基础学院中药抗病毒作用靶点的克隆、纯化及应用体系建设

1、：抗：20151201612填报日期：2015：抗：20151201612填报日期：2015215为建规范的协同创新项目信息管理制信息的管理特设山东省高抗协同创新中心项目可行（书格式和填写要一、请严格按照表中要求填写各项目为建规范的协同创新项目信息管理制信息的管理特设山东省高抗协同创新中心项目可行（书格式和填写要一、请严格按照表中要求填写各项目可可以由以由联组织牵为项目组织实施的责目只能有一家责和一个组长目可由项目抗协创新中心管汇总目可中第一次出现外文名要写清全称和缩写再出现同一词时可以使用缩五、组织机构代码是指项目组织机构代码证上的标识代码它是组织机构代码管理中心所赋予的唯一法人标识代填材料

2、，尊重他人知国家有关知项目可行中他人研究成须以脚注或其他方式注明出目的应是评论与自己的研究的成果或说明与自己的研究相关的技术问题对改科袭他人著作或者剽窃他袭他人著作或者剽窃他人科研成果等科研不端一经查入信。七、此表为项目可行的基本信息，请务必填写正一、项目基本中药2016 12 中药靶点筛试剂山东大济清大学科技园大学路4655一、项目基本中药2016 12 中药靶点筛试剂山东大济清大学科技园大学路4655济南男123（万元二、项目简二、项目简500（SV（HBV、单纯疱疹 （HSV、手足口 （EV71CPE法活性筛2、运用分子生物学和 工程 E.Coli为目的工 ，或杆状 反向遗传学等的方法，

3、转接目的 ，克隆其有效作用靶点，并将其分离纯化，测3、采用液相 技术（ 型微球流式荧光技术建立激光激发光药物筛选方法，最终建立快速高通量抗 靶点筛选和中药抗机制研究体系；并利用该体系发现作用于靶点的中药抗 有效部位、组分或成分，阐明所筛选的中药抗 作用机理。4 建立完善的中 抗 多组分、二、项目立二、项目立项的必要性分是危害人类健康的重要 ，人类健康迫切要求发现新的安全有效的抗 药物，抗 药物的研发属于国家重点鼓励支持的研究领域。近年来， SARS、 、甲型 流感等全球性传染病的爆发和 ，给人类生命和健康带来严重的 。由 引起的疾病多具有传染性强、 高、流行面广及 率高等特点，是人类至今尚不能

4、有效控制的世界难题。因此，针对新康安全具有 的意义。传染病防治是提高 健康水平和保持社会和谐稳定的 需求 “健康是促进人的全面发展的必然要求在中外 见规划纲要（2006-202016个科技 专项，医学领域主要涉及到传染病防治和新药创制。国家十二五规划“ 和 性肝炎等 传染病防治2015年， 传染病的应急和综合防控能力显著 ，有效降低 、 性肝炎、结核病的新发 率和病死率。这对国家整个传染病SARSH5N1和 流感爆发期间起到出色防治成果的中 抗 领域，也是人类健康迫切要求发现新的安全有效的抗 药物性疾病对人类的健康危害就上升为传染性疾类疾病有 60%由（SARS（H5N1（HBV毒（HI毒（H

5、IV、手足口病 （CA16和EV71、人巨细胞 （CMV）等。人类迫切需要 安全有效的药物来预防和治疗 引起的疾病。此外，养殖业因为 危害，产生巨大的经济损失，并且 给人的案例也时有发生。2.1.3中药及天然药物是抗 和期总结前人经验结合当时的具体情况写成世界第一部传染病专证 方法也奠定了中医临床实践的基础。 吴有性著温疫论，提出戾气 “由口鼻而入是对 性流感的初步认识，在治疗中采用 苦寒、辟秽解毒的治疗原则，对温病学派的形成做出了巨大贡献。清代以 、 、吴瑭、 等医家为代表的温病学派，对外感温热病的病因、病机、证治规律进行系统阐发，进一步丰富和发展了传染病防治理论。近年来，尤其是 2003

