临床免疫学与检验：第九章 酶免疫技术

1、酶免疫技术Enzyme Immunotechnique第一节 概述酶免疫技术的原理酶及其底物酶标记抗体（抗原）的方法酶标记物的纯化与鉴定 固相酶免疫测定仪酶免疫技术的类型一、原理酶免疫技术是以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。将酶与抗体（或抗原）结合成酶标记抗体（或抗原），此结合物既保留抗体（或抗原）的免疫学活性，又保留酶对底物的催化活性。在酶标抗体（或抗原）与抗原（或抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原（抗体）进行定位、定性或定量的测定分析。二、酶及其底物（一）酶的选择要求（二）常

2、用的酶（三）常用的底物（一）酶的选择要求一个酶蛋白分子每分钟可催化103104个底物分子转变成有色产物。用酶标记抗体（或抗原）建立酶免疫测定法，可使免疫反应的结果得以放大，保证测定方法的灵敏度。用于标记的酶应符合的条件 酶活性高，能对低浓度底物产生较高的催化反应率。具有可与抗原、抗体共价结合的基团，标记后酶活性保持稳定，而且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。酶催化底物后产生的信号产物易于判定或测量，且方法简单、敏感和重复性好。用于标记的酶应符合的条件酶活性不受样品中其他成分（内源性酶、抑制物）的影响；用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性出现抑制或激活。酶、辅助因子及其底物

3、均对人体无危害，理化性质稳定，且价廉易得。（二）常用的酶辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） 碱性磷酸酶（alkaline phospharase，AP） b-半乳糖苷酶(b-galactosidase，b-Gal ) 其他的酶 1辣根过氧化物酶（HRP）HRP因在蔬菜植物辣根中含量最多而得名。它是由糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）结合而成的复合酶，分子量约40kD，等电点为pH5.59.0。主酶为无色蛋白，最大吸收光谱为275nm，辅基是酶的活性中心，最大吸收光谱为403nm。HRP的质量常以纯度（Reinheit zhal，RZ）和活性来表示。HRP的纯

4、度以A403nm/A275nm的比值表示，RZ值越大，酶的纯度越高。用于酶免疫技术的HRP，其RZ应3.0。HRP的活性则用单位表示，用邻联茴香胺法测定时，在25条件下1min将1g底物转化为产物的酶量为一个单位（U）。酶的纯度并不代表酶的活性，因此选用酶不仅要选纯度高，而且还要选活性强的酶。2碱性磷酸酶（AP） 是一种磷酸酯的水解酶。因其分子量较大（80100kD），不易透入细胞内，故很少用于E I H，但因其敏感性高、空白值低，也常用于E I A。3.半乳糖苷酶(b-Gal )b-Gal源于大肠埃希菌，分子量540kD，最适作用pH6-8。因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标记物在测定时不易受

5、到内源性酶的干扰，因此也常用于均相酶免疫测定。4其他的酶常用于 E I H 的还有葡萄糖氧化酶（GOD），以及用于均相酶免疫测定的6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等。（三）常用的底物1HRP的底物2AP的底物3. 半乳糖苷酶底物4GOD的底物 1HRP的底物 HRP的底物为过氧化物和供氢体（DH2）（1）过氧化物： H2O2（2）供氢体：邻苯二胺（OPD）;四甲基联苯胺（TMB）表20-1 HRP常用的供氢体底物及其反应产物。供 氢 体 底 物反 应 产 物终 止 剂测读波长二氨基联苯胺 (diamido-benzidine,DAB)棕色、不溶性24mol/L492nm联苯胺 (be

6、nzidine)蓝色、不溶性HCL或H2SO4450nm邻苯二胺(o-phenylenediamin,OPD)黄色、可溶性同上450nm四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethyl-benzidine,TMB)蓝色(黄色)、可溶性同上460nm四甲基联苯胺硫酸盐 (TMBS)蓝色、可溶性3mol/L460nm5-氨基水杨酸 (5-aminosalicylic acid,5-ASA)棕色、可溶性NaOH550nmABTS (2,2-azino-bis(3-ethyl benzithiazoline-6-sulfonic acd)绿色、可溶性1%SDS405nm2AP的底物常用的为对-硝基

7、苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate，PNP），其反应产物为黄色的对硝基酚，测读波长为405nm。3. 半乳糖苷酶底物常用底物为4-甲伞酮基-b-D-半乳糖苷(4-methylumbellifery1-b-D-galactoside，4MUG)，酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮 (4-methylumbelliferone，4MU)，其敏感性较HRP者高3050倍，但测量时需用荧光计。4GOD的底物为葡萄糖，供氢体为对硝基蓝四氮唑，反应产物为不溶性的蓝色沉淀。三、酶标记抗体（抗原）的方法戊二醛交联标记法 改良过碘酸钠标记法 四、酶标记物的纯化与鉴定酶标记物的纯化 酶

