜 光源：100W200W的高压汞灯5. 电子显微镜 光源：电子流透射电镜：观察细菌内部超微结构扫描电镜：对细菌表面结构及附件观察 一、 不染色标本的检查常用方法压滴法悬滴法毛吸管法 用于检查厌氧菌动力用途动力试验检查细菌有无动力制动试验鉴定血清型三、 染色标本的检查（一）常用染料色基：决定染料的颜色助色基：决定染料的酸碱性1. 碱性染料电离后色基带正电荷细菌染色常用，如美蓝、结晶紫、碱性复红等2. 酸性染料用于细胞浆染色，如伊红、酸性复红、刚果红3. 复合染料（中性染

3、料）碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染料、姬姆萨染料等4. 单纯染料如苏丹染料，溶于脂肪溶剂，不溶于水，化学亲和力低（二）常用的细菌染色法单染色法只用一种染料，如吕氏美蓝复染色法用两种或两种以上不同颜色的染料 细菌染色的一般程序1. 涂片2. 干燥：自然干燥为好3. 固定4. 初染5. 媒染 媒染剂6. 脱色 脱色剂7. 复染1. 革兰染色法（Gram stain）（1）原理1）细胞壁学说：两种细菌细胞壁通透性不同 2）等电点学说3）化学学说：两种细菌含有RNA镁盐不同（2）方法：制片结晶紫初染碘液媒染酒精脱色复红复染结果 革兰阳性菌G：紫色 革兰阴性菌G：红色（3）影响染色结果的因素1）操

4、作技术：涂片和脱色2）染色液：3）细菌：1824h培养物为好（4）意义:1）鉴别细菌2）选择药物3）与致病性有关 2. 抗酸染色法细菌着色后不被盐酸酒精脱色的染色方法染料：石炭酸复红、盐酸酒精、美蓝方法 初染：5%石炭酸复红加热染色5min 脱色：3%盐酸酒精 复染：吕氏美蓝3.荧光染色 金胺O法4.特殊染色法细胞壁染色、荚膜染色、芽胞染色、 鞭毛染色、异染颗粒染色5.负染法 背景着色 肺炎链球菌荚膜染色 墨汁负染法芽胞染色第三节 细菌分离培养和鉴定一、培养基的种类和选择培养基（culture medium） 由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。（一）培养基的组成成分

5、1. 营养物质碳源、氮源、无机盐、水、生长因子（1）蛋白胨 提供氮源 植物胨: 大豆 动物胨：牛肉、动物组织等（2）肉浸液 碳源、氮源（3）牛肉膏 氮源（4）糖（醇）类 碳源和能源（5）血液 提供特殊生长因子、观察溶血（6）无机盐类常用元素：P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe等微量元素：Co、Zn、Mn、Cu、Mu等（7）鸡蛋与动物血清用于某些特殊培养基（8）生长因子维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等2.凝固物质 即赋形剂（1）琼脂（2）明胶 动物胶原组织熬制而成3. 抑制剂和指示剂（1）抑制剂：胆盐、煌绿、染料、抗生素等选择培养基：加入一定种类的抑制剂，以抑制杂菌生长或减少生长，有利于检出菌生长的

6、培养基。（2）指示剂： 酚红、中性红、中国蓝等 鉴别培养基：加入特定底物和指示剂（二）培养基的种类1.按培养基的物理性状（1）液体培养基：增菌（2）固体培养基：纯化，增菌（3） 半固体培养基：动力检测，保种 液体培养基 固体斜面培养基 半固体培养基2. 按营养成分和用途分类（1）基础培养基：只有基本营养成分（2）营养培养基：加有血液 、血清等（3）鉴别培养基：含有特定底物和指示剂（4）选择培养基：含有抑制剂（5）特殊培养基：厌氧、细菌L型（三）培养基的选择1.血平板 最常用2.巧克力血平板 奈瑟菌属、流感嗜血杆菌3.肠道选择培养基 分离肠道细菌 常用中国蓝、EMB、MAC、SS4.碱性琼脂或T

7、CBS 分离霍乱弧菌5.血液增菌培养基 血液、骨髓增菌用6.营养肉汤 增菌用（四）培养基的制备1. 常用各种器具灭菌前的准备（1）培养皿：用纸包裹（2）试管：加塞后用纸包好（3）吸管和毛细管（4）烧瓶2. 培养基制备的一般程序（1）调配 根据培养基组成，准确称取各组分，先加需要蒸馏水的一部分，再加培养基干粉，最后补足水量。（2）溶化 液体培养基不需加热 （3）调整pH值 一般7.27.6（4）过滤澄清（一般可以省略）液体培养基： 滤纸固体培养基： 纱布 （5）分装 平板：灭菌后冷却至50 60时倾倒 90mm 2530ml（4mm）：药敏用 90mm 1315ml(3mm)：培养用琼脂斜面：分