6、年 SARS爆发以来，我国先后经历了 感、 的流行，在与 流行性疾病抗 的效果获得了广泛承认。关靶点的研究进作用于 穿入或脱壳的抗 作用于 穿入或脱壳的抗 的附着蛋白和细胞受体的结合部位之后，就可设计或生产某些制剂来与 竞Epstein-Barr(EB) 、人免疫缺损 (HIV)、脊髓灰质炎 、鼻 (RV)及巨细胞 (CMV)的宿主细胞表面受体成分。这些受体成分及其配体(对应的 附着蛋白)就成为要研制的抗 物质或药物的重作用于 组 组制剂多作用于这-环节，也是当前设计抗 制剂最活跃的领域。这些制剂有如抑制 DNA多聚酶HSV 的DNAp组的-个3.5kb区域内，可编码1236个氨基、CMV、E

7、BV 及噬菌体T4 的 DNAp，以及人a多聚酶和酵母a 多聚酶具有同源性，表明这-保守区域具有重DNAp 墓因的克隆成功，片段重组于质粒载体中已获得HSV和噬菌体T4 的DNAp克隆。克隆的HSV DNAp昔、碘昔、无环鸟昔等等，从下列几方面直接或间接地影响着DNAp (l)DNAp的替代底物；(2)DNA中，形成 、缺损的 DNA；(3)能DNA 链的延伸。抑制 RNA 作用于RNA 聚合酶的抗RNA 聚合酶的作用，抑制mRNA抑制 特异性胸苷激酶HSV 在时，其TKHSV 在时，其TK将3端的磷酸基团加至脱氧嘧啶(胸腺嘧啶或胞嘧啶)上形成单磷酸盐形式，供DNA则需要TK 以提供底物。因此

8、TK 与诱生的 TK 激酶的磷酸特异性DNA 多聚酶的抑制致使DNA 的HSV 的 TK已弄清。TK 处于活性时为双体分子，可与脱氧嘧啶核昔酸和 ATP 结合。特异性TK 如何识别无环鸟苷等制剂并将它们磷酸化，其确切机制仍不清楚。虽然已发现TK 抑制剂，但单独使用时并无抗抑核苷酸还原酶RR催化核糖核苷二磷酸转化为脱氧核糖核苷二磷酸，是 DNA-步。需要铁离子作为协同因子。RR 由-个大亚 及-个 所组成。在 HSV、EBV和水痘-带状疮疹 (VZV)的 组中，编码 RR两个亚 的基因是相邻的。由于 RR 的两个亚 必须形成双体才具有活性，这就为抗治疗提供了-个重要的作用靶点。按照 与大亚 间反

9、应区的氨基酸顺序，人工 了相同的 9个氨基酸肽段。这-肽段可竞争性地与大亚 结合，从而 正常双体复合物的形成。尽管这-肽段太大尚不能应用于实际，但研制可穿过细胞膜的类似小肽段可能会成为有效的抗 制剂。逆转录酶为逆转录 所特有,是依赖于RNA 的DNA 多聚酶。它以RNA为模板催化dNTP DNA逆转录酶由pol 编码pol 还编码蛋白酶和整合酶。HIV-1pol 编码分子量为51000和64000 两种逆转录酶，后者包含-个 15000的蛋白质具有RNA酶H的活性它参与RNA降解tRNA前体清除等反应，以利双链DNA的 。若RNA酶H发生突变可致前 合成缺陷。因此，RNA酶H有可能成为另-种抗

10、HIV-1 制剂的作用靶点。 的逆转录酶 已被克隆并在大肠杆菌中表达。逆转录酶已被高度纯化，其结3-3-ZT 三磷酸所抑185IV药ZT IV IV 逆转录酶活B区和F区的-个氨基酸发生ZT BFZTB区-留酶活性，说明B区参与焦磷酸盐的交换。这些结合部位都位于酶的氨基端。I-lEPT 和TIOI-1 。TIBO及其衍生物的作用机理可能是干扰逆转录相关过程，确切机制尚待阐明。TlBO HIV-2 逆转录酶几乎无影响TIBO HIV-1 逆转录酶上的HIV-2 逆转录醉者不同的决定簇。HIV-l编码的蛋白酶在 中非常重要，因而也成为抗 制剂的作用HIV-1蛋白酶 己被克隆并在大肠杆菌中表达，所以