8、标记物的鉴定 （一）酶标记物的纯化常用的纯化方法有:葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯（二）酶标记物的鉴定 1质量鉴定 常用免疫电泳或双扩散法。出现沉淀线表示酶标记物中的抗体（抗原）具有免疫活性。沉淀线经生理盐水反复漂洗后，滴加酶的底物溶液，若在沉淀线上能显色，表示酶标记物中酶的活性仍保留。也可直接用ELISA方法测定。2酶标记率的测定 常用分光光度法分别测定酶标记物中酶和抗体（抗原）蛋白的含量，再按公式计算其标记率。（1）酶含量： 即酶在403nm波长的A值为1时，酶的含量为0.4 mg/ml。（2）IgG含量 即酶蛋白（0.3）结合戊二醛后A值为0.42；

9、抗体蛋白与醛化酶结合后A280nm约增加6%，故乘以0.94；兔IgG的A280nm=1.0时， IgG含量为0.62。（3）克分子比或摩尔比(E/P)： E/P一般为1-2（4）酶标记率：或一般酶量为 1 mg/ml、 HRP/IgG 在1.52.0之间、酶的标记率大于0.3时，酶联免疫吸附试验（ELISA）的结果最好。五、固相酶免疫测定仪（一）性能指标1.测定波长 2.测定的吸光度范围 3.光学系统 4.检测速度 5.震板功能 6.温育功能 7.软件功能 （二）仪器类型1. 微孔板固相酶免疫测定仪2.管式固相酶免疫测定仪 3.小珠式固相酶免疫测定仪 4.微粒固相酶免疫测定仪 5.磁微粒固相

10、酶免疫测定仪 （一）性能指标1.测定波长450nm和492nm 两个波长是ELISA法最常用的。除了这两个基本滤片外，由于双波长比色的需要，还应配有620nm和405nm波长的滤光片。2.测定的吸光度范围酶标仪的吸光度测定范围在02.5之间就可以满足ELISA测定的需要。现在酶标仪一般拓宽至3.5以上，并能保持很好的线性和精密度。3.光学系统酶标仪光学系统采用的是垂直光路多通道检测，一般为硅光管或光导纤维，除测定通道外，有的酶标仪还有一个参比通道，每次测定可进行自我校准。酶标仪的光学系统功能如何，均是通过酶标仪测定的吸光度、线性、精密度和准确度等指标体现出来的。4.检测速度酶标仪检测速度是指其

11、完成比色测定所需要的时间。速度快利于提高检测的准确性，避免因时间不同所致的各微孔之间吸光度的差异。目前生产的酶标仪检测速度均较快，一般在数秒内即可完成全部测试。5.震板功能 酶标仪的震板功能是指酶标仪在对ELISA板孔进行比色测定前对其进行震荡混匀，使板孔内颜色均一，避免沉淀对测定的影响。6.温育功能 温育功能是酶标仪的一个附加功能，是指酶标仪本身能按要求自动精密地控制仪器内部的温度，使得ELISA微孔板条的温育过程可在仪器内部进行，而无需再配置温箱。7.软件功能 软件功能是指酶标仪所具有的对ELISA定性和定量测定进行统计分析并报告结果的功能。在ELISA定性测定中，酶标仪若具有阳性判断值（

12、Cut-off）和测定“灰区” 的统计计算功能。 在ELISA定量测定中，则在酶标仪的软件功能中应有曲线回归方程计算功能。其他功能如质控记录、质控曲线、数据保存等可根据需要而定。（二）仪器类型由于测定所用的固相载体的不同，各种ELISA分析仪在设计和结构上有很大差异。1. 微孔板固相酶免疫测定仪器国际上微孔板式ELISA使用的载体为96孔板，采用直接对板孔测定吸光度（A）的比色计，称为ELISA测读仪（ELISA reader）。这种对微孔板ELISA试剂通用的仪器20世纪80年代初期即有商品问世，经过不断改进，已发展为自动化、高效率、高精密度的测定仪。解决了ELISA中的洗涤步骤繁琐不易标准

