临床免疫学与检验：第十七章 补体参与的反应及补体测定

1、第十七章 补体参与的反应及补体测定 补体（complement,C）是存在于正常人及脊椎动物血清中的一组与免疫相关并可被激活的蛋白质。它包括近40种可溶性蛋白和膜结合蛋白，所以又称为补体系统（Complement system）。 在正常生理情况下，多数补体成分以非活化形式存在，补体主要的激活途径有：经典激活途径(claasical complement pathway)旁路激活途径(alterlative complement pathway) 在激活过程中可产生多种生物活性物质，引起机体的一系列生物学效应。第一节补体参与的反应一、免疫溶血试验二、补体结合试验 三、补体依赖的细胞毒试验 四、

2、免疫粘附试验 一、免疫溶血试验免疫溶血试验的原理是补体能使已被抗体致敏了的红细胞发生溶血。实验时将三者混合，置3730min，如条件适合溶血即可发生。（一）参与免疫溶血反应的试剂1、补体 2、绵羊红细胞 3、溶血素 1、补体实验室多采用新鲜混合豚鼠血清作为补体的来源。补体在体外极易失活，因此采血后需及时分离血清，及时使用，最好在当天用完，必须保存时需小量分装，置20可保存数月（避免反复冻融），如为冻干制品可保存数年，但其活性都会有所降低。使用前需滴定其效价。2、绵羊红细胞在免疫溶血反应中所用的抗原为绵羊红细胞（SRBC）。可用Alsever液（主要成分为枸橼酸钠、枸橼酸和葡萄糖）保存于4三周。

3、用前以生理盐水洗涤三次，配成试验中所用的2%5%的悬液。配制好后在542nm波长比浊，读取吸光度，按该吸光度值调节每次试验所用的红细胞浓度，使之保持一致。3、溶血素即抗绵羊红细胞抗体，多数是兔抗绵羊红细胞血清。一般没有必要用纯化抗体，试验前需经56、30min灭活补体。由于免疫溶血试验的结果与所用溶血素的多少有关，因此在试验前必需用免疫溶血试验滴定溶血素效价。免疫溶血试验滴定溶血素效价操作如下（1）稀释缓冲盐溶液磷酸缓冲盐溶液或巴比妥缓冲盐溶液均可用于免疫溶血试验，pH值的范围在7.27.4之间，适量的氯化钠使溶液达到等渗。为保证补体的活化，在缓冲盐溶液中还需加入适量的钙离子和镁离子。（2）溶

4、血素的稀释溶血素的效价一般都比较高，因此稀释时需注意稀释倍数，防止单位跨度太大，不利于效价的确定。可采用交叉等倍稀释法，即两三个等倍稀释系列交叉进行。（3）溶血素的效价滴定将不同稀释度的溶血素和等量的补体及绵羊红细胞混合于试管中，37水浴30min后观察。完全溶血的试管中液体红色透明，离心后无细胞沉降。完全不溶血的试管中液体浑浊，离心后红细胞完全沉降，上清液无色透明。不完全溶血的情况介于二者之间。按以上标准，以产生完全溶血的溶血素的最高稀释度作为溶血素的效价，确定为一个单位（unit）。在试验中一般采用个单位的溶血素，如：溶血素的效价为1：3000，配制个单位的溶血素需将溶血素作1：1500稀

5、释。 （二）免疫溶血试验的用途1.溶血空斑试验是用已知SRBC和补体检测SRBC免疫小鼠脾细胞分泌到细胞外的抗SRBC抗体；2.CH50试验是用已知SRBC和溶血素检测血清总补体溶血活性。3.补体结合试验是以溶血试验作指示，即用已知SRBC和溶血素检测补体是否被消耗，从而判定抗原抗体的对应情况。4.抗补体试验也是以溶血试验作指示，检测血清中有无能结合补体的免疫复合物。二、补体结合试验原理 技术要点 方法评价 （一） 原理 补体结合试验（complement fixation test, CFT）是利用抗原抗体复合物可结合补体，而游离的抗原或抗体不能结合补体的特点，以溶血素和绵羊红细胞这一对抗原

6、抗体系统作为指示系统，用已知抗原（或抗体）检测未知抗体（或抗原）的试验。在试验中有三个系统参与反应指示系统即溶血素及绵羊红细胞，试验时常将其预先结合，形成致敏绵羊红细胞（sensitized sheep RBC，SSRBC）；补体反应系统即已知的抗原（抗体）和待测的抗体（抗原）。（二） 技术要点 SRBC浓度固定在1%2%。其他成分如溶血素，补体，抗原及抗体等均需事先滴定其单位，配制成特定的浓度，以保证结果的可靠性。在补体结合试验中，待检血清使用前应预先灭活补体。试验用2U溶血素。 1、抗原和抗体的滴定 抗 原抗 体 抗原对照1：81：161：321：641：1281：80000141：160