11、此蛋白酶是 1199个氨基酸链连接成二聚体，就成为有活性的酶，预防或 二聚体形成可阻断酶活性。 较高的浓度。人工 多肽也可有效地抑制逆转录 蛋白酶。糖蛋白加工发生于 周期之末，受细胞酶所控制。HIV-1gp120在复3 个糖苷残墓，如果抑制这-过程，就不能形成成gp120可能有功能缺陷-葡萄糖苷酶1的抑制物，如精氨粟碱(Casterospermine，CAS)和N-T 基脱氧野尻霉素(N-butylDNJ)能在体外干扰 HIV-1 的模型中，已证实CAS 的抗对N-butyl DNJ 的动物毒理学已进行了研究，并已开展I 期临床试验。（5）（5）对于慢性HIV作用靶点。在HIV- 阶段中，有3

12、 个重要的措施用于治疗：抑制HIV-1蛋白酶，利用sCD4-KDEL 突变蛋白；杀死白酶是的 gpl20 结合，使之停滞在细胞内质网上，放。sCD4-毒素或CD4 单克隆抗体-毒素可定位和杀死2.2.2 关于中药作用机制研究进特异性和非特异性免疫功能而达到抑的目的（1）用 3 种方式分别检测大黄提取物，大诱导的CPE 程度明显减轻，且对轮醋甜素等5种药物对于2例SARS 患者的作用结果显示甜素对SARS-CoV都是非常有效的。鸡血藤水提物水相成分经过101 大孔吸附树脂75%乙醇洗脱组分在浓度为16g/ml 时可以完全抑制CVB3 的致细胞病变效应,特别是其粗提物治疗指数达到19.60，显示其

13、较低的细胞毒性和较高的抗CVB3效果。鸡胚表现有抑制作用，药物质量浓度在表现有抑制作用，药物质量浓度在31.25 mg/ ml 时即可抑制浓度在250 mg /ml 时能完全抑制有4 倍的抑制细胞的早期阶段可以降低胸腺嘧啶核苷激酶和 DNA 多聚酶的mRMA，发挥抗作用。余HSV-1 和HSV-2 均有一定的抑制作用其中最强醋酸乙酯提取物活性最强对HSV-1 和HSV-2 的半数抑制浓度IC50 分别是 阶段抑制 hexon 蛋白的表达有关。穿心莲内酯磺化物体外对甲型流感、H3N2以及乙型流感 B表面的血凝素的活性而实现的。 等发现 鹤草的总黄酮提取物有非常强的体内外抑制 的作用，尤其在体内试

14、验中发现该提取物强烈抑制血清中 DNA的 ，且与对照药 相比，停药后的反跳率低，其中的成分 草素、蹂花酸、金丝桃苷具有一定的抑制 的作用，尤其HBsAg 和 HBeAg的能力非常强，200g/ml 的非细胞毒性浓度对HBsAg 和HBeAg 的抑制分别达85.8%和63.7%。苦参碱和氧化苦参碱在体外均具有较好的抑制HepG2 2.2.15 细胞HbsAg，HBeAg 的作。而苦参碱和氧化苦参碱相比较，两者抗HBV 作用无显著差别。pre-S1 抗原为HBV 的一种外壳蛋白，他和前S2 蛋白(Pre-S2)一起在 HBV 附着和侵入肝细胞的机制中起重要作用。苦参碱和氧化苦参碱在浓度为0.001

