抗生素发酵生产工艺AntibioticsFermentationProduction

1、抗 生 素 发 酵 生 产 工艺Antibiotics Fermentation Production鲁东大学生命科学学院1. 概述 Introduction抗生素是次级代谢产物中的一大类。1）初级代谢和次级代谢的关系(1)、存在范围及产物类型不同(2)、对产生者自身的重要性不同初级代谢与初级代谢的关系：(1)、存在范围及产物类型不同(2)、对产生者自身的重要性不同(3)、同微生物生长过程的关系明显不同初级代谢自始至终存在于一切生活的机体中，同机体的生长过程呈平行关系；次级代谢则是在机体生长的一定时期内（通常是微生物的对数生长期末期或稳定期）产生的，它与机体的生长不呈平行关系，一般可明显地表现

2、为机体的生长期和次级代谢产物形成期二个不同的时期。初级代谢与初级代谢的关系：(1)、存在范围及产物类型不同(2)、对产生者自身的重要性不同(3)、同微生物生长过程的关系明显不同(4)、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同初级代谢产物对环境条件的变化敏感性小（即遗传稳定性大），而次级代谢产物对环境条件变化很敏感，其产物的合成往往因环境条件变化而停止。初级代谢与初级代谢的关系：1、存在范围及产物类型不同2、对产生者自身的重要性不同3、同微生物生长过程的关系明显不同4、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同(5)、相关酶的专一性不同相对来说催化初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢

3、产物合成的某些酶专一性不强，因此在某种次级代谢产物合成的培养基中加入不同的前体物时，往往可以导致机体合成不同类型的次级代谢产物，另外，催化次级代谢产物合成的酶往往是一些诱导酶，它们是在产生菌对数生长末期或稳定生长期里，由于某种中间代谢产物积累而诱导机体合成的一种能催化次级代谢产物合成的酶，这些酶通常因环境条件变化而不能合成。初级代谢与初级代谢的关系：(1)、存在范围及产物类型不同(2)、对产生者自身的重要性不同(3)、同微生物生长过程的关系明显不同(4)、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同(5)、相关酶的专一性不同(6)某些机体内存在的二种既有联系又有区别的代谢类型初级代谢是次级代谢

4、的基础，它可以为次级代谢产物合成提供前体物和所需要的能量；初级代谢产物合成中的关键性中间体也是次级代谢产物合成中的重要中间体物质。而次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续与发展，避免初级代谢过程中某种（或某些）中间体或产物过量积累对机体产生的毒害作用。2）次级代谢在微生物生长中的作用富集营养例：大肠杆菌，铁缺乏，产肠道杆菌素离子载体类抗生素：富集碱金属入侵宿主例：水稻叶枯菌，蛇孢菌素苏云金芽孢杆菌：核苷酸类外毒素3）抗生素类型根据抗生素的作用机制分类 ：抑制细胞壁合成 (Cell Wall Synthesis) ： 青霉素抑制细胞膜功能 (Cell Membrane Damage) ：多烯类抗

5、生素抑制蛋白质合成 (Protein Synthesis) ： 四环素抑制核酸合成 (Nucleic Acid Synthesis) ： 丝裂霉素根据抗生素的化学结构分类-内酰胺类 (-lactam)： 青霉素类头孢菌素类 氨基糖苷类 (aminoglycosides) ： 链霉素、庆大霉素大环内酯类 (macrolides) ： 红霉素、麦迪加霉素四 环 类 (tetracyclines) ：四环素、土霉素多 肽 类 (polymyxin) ： 多粘菌素3）抗生素类型 2. 抗生素代谢调控机制1）抗生素合成酶诱导抗生素一般在微生物生长的对数期以后开始合成，酶是诱导产生的诱导物质在微生物生长末