7、001241：320001241：640002341：128234444抗体对照444444表17- 抗原抗体方阵滴定结果示例抗原的效价为1：64，抗体的效价为1：32，以此稀释度为1u。正式进行补体结合试验时，所用的抗原量为2u4u，抗体量为4，在本例中抗原采用1：161：32稀释度，抗体采用1：8稀释度。2、补体滴定补体结合试验前需滴定补体效价。按表17-2依次加入1：30稀释的补体，缓冲盐溶液，2个单位的抗原于试管中，混匀后，37水浴30min，再加入致敏羊红细胞，再置3730min。温育结束后观察结果，以引起完全溶血的补体最少用量作为1个单位（1u）。表17-2 补体滴定管号1：30补

8、体（ml）缓冲盐溶液（ml）2单位的抗原（ml）1%致敏羊红细胞ml假定结果0.060.240.1 370.2 370.080.220.1 水浴0.2 水浴+0.100.200.130min0.230min+0.120.180.10.2+0.140.160.10.2+0.30.10.2如表17-2所示结果，1：30的补体0.12ml为1u，2u则为1：30补体0.24ml。正式试验中采用2的补体，补体用量为0.2ml，需对补体的稀释倍数进行计算，30 ：X=0.24 ：0.2，X=25，则将补体原液作1：25稀释后，每0.2ml即含有2u的补体。3、正式试验将已滴定好的补体，已知抗原（或抗体）

9、等按试验要求配成一定浓度，与缓冲盐溶液及待检样品依次加入试管中，同时设置一系列对照。37水浴60min或41618h后，再加入配好的致敏红细胞，置37水浴30min。温育完成后观察结果。 表17-3 补体结合试验管号待检样品(ml)抗原（ml）补体（ml）缓冲盐溶液ml致敏红细胞(ml)待测管0.10.10.2370.237待测血清对照0.10.20.1水浴0.2水浴抗原对照0.10.20.160min0.230min补体对照（2u）0.10.20.1或0.2补体对照（1u）0.10.10.240.2补体对照（0.5u）0.10.050.2516-18h0.2致敏红细胞对照0.40.2（三）

10、方法评价优点：如灵敏度较高，特异性较强，可检测多种类型的抗体或抗原，并可测定其效价，试验不需特殊仪器，易于在基层单位普及等。缺点：补体结合试验参与反应的成分较多，影响因素复杂，操作手续繁琐且要求严格，容易发生失误导致错误结果的出现。三、补体依赖的细胞毒试验complement dependent cytotoxicity, CDC原理：带有特异抗原的靶细胞与相应抗体结合后，在补体参与下，靶细胞膜被损伤，靶细胞死亡，染料进入细胞而着色。靶细胞被杀伤的情况多用形态学方法进行检测。利用CDC试验可以检查HLA抗原，也可用于检测鉴定HLA的细胞毒抗体。在试验中抗原靶细胞为人淋巴细胞，抗体为针对相应HL

11、A抗原的抗血清，补体为新鲜兔血清。四、免疫粘附试验抗原抗体复合物激活补体后，可通过C3b或C4b粘附在具有补体受体CR1的红细胞、血小板或某些淋巴细胞上，形成较大的聚合物。利用这一原理设计的免疫粘附试验（immune adherence test），可用于检测抗原或抗体，也可检测细胞上的CR1。第二节 补体的测定一、补体活性的测定 二 、补体含量检测一、补体活性的测定血清总补体溶血活性（complement hemolysis 50%，CH50）的测定旁路途径溶血活性（alternative complement pathway 50%，APH50）测定 C4活性测定因子溶血活性测定 （一）血

12、清总补体溶血活性的测定（CH50实验）1、试验原理 根据免疫溶血试验原理设计。当红细胞与溶血素的量一定时，在规定的反应时间内，溶血程度与补体的量及活性正相关。但不是一个直线关系。以溶血百分率为纵坐标，相应的补体含量为横坐标绘图可得到典型的“S”形曲线。在50%溶血附近，“S”形曲线最陡，接近一条直线。在此范围内补体活性稍有变动，溶血程度就有明显变化，即是以50%溶血作为反应的终点比以100%溶血作为终点更为敏感，因而该试验被称为补体50%溶血试验（complement hemolysis 50%） ，即CH50试验。以引起50%溶血所需的最小补体量为一个CH50单位，由此可以计算出待测血清中总

13、的补体溶血活性，以CH50 KU/L表示。表17-4 血清总补体溶血活性的测定管号1：20稀释的待检血清（ml）缓冲液（ml）2u溶血素2%SRBC（ml）10.151.350. 50. 520.201.300.50.530.251.250.50.540.301.200.50.550.351.150.50.561.500.50.5温育完成后，取出试管离心后，选择溶血程度最接近50%溶血的两管，在分光光度计上542nm读取吸光度，以最接近50%溶血的一管为终点管。以该管的血清用量计算血清CH50的值：（二）旁路途径溶血活性测定（alternative complement pathway 50%