15、 mol/L 时对HepG2 2.2.15 细胞B)NR8383 细胞后TNF-、 MCP-1 的转录和表达 ，降低了素E2(PGE2)、磷脂酸A2(PLA2)、 NR8383Toll7(TLR7)88(MyD88)，NF- B65mRNA 水平，抑制TLR7 介导的 MyD88 依赖性信号通路，抑制了 NF- B65 的核转位及表达，从而减轻流感 中的炎症反应。黄芩苷，槲皮素可拮抗甲型流感 细胞病变，调控细胞周期分布，并通过抑制Caspase8的激活，进一步抑制Caspase 3 活性，从而发挥抗 作用。黄芩苷能够明显抑制FM1 小鼠肺组织细胞的凋亡其可能通过影响细胞凋亡受体途径 FAS/F

16、AS-1 系统而发挥抗流感 作用。是引起 性心肌炎的主要原因余 中的PhyllaemblicinB 在体外抑制奇 B3HeLa细胞病变效应，并降低鼠体内 浓度，降低鼠 中 LDH和CK的活性，减轻 性心肌炎小鼠心肌细胞的损伤，可在体外和体内CVB3 诱导的细胞凋亡和心肌炎。 等研究黄芪对 性心肌炎(VMC)小鼠热休克蛋白(HSP)70 及凋亡相关 蛋白产物表达的影响。黄芪可能通过上 肌细胞Bcl-2、HSP70的表达来抑制 所致的心肌细胞凋亡。蛇葡萄根HBsAg、HBeAgHBVDNA的 而初步显示其抗 效果。药物HBsAg、HBeAgHBvDNA的 抑制作用越明显，呈浓度依赖性， 与作用时间

17、没有明显依赖关系。蛇葡萄根能够抑制 p53 的活性， HepG22.2.15.细胞具有促凋亡作用，蛇葡萄根能选择性抑制 HepG2 细胞中 HBv启动子活性(cp,slpFp)tl,t4ts的活性。蛇葡萄根的抗 作HBv转录及p53p53细胞凋亡从而抑细胞凋亡从而抑（2） 免桂枝挥发油及桂皮醛对流 10-7、5.7710-7 g/mL，TI 分别为27.04、9.51。与和桂皮醛0.2510-5 g/mL 显著升高细胞上清液中细胞干扰素-(IFN-)的量，作用机制可能与其激活Toll样受体 -1受体相关激酶4(IRAK-4)诱导细胞干扰素- 甜素(GL)对 HepG2.2.15 变异株的及e抗

18、原及e 抗原呈负相关，TLR2 在变异株低表达，GLTLR2、4表达，至少在该细胞株 HBVTLR2、4信号的改变无关，但有可能在体内通过免疫HBV。通过诱生、促进诱生干扰素免疫作用等达到的目的FM1 株小鼠的 CD4+/CD8+的比值降低IFN-/IL-4 的比值从而增强毒FM1株小鼠T 辅助细胞效应，调整小鼠T 淋巴细胞亚群平衡和Th1/Th2 细-1型的作用和对小鼠免疫功能的影响。小鼠后可导致小鼠免疫功能降低，表现在胸腺指数、脾指数、T 淋巴细胞刺激指数都较正常对照组降低，而经过药物治疗后各指标均较 对照组返魂草提取物及其有效成分绿原酸，咖啡 有抑制流感 神经氨酸酶的作NDV 诱生人全血

19、细胞及单核细胞产生干扰素，在发挥其抗 作用的同时又可促进机体产生干扰素，从不同途径发挥其抗 作用。穿心莲内酯、人参皂苷Rb1、苦参碱、绿原酸和 次 IMMVECsIFN- ，发挥抗 作用。从苦味 HBeAg从苦味 HBeAg 的作用。针对 HBeAg HBeAg 诱导转 小鼠的动物模HBeAb和细胞毒T淋巴细胞产生、恢复T/B细胞应答、IgG抗体和细胞因子产HBV HBeAg诱导宿主免疫耐受的药物。 酸单铵盐能显著减轻 H9N2 FM 1 两种流感 引起的小鼠肺部炎症，调整 H9N2 T 淋巴细胞亚群比例的作用，小鼠的免疫趋向正常状态。预防给药能抑制 在鸡胚内的 。 的吸附、改善和调整 小鼠的