13、化的问题。全自动酶免工作站全自动酶免分析仪 1 套酶免前处理 START FAME24/20全自动酶免分析仪（后处理）2.管式固相酶免疫测定仪器1990年德国宝灵曼公司（Boehringer Mannheim）推出了全自动管式ELISA分析系统，ES-300仪器。法国Bio-Mereux公司生产的Vidas是一种特殊形状的管式全自动ELISA的分析仪，配套使用一个特别的“试剂条” 。法国VIDAS-12全自动酶免疫荧光分析仪3.小珠式固相酶免疫测定仪器珠式固相的特点是均一性优于板孔；易在容器中成批包被；洗涤时可在洗液中滚动，效果更好。小珠表面经磨砂处理后吸附面积增大，利于包被和增加单位面积的反

14、应量。早年美国Abbott公司生产的珠式半自动ELISA仪器称为Quantum。目前IMX自动分析系统和Roche公司推出的珠式全自动ELISA分析仪Cobas Core I、Cobas Core II等实验室使用较多。Abbott,珠子包被酶标仪Quantum Roche公司,珠式全自动ELISA分析仪Cobas Core II4.微粒固相酶免疫测定仪器用微粒作为固相载体具有一定的优越性，但其与液相的分离较为困难，一般需经过复杂的离心步骤。美国Abbott公司的IMx自动酶免疫分析仪。 美国Abbott公司的IMx自动酶免疫分析仪 5.磁微粒固相酶免疫测定仪器磁微粒可用磁铁吸引与液相分离，是

15、免疫测定中较为理想的固相载体，现已广泛应用于各种固相免疫测定中。 瑞士Serono公司，Serozyme分析系统。 六、酶免疫技术的类型 酶免疫技术按实际用途分为:酶免疫测定（enzymeimmunoassay，EIA）酶免疫组织化学（Enzyme immunohistochemistry technique，EIHCT）图20-1 酶免疫技术分类（一）均相酶免疫测定基本原理：酶标抗原(Ab-E)和非标记抗原(Ag)具有相同的与限量抗体(Ab)竞争结合的能力。而Ab-E与Ag结合形成Ag-Ab-E后，其中的酶( E ) 活性将被减弱或增强。因此，不需对反应液中的AgAb-E和Ab-E进行分离，

16、直接测定反应系中总酶活性的变化，即可推算出被测样品中Ag的含量。均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原(如药物)的测定。 方法类型：1.酶增强免疫测定技术2.克隆酶供体免疫分析1.酶增强免疫测定技术（enzyme-mutiplied immunoassay technigue, EMIT)基本原理：Ag-E与Ab结合形成Ag-EAb后，所标的酶(E)因与Ab接触紧密，空间位阻影响了酶的活性中心，酶活性受到抑制(图20-2)。同时加入未标记抗原(标准或样品中的Ag)，Ag即与Ag-E竞争结合反应系统中限量的Ab形成AbAg，从而使反应液中Ag-E Ab (酶活性被抑制)的比例减少，具酶活性的游

17、离Ag-E增多。因此，最终测得的酶活性随着反应体系中未标记抗原(Ag)浓度的升高而增强。2.克隆酶供体免疫分析 (cloned enzyme donor immunoassay，CEDIA)基本原理：DNA重组技术可分别合成某种功能性酶(如b-D-半乳糖苷酶)分子的两个片段，大片段称为酶受体(EA)，小片段称为酶供体(ED)。单独的EA和ED均无酶活性，但在一定条件下可结合形成具酶活性的四聚体。CEDIA即是用ED标记抗原(Ag-ED)，反应系统中再加入相应的EA、Ab及样品抗原Ag (未标记)，反应时由于抗原抗体间的亲和力大于ED与EA，因此Ag-ED和Ag易与Ab结合形成复合物。而AbAg

18、-ED中的Ag-ED由于空间位阻的干扰不能与EA结合，而游离的Ag-ED则可与EA结合成具活性的全酶。由于反应属竞争结合，故反应液中游离的Ag-ED随着未标记Ag量的增多而增加，使最终加入底物后测得的酶活性高低与样品Ag含量成正比 。（二）异相酶免疫测定异相酶免疫测定是目前应用最广泛的一类标记免疫测定技术。基本原理：抗原抗体反应平衡后，需采用适当的方法分离游离的和与抗原(或抗体)结合形成复合物的酶标记物，然后对经酶催化的底物显色程度进行测定，再推算出样品中待测抗原(或抗体)的含量。方法类型：异相液相酶免疫测定固相酶免疫测定1.异相液相酶免疫测定该方法主要用于检测样品中极微量的短肽激素和某些药物