8、装量为试管的1/41/3，灭菌后趁热制成斜面，斜面长度2/3高层、半固体、液体：分装量为试管长度1/42/3 （ 6）灭菌高压蒸汽灭菌 无糖：103.4kPa 121.31530min含糖： 68.4kPa 115 15min流动蒸汽灭菌法 血清、牛乳、鸡蛋间歇蒸汽灭菌法（7）鉴定无菌试验：将制好的培养基在35孵育过夜，判定是否灭菌合格。效果检查：按不同的培养要求，接种相应菌种，观察细菌的生长状况，判断培养基是否符合要求。（8）保存 4 冰箱保存，一周左右 注意事项1. 器皿 中性硬质玻璃器皿2. 化学药品 化学纯以上3. 准确称量，正确溶解4. 准确测定培养基酸碱度5. 保持澄清6. 灭菌时

9、间不宜过长，不宜反复灭菌二、分离培养（一）细菌的分离1.无菌技术是防止微生物进入物品和机体，同时防止被检物中可能存在的病原微生物污染周围环境及工作人员的规范化操作技术。2.操作要点左手负责持平皿、试管等物品右手持接种工具取菌并划种3.移种或接种的基本步骤（1）右手持接种工具，在火焰上烧灼灭菌。（2）左手拿起标本盒或平皿、试管等。（3） 用接种工具挑取适量标本或细菌。（4）根据目的选择不同的接种方法（5） 接种完毕，在火焰上烧灼接种工具，放回原处。4.常用的接种方法（1）平板划线法分区划线法 用于杂菌量较多的标本连续划线法 用于杂菌不多的标本（2）琼脂斜面接种法纯培养（3）穿刺法观察细菌动力（4

10、）液体培养基接种法 增菌（5）倾注平板法计数细菌数量（6）涂布法 纸片法药敏试验（二）细菌的培养方法1.需氧培养法 普通培养2.二氧化碳培养（1）二氧化碳培养箱（2）烛缸法（3）化学法3.厌氧培养（三）细菌的生长现象1.固体培养基上的生长现象菌落：单个细菌在培养基上分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团。CFU：菌落形成单位，活菌计数用细菌菌落的描述 大小、形状、突起或扁平、边缘、颜色、表面、透明度（1）光滑型菌落（S型菌落）表面光滑、湿润、边缘整齐（2）粗糙型菌落（R型菌落）表面粗糙、干燥、边缘不齐（3）粘液型菌落（M型菌落）菌落粘稠、有光泽、似水珠样 卷发样菌落 粗糙型菌落（L-J）粘液型菌落2

11、.液体培养基中的生长情况表面生长 均匀混浊生长 沉淀生长 三、细菌生化反应鉴定（一）碳水化合物的代谢试验1. 糖（醇、苷）类发酵试验原理 各种细菌酶系不同，分解糖（醇、苷）的能力各异，产物也不同。培养基 单糖、双糖、三糖、多糖应用 肠道杆菌科细菌的鉴定 Sugar Fermentation 2. 葡萄糖氧化/发酵试验（O/F）原理 氧化型 专性需氧菌 发酵型 产碱型 不分解葡萄糖 培养基 Hugh-Leifson二氏培养基结果 氧化管 发酵管 氧化型 变黄 不变 发酵型 变黄 变黄 产碱型 不变 不变 （阴性） 应用 鉴别肠杆菌科细菌与非发酵菌3. -半乳糖苷酶（ONPG ）试验原理 ONPG

12、无色，经-半乳糖苷酶水解后生成黄色的邻硝基酚方法（1）在含ONPG的培养基中接种纯种细菌（2）制成菌悬液，加入甲苯，再加ONPG试剂结果 阳性：变黄（2030min）应用 迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定4. 七叶苷水解试验原理 葡萄糖七叶苷 七叶素+Fe2+ 黑色化合物培养基 七叶苷、胆汁七叶苷培养基结果 阳性：培养基变黑用途 鉴别肠球菌、G-杆菌及厌氧菌 5. 甲基红（methyl red MR）试验原理葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇 甲基红 -葡萄糖丙酮酸 各种酸 甲基红 +培养基 葡萄糖蛋白胨水结果 阳性：红色 阴性：黄色 应用 鉴别肠杆菌科细菌 6. VP（Voges-Proskauer）试验原