20、免疫功能等多种途径而达到抗三、项目内三、项目内容和研究3.1研究目标和考核指标针对本中心重点研（S（HBV（EV71，靶点机理研究模型采用液相 技术（ 型微球流式荧光激光激发光中药筛选方法，最终建立快速高通量抗 靶点筛选和中药抗 机制研究体系；并利用该体系发现作用于靶点的中药抗 有效部位、组分或成分，阐明所筛选的中药抗 作用机理。克隆 有效作用靶点，包括流感 （ 、呼吸道合胞 （RSV、乙肝 （HBV、手足口 （EV71，本项目拟采用分子克隆技术，克隆表达与以上 致病机制相关的靶蛋白（结构和功能蛋白，每个 克隆并纯化 5个靶点蛋采用液相 技术（ 型微球流式荧光 靶点筛选和中药抗 机制研究体系。

21、在此基础上，对重点研究的目标 建立完善的中医药抗 多组分、多靶点筛选体系，并发现 5 个以上中药新药候选药物。相关SCI 累计IF102中药活性筛选技术创新团队重点培养12名青年技术骨培养35、233.2 在活性筛选发现有效部位、组分、成分的基础上，针对具有最优作用效果的 ，运用分子生物学和 工程 ，以 E.Coli为工 载体，转接目的 ，克隆其有效用分子生物学和 工程 ，以 E.Coli为工 载体，转接目的 ，克隆其有效作用靶点，接入微球，采用液相 技术继续筛选，最终建立快速靶点筛选和机制研各 研究内容和实验方案（重点为EV71RSV （1）EV71 Geneb 及本 已 的EV71 全 别

22、设计各蛋白全序列引物，其中 VP1-VP4、2A、2B、3A、3B 蛋白的 5端和 3端酶切位点分别为NdeIXhoI，2C3C3D5端和3端酶切位点分别为BamHIXhoI。 组的提取：将本 200804作为 全 EV71 MA104 细胞进行 传代扩增后，灭活 提取 RNA。调取目的 ：以提取得到的RNART-PCRPR 1.2A扩增的目的 。表达载体构建：将回收的目的 片段双酶切后将酶切片段与经相同双酶切的 p ET30(+)质粒连接、转化 Transetta ( DE3 )感受态菌株，以PCR 鉴定阳性菌落。表达纯化条件的优化：挑取PCR鉴定阳性菌落接种于小体积LBSDS电泳鉴His

23、的蛋白过镍柱纯化，以不同浓度洗脱缓冲液优化纯化条件。（1）设计引物：根全序列设计以下引物，委托公GG TCCCCATCCGCTGAGGCA G GGGTTCCCCACCGAGCTA 3.2：CTCGAG CTGGATGGTGCCCGTCTGCA 4.2：CTCGAG CTTCAGTGGCGCTGCCA3D：3D1：（2）提常规培养MA104细胞， 待细胞生长成单层后以 复数量常规培养MA104细胞， 待细胞生长成单层后以 复数量( MOI )5的EV71接种90时收取细胞。弃培养上清，5630min R N A提取试剂盒提取RNA。提取步骤如下：向一支1.5ml 离心管中加入560L AVL

24、裂解缓冲液（含Carrier RNA，再向140L 的 分离培养物，充分混匀至少 15s。室温下（15-25）10min Free加入约630L的混合溶液至置于收集管中8000rpm 离心 1min。 将吸附柱置于新的收集管的打开吸附柱向吸附柱中加入500L的缓冲液，8000rpm1min将吸附柱置于新的收集管的打开吸附柱向吸附柱中加入500L的缓冲液，14000rpm3min1.5ml离心管中，14000rpm1min1.5ml离心管中， 的打开吸附柱，向吸附柱中加入 60 L 的洗脱缓冲液，室温静置 2min 后，8000rpm 离心 1min，离心所得到的洗脱液即为所要获取的EV71 组