6、期加入有效，在菌体生长期和抗生素合成期加入无效。次级代谢酶的合成和微生物生长速率有关。例：麦角碱，色氨酸或色氨酸结构类似物诱导2）抗生素合成酶的阻遏与抑制合成酶阻遏初级末端代谢产物抑制 发生在转录或转译级别例：杀念珠菌素（转录，灰色链霉菌），以乙酸、丙酸为前体，合成酶催化，48h产生3）分解代谢物阻遏碳源阻遏不是本身的直接抑制，由于较易利用，刺激了微生物生长例：新生霉素：柠檬酸、葡萄糖橙黄芽孢杆菌：甘油、淀粉，橙色菌素可以采用流加技术控制碳源浓度不刺激微生物生长范围内3）分解代谢物阻遏氮源阻遏红霉素，受氮源抑制杀念珠菌素，豆饼水解液尽量选择较难利用的氮源例：链霉素发酵，脯氨酸作唯一氮源，大幅提

7、高产量黄豆饼粉较常用4）磷酸盐调节磷酸盐是抗生素生产菌生长限制养分无机P浓度超过10mmol/L时，抗生素合成受到抑制无机P促进初级代谢，抑制次级代谢例：四环素、杀念珠菌素、万古霉素无机P抑制刺激代谢物的诱导物（前体）的合成麦角碱的诱导物色氨酸，二甲烯基丙基色氨酸合成酶 3. 抗生素生产工艺1）菌种放线菌、霉菌、细菌减少传代次数，减少变异几率液氮、真空冷冻干燥保藏基因工程育种2）孢子制备孢子培养基5-7d3）种子制备孢子发芽，繁殖获得足够数量的菌丝一级种量：0.1-0.2%二级：5-20%4）培养基碳氮源前体磷酸盐培养基质量5）发酵目的：大量合成抗生素接种量10%以上过程控制6）发酵液预处理目

8、的：调整发酵液理化性质，除杂、除菌体无机离子：钙、镁、铁蛋白胶体：等点、加热、絮凝7）抗生素提取及精制时间短、温度低、合适pH、环境消毒方法：溶媒法、离子交换法脱色去热源结晶 4. 青霉素生产工艺（实例）青霉素V和G临床应用母环：缬氨酸、半胱氨酸、-氨基己二酸1）青霉素生物合成机制碳源调节葡萄糖分解代谢物阻遏氮源调节铵根离子阻遏赖氨酸调节-氨基己二酸2）青霉素生产菌种1929年弗莱明，点青霉 发酵单位 2U/ml1943年美国，产黄青霉 发酵单位 120U/ml，产黄色素目前，发酵单位85000U/ml，绿色和黄色孢子两种菌期初称菌丝生长期，产生青霉素较少，而菌丝浓度增加很多；期适于作发酵用种

9、子； 期称青霉素分泌期，此时菌丝生长趋势逐渐减弱，大量产生青霉素；在期末、期初即应放罐；期即菌丝自溶期，菌体开始自溶。冷冻管斜面母瓶孢子培养25，67d放罐发酵罐一级种子罐大米孢子孢子培养25，67d种子培养25，4045 h，1:2VVM二级种子罐种子培养25，1315 h，1:1.5VVM发酵2226，67d，1:10.8VVM冷至15至提炼3）青霉素生产工艺工 艺 流 程 图种子制备按菌丝形态分为丝状菌和球状菌工厂一般采用绿色丝状菌深度保藏：沙土管斜面（葡萄糖、甘油、蛋白胨），25，培养6-7d液体种子（培养基：葡萄糖、乳糖及玉米浆），27 ，40h，菌丝浓度40%。种子质量控制：菌丝稠

10、密、丝团少，菌丝粗壮、有中小空泡，处于生长第-期。碳源氮源前体无机盐目前普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液进行流加。可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸子粉，并补加无机氮源。为生物合成含有苄基的青霉素G，需在发酵中加入前体苯乙酸或苯乙酰胺。采用多次加入方式。硫、磷、钙、镁、钾等盐类。发酵培养基加糖控制补氮及加前体pH控制温度控制通气和搅拌泡沫和消泡一般在残糖将至0.6左右，pH上升时开始加糖。加硫酸铵、氨水或尿素，使发酵液氮源控制在0.010.05。补前体以使发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0.050.08。加酸或碱自动控制pH，一般为6.46.6。一般前期2526，后期23，以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。抗生素深层培养需要通气与