19、等小分子半抗原，近年来的发展使其灵敏度可达ng至pg水平，与放射免疫测定相近。但因酶标记物具更好的稳定性，且无放射性污染，故近年应用广泛。2.固相酶免疫测定固相酶免疫测定(solid phase enzyme immunoassay，SPEIA)，是利用固相支持物作载体预先吸附抗原或抗体，使测定时的免疫反应在其表面进行并形成抗原抗体复合物，洗涤去除反应液中无关物质并加入酶底物后，通过测定固相载体上的酶标记物催化底物生成的有色产物，确定样品中抗原或抗体的含量。目前应用最广泛的是以聚苯乙烯等材料作固相载体的酶联免疫吸附试验(ELISA)。 第二节 酶免疫组织化学技术enzyme immunohis

20、tochemistry technique酶免疫组化技术（EIHCT）是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应。如组织或细胞中含有相应抗原（抗体），二者结合形成的抗原抗体复合物中所带酶分子遇到底物时，催化底物产生显色反应，在光镜和电镜下，就可识别出标本中抗原（抗体）的分布位置和性质；经图像分析也可达到定量的目的。 EIHCT主要用于标本中抗原（抗体）的定位和定性检测。常用的标本有组织切片，组织印片和细胞涂片等。最常用的酶是HRP，供氢体是DAB。EIHCT可分为酶标记抗体免疫组化技术、非标记抗体酶免疫组化技术和酶免疫电镜技术三种类型。一、酶标记抗体免疫组化技

21、术（一）原理（二）技术类型及要点（三）方法评价（一）原理酶标记抗体免疫组化技术是借助交联剂的共价健将酶连接在抗体（抗抗体）上，酶标抗体（抗抗体）与标本中相应抗原或抗原抗体复合物反应后，再经酶对底物的催化作用，形成有色沉淀物，对标本中的抗原进行定性和定位的检测。（二）技术类型及要点1.直接法 用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应，形成酶标抗体-抗原复合物，最后加酶底物显色，镜检即可。其技术要点包括：室温下将标本用0.3H2O2和80甲醇液处理15min，以消除内源性过氧化物酶，石蜡切片需常规脱蜡，用胰酶消化（37），然后用PBS洗；用10牛血清白蛋白温育标本片15 min，以封闭非特异性结合点；

22、加适当稀释酶标记抗体，湿盒内37温育30 min或4过夜，PBS洗去未结合物；加底物显色，在光镜下观察结果。2间接法 用已知抗体（Ab1）与标本中相应抗原（Ag）反应，形成Ag-Ab1复合物，再用酶标记抗抗体（Ab2*E）与Ab1-Ag反应使之形成Ag-Ab1-Ab2*E复合物后，加底物显色，镜检即可。其技术要点包括：同直接法；加适当稀释Ab1（如鼠抗X），湿盒内37温育30 min或4过夜，PBS洗去未结合Ab1；加适当稀释酶标抗抗体（如羊抗鼠），湿盒内37温育30 min，PBS洗涤；加底物显色，光镜下观察结果。3酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法，是在标本抗原上加三层抗体；后二层抗体均

23、可用酶标记抗体，使之形成Ag-Ab1-Ab2*E-Ab3*E复合物。该法由于所形成的复合物中酶的增加，而使敏感性得到了提高。其技术要点包括：同间接法；加第二种酶标抗抗体（如兔抗羊），温盒内37温育30 min，PBS洗；加底物显色，光镜下观察结果。（三）方法评价1直接法 优点：操作简便、快速、特异性强，非特异显色低；缺点：一种酶标抗体只能检测一种特异性抗原，敏感性低于间接法。2间接法 优点：用一种酶标记抗抗体与多种特异性抗体结合，可检测多种抗原，实用性与敏感性均强于直接法；缺点：敏感性低于非标记抗体酶法与三步法。3酶标抗体三步染色法 优点，敏感性强于直接法与间接法；缺点：操作繁锁、费时。二、非

24、标记抗体酶免疫组化技术（一）原理（二）技术类型及要点（三）方法评价（一）原理该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结合形成复合物，然后利用第2抗体（Ab2）作桥，Ab2既可与Ab3的Fc段结合，又可与结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc段结合，经酶分子催化底物的显色反应，达到对抗原的检测。（二）技术类型及要点1酶桥法 用HRP免疫动物（如兔）制备抗HRP的抗体（Ab3），经Ab2（如羊抗兔）作桥，将结合在组织抗原上的Ab1（兔抗）与Ab3连接起来，最后将HRP与Ab3结合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物，加底物显色。2PAP法 即过氧