25、RNA 溶液。 1）反转录：以获得的RNA反转录引模模RNaseFree总体3760min2）PCRPCR反应。10XTaqReaction上游引物下游引物TaqDNA聚合dNTPs（10mM模板 在PCR仪上按下列条件进行PCR32 分别选取优化合适的退火温度X 回收目 目的条带，得到扩增的目目的条带，得到扩增的目10mlK B 100l PET-30a DH5大肠杆菌，37200rpm 5ml 菌种的PET-30a 质粒。提取的质粒放置于-20保存备用。PCR产物和PET-30a 在Microtube中配制下列混合液（10 X 高盐酶切缓冲NdeI限制性内切XhoI限制性内切PCR产 在P

26、CRPCR PCR 产物纯化试剂盒按照其说 在Microtube中配制下列混合液（总体积40l）: 10T4 DNA 连接Buffer10T4 DNA连接酶 质粒pET-质粒pET-目 在PCR16转化：按照Transetta (DE3) Chemically Competent Cell 大肠杆菌感受态的转化操体LB 选择性培养基中，37过夜培养，挑取阳性菌落进行PCR 反应。PCR1：10010mlKana LB 培养基，37摇床5ml，按照质粒提取试剂盒中说明书操作获取质粒溶液。 双酶切鉴定：酶切反应体系如下： 10H 酶切缓冲液质粒溶 序列测定将PCR阳性菌获得所表达蛋白编的核苷酸序列

27、分析（5） 表达条件优化：挑取PCR 鉴定阳性菌落接种于小体积LB 培养液中增菌培养，然后以1:10、1:100、1:200 三积比转接于新鲜LB培养液中，分别以20、30、 37剧烈震荡培养3h，加入终浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmoL/L 的异丙基 -D 硫代半乳糖苷(IPTG) 继续 37剧烈震荡培养1 好、2、4h 和6h，分别取1mL菌液，4000 rpm 离10min 收集菌体，加入去离子水和 2SDS 蛋白凝胶加样缓冲液各100L 重悬，煮沸10min，12000rpm离心10min。取上清液20L 与蛋白Marker同时行 SDS电泳，用考蓝同时行 S

28、DS电泳，用考蓝R250 染色，脱色液脱色后观察目的条带浓30mL结合液重悬，0（冰浴、400W 2sec间2sec40min A镍离子(Ni2+)B50mL 101 滴/5sec（1.0mL/minC 将 30mL 细胞超声破碎液 0.45m 滤膜过滤后上样。流速为 1 滴/5sec（约1.0mL/minD40mL 81滴/5sec（1.0mL/minE30mL1滴/5sec（1.0mL/min）收集各阶段洗脱液，用 SDS检测融合蛋白的分子量大小和纯度；F 用纯水流洗 10 个柱床体积，再用 20%的乙醇流洗 10 个柱床体积，流速为组共编码11种蛋白质，其中结构蛋白7种，包括F、G、N、

29、P、L、SH、 M；非结构蛋白 4 种，包括 NSl、NS2、M2.1、M2.2。根据 Geneb引物，RT-PCR 调取相应蛋白RSV11种蛋白编的获得引物设计.根据引物设计.根据Genb查得RSV11种蛋白的5 设计引物并引入酶切位点，委托公司F：5-A：5-PCR：提取RNA，反转录得到cDNA，PCR方法获得各目片段片段连接到克隆载体 pMD-18T，挑选正确克隆后以相应内切酶双酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与经相同酶切的表达载体pET30a（+）将构建好的带有目的 片段的表达载体转入大肠杆菌表达系统 BL21(DE3)中，挑LB液体培养基中，37200rpm1的LB A66

30、0 0.8 IPTG 至终浓度 1.0mmolL 37诱导表达4h。10000g 离心4min 收集菌体，PBS 洗涤菌体、超声后做SDS电泳(120V，1.5h)，考 蓝染色观察。His 亲和方法纯化目的蛋白：常规增菌诱导，收集菌体10000g 10 分钟，弃上清，尽可能流净培养液4ml 1Bingding Buffer 重悬0.1%加入NP- His.band5ml 于层析柱中， Buffer，31BindingBuffer依次过柱。加入准备好的裂解液，流速大约每小时 10 倍的层析柱体积10 体积的1Binding Buffer、6 体积1Washing Buffer 冲洗61Elute

