免疫细胞培养流程20180528

1、IL0ADir.；-2*MUVlafiiw-$八im8qsMojdioton-ii?tu:-=，；、=人起皆八舗幣7；：泊！!丄；=1；呻一.；4V了5曹01101010101D1O10101111111010101010101101010101101010101010101LQBy:857814962No.201306081iLQ110101010X1XTJ0：1010QTCHOLWBD101010110101010101Q;1Q1；0Ifl11110101010101011010101011?-TFimri-j*j|_.-“bIal?nAitfttiwttam-?PttavioiSU)19

2、wiO；n*:免疫细胞生产流程匚i:KiI细胞生产流程细胞生产流程符合GMP规渝A级细胞生产线1细胞采集2细胞分离3细胞培养4细胞质检5细胞收获除细胞采集外，所有操作均在符合GMP标准的洁净环境下操作。1细胞采集机米（单米）血细胞分离机采集PBMC达到109数量级，细胞数量多，培养周期短。对患者（顾客）身体要求高。手米采集患者外周血50-200ml,PBMC达到10*数量级，细胞数量较少，培养周期略长。2细胞分离PBMCPBMCB|Jperipheralbloodmononuclearcell,外周血单个核细胞。外周血各种血细胞的密度不冋，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一

3、定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞分离。血小板淋巴细胞单核细胞1.0931.0921.0751.0901.030-1.035Ficoll：1.0770.0012细胞分离血液收集生物安全柜紫外照射30min,开机运行至少5min；银子夹取酒精棉球；酒精棉球擦拭手术剪及止血钳“头部”，单向擦拭;夹取新的酒精棉球擦拭rfn袋管路;止血钳夹住血袋管路，手术剪剪掉血袋管路前段，利用重力，使血液通过管路收集至离心管中。2细胞分离密度梯度离心新鲜抗凝血与生理盐水1:1混匀后，小心滴加丁淋巴细胞分离液之液面上。离心机升速降速都设置为低档。离心。2细胞分离密度梯度离心稀释的血浆、血小板PBMCF

4、icollFicoll红细胞粒细胞细胞收集：吸取白膜层，离心洗涤。细胞培养基（1640）或其他缓冲溶液洗涤两次收集PBMCo2细胞分离注意事项血液、分离液及环境温度在2025C之间,分离效果较好；抗凝血稀释时要去除抗凝剂体积；吸取PBMC时不可避免会吸取部分分离液,要足够稀释，才可以把PBMC离心下来；离心时，升降加速度要调到足够低档；严格无菌操作。3细胞培养一,PBMC收集约bd06/ml外周血（因人而异）；计数；根据计数结果，收集到的PBMC,用初始培养基重悬，按l3xl06/rrd的密度接种于初始瞬容器（瞬wm#袋）;置于5%COz、37C的二氧化碳培养箱中培养，定期显微镜观察细胞，计数

5、，依据细胞生长状况补加扩增培养基。初始培养基及扩增培养基或者相关细胞因子添加依据培养目的配制或添加。3细胞培养一,PBMC收集约bd06/ml外周血（因人而异）；计数；根据计数结果，收集到的PBMC,用初始培养基重悬，按l3xl06/rrd的密度接种于初始瞬容器（瞬wm#袋）;置于5%COz、37C的二氧化碳培养箱中培养，定期显微镜观察细胞，计数，依据细胞生长状况补加扩增培养基。初始培养基及扩增培养基或者相关细胞因子添加依据培养目的配制或添加。3细胞培养培养过程中,显微镜观察:细胞甘流程细胞生产流程4细胞质检细胞收获前48小时取样检测。计数、细胞活率检测；内毒素检测；细菌、真菌检验；支原体检测；流式表型检测；细胞杀伤检测。根据不同的培养目标制定相关的质检合格标准。5细胞收获收集细胞培养液;移入250