25、化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP）法，为酶桥法的改良法，技术要点基本上与酶桥法相同，但该法将抗酶抗体（Ab3）与酶制成了复合物（PAP)。3双桥PAP法 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥抗体和PAP，形成Ag- Ab1-Ab2-Ab3- HRP -Ab2-Ab3- HRP，即Ag-Ab1- Ab2-PAP- Ab2-PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，增强了方法的敏感性。技术要点与PAP法相似。4APAAP法 是用AP代替HRP建立的 碱性磷酶酶（AP）-抗碱性磷酶酶 （AAP）法，简称APAAP法。（三）方法评价由于酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗体反应

26、与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥PAP法是当今免疫组化技术中敏感性较高的方法。该技术既可用于抗原的检测，又可检测抗体。随着PAP与双桥PAP法的完善与成熟，酶桥法已较少应用。三、酶标记免疫电镜技术该技术是用酶标抗体与组织或细胞抗原发生异性结合，加酶底物产生显色反应，在电镜下观察显色反应的强度；它是将电镜的高分辨力与酶免疫技术的特异性相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定性分析的一种高度精确、灵敏的方法。首选的技术类型是PAP法，电镜标本的制备分为PAP包埋前和PAP包埋后染色法两种。最常用的酶是HRP，其底物常用DAB，DAB在HRP催化下形成吩嗪

27、衍生物，经OSO4处理后变为锇黑，电子密度高，很适合电镜观察。HRP的分子量（40KD）较小，易进入细胞内。该技术主要用于有电镜的科研单位。第三节 酶联免疫吸附试验Enzyme-linked Immunosorbent Assay ,ELISA 酶联免疫吸附试验(ELISA)于1971年分别由瑞典学者Engrall和Perlmann，荷兰学者Van Weeman和Schuurs报道。创建了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法。ELISA基本原理其是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面；测定时，将受检样品(含待测抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按一定程序

28、与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物。ELISA基本原理反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量(免疫复合物)即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例；经洗涤去除反应液中其他物质，加人酶反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中测物质含量。二、方法类型及其反应原理1.双抗体夹心法 2.间接法 3.竞争法 4.捕获法 5.其他ELISA 1.双抗体夹心法2.间接法 3.竞争法 4.捕获法5.其他ELISA应用生物素-亲和素放大系统(biotin-advdin system，BAS)的ELISA 利用酶催化底物发荧光的酶

29、联免疫荧光测定(enzyme linked immunfluorecence assay，ELFIA)斑点-ELISA (dot-ELISA)酶联免疫电转移印迹法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB)酶联免疫化学发光测定(enzyme linked immunochemiluminescence assay，ELICLA)等 三、技术要点固相载体免疫吸附剂最佳工作浓度的选定 （一）固相载体1.固相载体的要求2.固相载体的种类和选择1.固相载体的要求理想的固相载体应具备如下特点：与抗体(抗原)有较高的结合容量，且结合稳定极少脱落；可结合抗原

30、或抗体免疫反应物，以及如亲和素或链霉亲和素等大分子蛋白质；生物大分子固相化后仍应保持活性，而且为有利于反应充分进行，最好其活性基团朝向反应溶液；固相化方法应简便易行、快速经济。2.固相载体的种类和选择1）塑料制品 ：聚苯乙烯、聚氯乙烯2）微颗粒 : 磁性微粒3) 膜载体 ：硝酸纤维素膜 NC、玻璃 纤维素膜、尼龙膜 (二) 免疫吸附剂免疫吸附剂是指与固相载体结合的抗原或抗体。 包被：将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)。封闭：用1%5%牛血清白蛋白或5%20%小牛血清等包被一次此过程称为封闭(blocking)。（三）最佳工作浓度的选定1.方阵（棋盘）滴定法选择包被抗原的工作浓度

31、 2.酶标抗抗体工作浓度的选择3.方阵（棋盘）法选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度 四、方法评价ELISA具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、实验设备要求较简单、应用范围广泛、无放射性同位素污染等优点，可对多种物质进行定性及半微量、微量、超微量定量分析，为临床诊断和基础研究可提供可靠的实验依据。目前已成为普及应用最广、发展最快的免疫学实验技术之一。第四节 膜载体的酶免疫测定固相膜免疫测定(solid phase membrane-based immunoassay)与固相酶免疫测定(ELISA)相类似，其特点是以微孔膜作为固相。标记物可用酶和各种有色微粒子，如彩色胶乳、胶体金、胶体硒等，以红色的胶体金最为常用。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样。方法类型：免疫渗滤试验(immunofi