31、 Buffer 洗脱目的蛋白。SDS电泳观察蛋白纯度，BCA 法测定蛋白浓度。3.3 解决抗 中药作用机理不明确，缺乏靶点水平筛选体系 解决抗 中药作用机理不明确，缺乏靶点水平筛选体系 解决抗 中药药效物质筛选技术效率低、客观性差等问题，针对 和宿主相互作用环节，以靶点筛选为 内容，重点研究中药抗 的作用机制；利用蛋白液相 等技术，建立中药抗 高通量筛选技术 。3.4 3.4 EV71RSV关键有效102015 3.4 EV71RSV关键有效102015 1231 、HBV关键有2-3获得10个关键靶点，建立可系，并获得5 个以上高活 2016 1231 （万元RSV2-3 个（万元RSV2-

32、3 个相 技2-3 个2-3四、项目技术四、项目技术路线、对策及市场分4.1项目技术路线及其先进性和可行性分析（说明其主要技术创新点50 种中药的50 种中药的抗 部位、组分、成分的筛选同时进行，并全部进行抗 初步筛选，为 的EV71、RSV 等四种 主要致病结定成熟，利用本 情况保障，本 和联合 山东省医学 基础 ，组成11 人的团队，高级、中级、初级研究知和技术标准分析及对策（含国内、国际竞争力分析知识 完全属于本 和联合 ，有协议规定，可申请国际 PCT专利。技术水150亿-200亿中药抗 研发的技术水平，尚处于传统的研究水平，迫切需要机制清楚，成分相对明确的中药新药，本课题将提供这个

33、，快速高效的发现抗 中药新药候选靶点筛选液相 技术的建立，将极大的方便中药研发，不仅是抗 中药，这种五、基础条五、基础条件和优5.1项目责任 和联合 、团队的基本情况（包括与项目实施相关的山东中 3 个博士后科研 站（中医学、中药学和中西医结合，1 个教育部重点 （中 经典理论 4 个国家中 管理局三级 （中药质量控制 、中药制剂技术 、微循环 、细胞生物学 ，2 个山东省 （天然药物 、中药制剂 3 个山东省工程技术；1个 SPF 实验动物中心，2 个国家科研（7 个道之一，国家支持经费 1 亿元4 个山东省教育厅，2 个国家中医药管理局重点研究室，1 个教育部工程技术中心；以及作为教育部重

34、点学科、国家中管局重点学科和山东省重点学科强化建设 A 级学科的中医文献 ；建有山东中 GMP 中试 ，拥有学校控股的山东 药业 ；实验动物中心建筑面积 4000 平米，科研实验中心建筑面积 4000 9000 为中药创新药物研究提供了共享科研 。课题联合 山东省医学 拥有生物安全2 级(BSL-2)和2 级生物安全柜活具有完善的 分离增殖、细胞培养和保存系统，如生物安全柜、倒置显微镜、CO2培养箱、液氮罐、超净工作台、高精密恒温水浴系统、超低温冰箱等。另外，梯度 扩增仪、低温拥有面积达860m2的研发大楼技术上联合 大学生命科学学院、 大学生命科学学院、国家 学 、 加州大学 分校公共卫生学

35、院等众多尖端科研机构， 、技术与资源共享。在HIV、人疱疹病毒、高致病性流感 等 病原体的研究方面处于国内领先，水平。中心已经建立了较为齐全的学科发展方向，形成了 学基础性研究、 方法研究、抗 药物研究和抗体工程研究等几个攻关课题组，同时已经建立并继续完善5个技术体系，包括： 组学、蛋白质组学、 、生物安全和实验动物泰州承担部省级项目5项， 学国开放课题2项，包含RD 细胞、MDCK 细胞、a 细胞在内，研制开发快速试剂50 余种。公司建有装备先进的生物 拥有 点样仪 扫描仪荧光PCR合国家GMP 要求的生产厂房和生物安全二级 。江苏省疾控中心生物安全三级 ， 学国家生物安全三级 及实验动物生