14、，APH50）.测定原理：正常情况下，涎酸可抑制B因子活性。家兔红细胞所含涎酸量低于其他动物的红细胞，可以激活血清中的B因子，引起旁路途径活化，导致兔红细胞溶解。在红细胞量一定时，在规定反应条件下，溶血程度与血清中参与旁路活化的补体量及活性呈正相关。与CH50测定相似，以引起50%溶血所需的最小补体量为一个APH50单位，可计算出待检血清中补体旁路途径溶血活性，以APH50 KU/L表示。.测定方法补体活化时，经典途径需有钙离子及镁离子参与，旁路途径只需镁离子参与。用EGTA（二乙醇双醚四乙酸）可以螯合钙离子，抑制补体经典途径而不影响旁路途径的活化。测定中所用的缓冲盐溶液含有EDTA。兔红细胞

15、用枸橼酸盐抗凝，缓冲盐溶液洗涤三次后，配制成0.5%浓度。将待测血清用缓冲盐溶液作1：4稀释后，与其他试剂按表17-5依次加入试管中，混匀，置37水浴30min。同时配制50%溶血标准管。表17-5 补体APH50测定管号1：4稀释的待测血清（ml）缓冲液（ml）0.5%兔红细胞（ml）10.100.50.420.150.450.430.200.400.440.250.350.450.300.300.46-0.60.4温育完成后，取出试管离心后，与50%溶血标准管比较，再用分光光度计确定与50%溶血最接近的一管为终点管。以该管的血清用量计算血清APH50的测定值：本试验反映的是补体旁路途径的溶

16、血活性，其结果与C3，B因子，P因子，D因子及C5C9各组分的含量及活性均有关系。（三）C4活性测定用氨水处理豚鼠血清后可除去其中的C4，由于补体不能依次激活，因此，这种缺少C4的血清（R4）不能使溶血素致敏的绵羊红细胞溶血。当加入含有C4的待检血清后，补体连锁反应恢复，发生溶血，溶血程度与待检血清中的C4活性相关，测定以50%溶血作为反应终点。缺乏C4的抗原抗体补体复合物（EAR4）的制备在19份新鲜混合豚鼠血清中加入1份14%的氨水，混匀后，置37水浴30min，用1mol/L的盐酸调pH至7.2，即可得到缺乏C4的血清（R4），备用。取5%羊红细胞悬液与等量4u溶血素混匀，置37水浴30

17、min，即得致敏红细胞（EA）。将EA4ml与R4 0.25ml混匀，室温放置15min即为EAR4。将待检血清用缓冲盐溶液作1：150稀释后，与其他试剂一起，按表17-6依次加入试管中，混匀后，置37水浴30min，同时配制50%溶血标准管。正常人血清C4溶血性正常范围为 8 2702 087 KU/L。表17-6 C4溶血活性测定管号1：150待检血清（ul）缓冲液（ul）EAR4（ul）溶血单位* (KU/L）159510030 0002109010015 000320801007 500430701004 950540601003 7506_100 100 _ （四）因子溶血活性测定

18、B因子在补体旁路途径中是一种重要组分，如缺乏B因子将不能使补体旁路活化。将新鲜正常人混合血清56水浴15min即可除去其中的B因子，成为缺乏因子的血清（RB），将RB加入兔红细胞，不会引起兔红细胞溶血。如加入含有因子的待检血清，其中的B因子可被兔红细胞激活而使补体旁路途径重新活化而使兔红细胞溶血，溶血程度与待检血清中的B因子溶血活性相关。将兔红细胞用含有EDTA的缓冲盐溶液洗涤三次后，配成1%的悬液。以新鲜正常人混合血清作参考血清。按表17-7进行测定。表17-7 B因子溶血活性测定管号1：10稀释RB（ml）1%兔红细胞（ml）1:8稀释待检血清1：8稀释参考血清待测血清管0.60.80.6参考血清管0.60.80.637水浴30min结束后，取出试管离心，取上清在542nm波长测吸光度值。以参考血清的A值作100%进行换算。待检血清B因子溶血活性低于60%者判定为B因子溶血活性降低。二 补体含量检测常用的方法有单向免疫扩散法，火箭免疫电泳，免疫比浊法，酶联免疫吸附试验及放射免疫分析等。但因各组分血清浓度不等，检测方法有所差异。血清含量高的组分如C3、C4、C1q、Bf等可用单向免疫扩散法免疫比浊法等测定。含量低的组分就需用酶联免疫吸附试验等灵敏度较高的方法进行检测