13、理葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇 二乙酰肌酸 萘酚红色化合物 培养基 葡萄糖蛋白胨水结果 阳性：红色应用 鉴别肠杆菌科细菌（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验1.明胶液化试验原理：某些细菌可产生明胶酶，分解明 胶，使其失去凝固能力。方法：将待检物接种于明胶培养基22 培养7天结果：培养基呈液化状态为阳性应用：肠杆菌科细菌鉴别2. 吲哚（indol）试验原理色氨酸吲哚玫瑰吲哚 吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛）培养基 蛋白胨水培养基结果 阳性：红色 3. 硫化氢试验原理含硫氨基酸 H2S+硫酸亚铁FeS黑色 醋酸铅 PbS黑色培养基 醋酸铅培养基结果 阳性：黑色沉淀用途 肠杆菌科菌属间的鉴定 4. 尿素分解试验

14、原理尿素 NH3+CO2+H2O (NH4)2CO3培养基尿素肉汤或尿素琼脂培养基结果 阳性：红色用途 肠杆菌科中变形杆菌的鉴定 5. 苯丙氨酸脱氨酶试验原理苯丙氨酸 苯丙酮酸+10%氯化铁 绿色化合物培养基 苯丙氨酸琼脂培养基 结果 阳性：绿色用途 肠杆菌科中变形杆菌的鉴定 6. 氨基酸脱羧酶试验原理氨基酸 胺+ CO2 培养基变碱培养基 氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照结果 阳性：紫色 阴性：黄色用途 肠杆菌科细菌鉴定（三） 碳源和氮源利用试验1. 枸橼酸盐利用试验原理铵盐 碳酸钠+氨培养基 枸橼酸盐培养基结果 阳性：蓝色 阴性：绿色2.丙二酸盐利用试验利用枸橼酸盐生长 + 不能利用 - I

15、MViC试验I - 吲哚（indol）试验M - 甲基红（methyl red）试验V - VP（Voges-Proskauer）试验C -枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验 I M Vi C试验 大肠埃希菌 + + - - 产气杆菌 - - + + （四） 各种酶类试验1. 氧化酶试验原理方法 菌落法 滤纸法 试剂纸片法 结果 深紫色为阳性2. 过氧化氢酶试验3. 硝酸盐还原试验4. 脂酶试验5. 卵磷脂酶试验6. DNA酶试验7. 凝固酶试验8.CAMP试验9. 胆汁溶菌试验（五）抑菌试验1.O/129试验用于弧菌科的属间鉴别2.杆菌肽试验用于A群链球菌与其他链球菌

16、间的鉴别3.奥普托欣试验用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别第四节 细菌的非培养检测方法一、免疫学检测利用抗原、抗体特异性结合的原理，用已知抗原检测未知抗体，或用已知抗体检测未知抗原。（一）抗原检测1. 凝集反应直接凝集、间接凝集、SPA协同凝集试验2.免疫荧光技术用荧光标记抗体，显微镜观测结果3.酶联免疫吸附技术用酶标记抗体，根据颜色变化判断结果反向间接血凝试验免疫荧光技术1.直接法：荧光素标记抗体2.间接法：荧光素标记二抗（抗抗体）3.免疫荧光 菌球法酶联免疫吸附试验-ELISA1. 双抗体夹心法2. 竞争法 阳性-无色（二）抗体检测用已知的细菌或其特异性抗原检测病人 血清中有无相应抗体及其效

17、价的动态变 化，辅助诊断某些传染病。二、分子生物学检测（一）核酸杂交来自两个不同个体的单链DNA 相互结合成互补的DNA双链的过程（二）聚合酶链反应（PCR）是一项简便、快速的特异性DNA体外扩增技术（三）生物芯片技术常用的芯片：基因芯片、蛋白质芯片三、细菌毒素的检测（一）内毒素1.内毒素的致热作用（体内实验）原理：内毒素产生于G-菌，菌体死亡后释放，作用于体温调节中枢，引起发热。方法：（1）将家兔分成两组，每组4只，测量基 础体温并记录。（2）用无菌注射器抽取待检物注入一组家兔耳静脉，另一组注射等量生理盐水。（3）观察动物反应，并间隔30min测量两组家兔体温。结果 ：阳性 试验组体温升高

18、对照组体温正常应用：无菌的生物制品2.鲎试验（体外实验）原理：鲎血液中含有一种变形细胞，此细胞裂解物可与微量内毒素起凝胶反应，即细胞裂解物中的一种酶被激活，使细胞裂解物中的蛋白质形成凝胶。鲎试剂：鲎变形细胞裂解物方法（1）打开3支鲎试剂安瓶，各加0.1ml无菌蒸馏水使之溶解，同时编号。（2）向3支安瓶中分别加待测物、标准内毒素、无热原生理盐水各0.1ml。（3）轻轻摇匀，垂直放37 水浴，1530min后观察结果。鲎试验结果- 不形成凝胶+ 形成凝胶，但不牢固+ 形成牢固凝胶，倒持安瓶凝胶不动。应用鲎试验（二）外毒素1.体内毒力试验原理：细菌外毒素对机体具有强烈毒性 作用，但可被相应抗毒素中和，中和后， 实验动物不产生中毒