36、物安全三级实验室都能够供 进行相关的试验工作。同时可以充分利用园区建立的公共科技服务体系，确保项目的顺利进行。公司拥有 资源数十种，细胞资源十余种，3 4.7 80005.2 项目责任 及联合 与国内外同类机构的优势比较分析（完成项目预期目标的技术、 、机制、设施设备优势等）5.3（人月1男副2男3女学64男学65男66男6泰州7女88男69男45.3（人月1男副2男3女学64男学65男66男6泰州7女88男69男4女4清女4女4清女45.4项目 5.4项目 及主要骨干 的情况(从事过的主要相关研究及所负责任和作用相关研究和 成果、发明专利和获奖情况，在国内外主要 上1、个人简介（应包含本项目

37、中承担的任务，21998年11 月1999年11月，德国PhilippsMarburg 大学生物药物系学2004年 8月2010 年1 月药学院，博32000 年至今，山东省中医经方工程技术3科技部2014 年“机理研究及服液12山东省高等学校协同创新计划-中 抗 协同创新中心 基于毒-效 评价导向的千金子 制减毒的物质基础和作用机理研究。国家自然科学基金，72 万元，药理及作用机理研究，在研。第四位。“高脂血症”病证结合诊疗优化方案研究，国家科技部支撑计划 2013 年入库 （30772848国家自然科学基金，2008.01-2010.1230万元，已结（ 30472193，国家自然科学基金

38、，2005.01-2007.1221 万元，已结题，第四位。“平肝方药干预高血压病肝 证的代谢机制（ 30772865学基金，2004.01-2006.1230万元，已结题，第五位20. HPLC 法测定. 降糖康胶囊质量标准研究J. 中国药业,2007,01:25-,韩文正. HPLC 法测定舒筋活血片的含量J. 中国药师,2007,02:150- 的影响J. 山东中,马山. 毛细管电泳法(HPCE)测定克心痛滴丸中阿魏酸的含J. 中成药,2005,01:41-庭,庄严. 毛细管电泳法拆分肾上腺素手性对映体J. 中国当,2010,17:125-,2010,17:125-. 大黄不同粒径粉末在

39、大鼠体内药代动力学研究J. 山东中医杂HPLC同时测定心脑治胶囊中三七皂苷R_1Rg_1、人参皂苷Rb_1 含量J. 中成药,2006,05:655-658. 乌头类药物的毒性研究及乌头的研究概述J. 食品与. 毛细管电泳法测定含成药中盐酸小檗碱的含量J. 山. 北虫草多糖和多肽提取物的体外抗肿瘤研究J. 山东中医 10年来，开始从事药物及其药理学研究。近几年相关研究如下相成果 项。项目转让济南金牛生物科，每年利税超过1000一种真菌产活性物质的确定和机制的研究国家自然基金（2006草糖苷20122013新型通用粘膜免疫佐剂（2010-2012肠71型致乳鼠免疫应答变化的研究，省自然基金免疫牛

40、乳在预防手足口2015（3）一种新生33(4):343-志, 28(1):54-56,2009中国药业, 18(23) :5-6, 2009.近3年的相YuehuaQiao,LingjianMeng,JunWang,HongMeng,EffectofGanciclovironMurine -induced Hearing Loss in a Mouse M, Cell Biochem Biophys, 61(2):407-12, 2011QiaoYuehua, Zhang Longzhen, Xu Kailin, Zeng Lingyu, Meng Lingjian, Wang Jun, Hong Meng:Inflammatory Les of Cochleaurine Cytomegalo-InfectedMice HearingLoss, CellBiochemBiophys,62(2):281-7, Zhang M, Wang L, Zhao X, Zhao K, Meng H, Zhao W,C, TRAF-protein(TRIP)negativelyregulatesIFN-productionandantiviralresponsebypromoting proteasomal degradation of-bindingkinase1, JExp Med, 2