DNA平滑化连接试剂盒

1、CodeNo.:D6025TaKaRaDNABluntingKit（20次量）内容页码制品说明试剂盒组成保存使用注意操作方法11112DNA片段的末端平滑反应载体DNA的去磷酸化反应连接反应末端平滑反应的效率检定2234凝胶电泳确认末端平滑结果PCR产物的末端平滑及克隆Q&A556制品说明BluntingKit可使具有3或5,克出末靖的DNA平淆化。在T4DNAPolymerase5r-3的聚合酵活性和3-5*的外切薛活性的作用下，两种不同形式的粘性末靖可被同时平滑化（凍理见團l）o同时，在试剂盒中由于含有TaKaRa独自开发的能使平淆末靖的DNA片段高效、快速连接的试剂，因此使用本试剂盒可使

2、DNA末端平淆化和DNA片段同仪体连接这两个反应快速而有效地完成。并且，反应澈能够立接用于细曲转化和体外包装辱。5二35-Protrudingend35二35-Protrudingend3fIIIIII1I5,5-Recessedend5，3，IIIIIIII35,T4DNAPolyiMrasadHTPs利用J-5ZDNAT4DNAPolyiMrasadHTPs利用J-5ZDNA外切活性35Z5-3利用卯DNA5-3IIII3Z5，图1.DNA片段的Blunting原理试剂盒组成（20次,）T4DNAPolymerase20pl10XBuffer（含dNTP）30DNADilutionBuff

3、er500但LigationSolutionA600glX2LigationSolutionB150保存：-20T使用注意使用DNABluntingKit也可使具有脱确酸化的5,宪出末竭的DNA末竭平淆，但不能使具有麟酸化的3凹陷末靖的DNA末靖平淆。在鸟枪法克隆时，应注意超声波分解的DNA片段，可能会产生具有确破化的3凹陷末靖的DNA片段。请把LigationSolutionB于冰中删。使用前可以轻案摄荡混匀。反負冻融不影响使用。做细茵转化时，连接液不桶要做苯附抽提和乙醉沉淀便可直接使用（对100pl的感受态细胞，连接液应控制在20山以下人如果逹接液量过多时应使用乙溥沉淀法精制DNA.3-2

4、-2-操作方法DNA片段的末端平滑反应1.在微量离心管中制备下列反应裁（总体积9pl）。DNA片段（粘性末瑞）*0.110pmol10XBuffer1pl灭翊糊水upto9plDNA片段须经过乙醇沉淀.270P保温5分钟，然后转移至37*C保漫。加入1M的T4DNAPolymerase,轻案混匀（不可剧烈撮榜）。37P反应5分钟（GC含蒐较低的DNA,则25*反应）.如果DNA浓废很高，加入DNADilutionBuffer,使DNA浓皮达到1阳50pl,并激烈援荡,使T4DNAPolymerase失活（如果DNA浓皮巳经狼低，则无|进行稱释），然后于冰上，冶备进行下一步反应。如果催要保存反应

5、液，则立即做料&处理、乙醇沉淀。DNA沉淀用DNADilutionBuffer洛解时20P保存。载体DNA的去磷酸化反应为了提高插入DNA与載体DNA的连接效率，将載体DNA的5,末进行去确酸化处理后可以核少載体的自身环化。経限制壽切后的載体DNA按照下述方法用碱性麟进行去H酸化处理。制备经限制壽完全切斷的具有平疳末靖的栽体DNA。乙諄沉淀精1DNA。在fa离心管中制备下列反应戒（总体积150四。栽体DNA（平淆末燃）3,聚合酵反应而在凹陷的3,靖进行琥墓聚合形成平淆末瑞；而具有3,宪出螺（丹ri产生）的DNA片段的3突出端由于V外切詹活性被分解形成平淆末靖；原来的平淆末靖则不妥任何形响MEP

6、HMI11111111Ia5a)D520D533图3.通过电泳比较DNA链长度M:M13mpl8ssDNA(双脱氧法测序)E:EcoRI0:Blunting(-)P:Pstl5:5分钟反应H:HincU20:20分钟反应PCR产物的末端平滑及克隆使用PCR法扩増卡那素扰性茎因（约1.5kb）,插入pUCllS/Zfincnft,制作卡那素抗性亚克隆。以下是操作力法和结果。按照前述的操作方法，将卡那需索抗性基因的PCR片段（约500ng,0.5pmol）末蜩平淆后，与pUC118/Zfihcn（约100ng,0.05pmol）连接（10山平淆反应液，加入1山載体DNA,40plLigationS

7、olutionA,10plLigationSolutionB,30min）液20pl转化100pl的JM109處受态细胞，在含有XGftl,IPTG,Amp平板培养基上培养。把平板培养拄上的白色如的一部分转移至含有卡那索的平板培养墓上培养，观寮实际的克隆效車。为了进一步进免栽体DNA的自身连接，又将pUCllS/ZfincH进行脱麟酸化处理，同时把末靖平淆反应后的PCR片段用T4PolynucleotideKinase处理使其5,末i|疇黴化，然后再进行与上述条件相同的连接、转化操作（结果见喪2）.-6-6-表1表1细菌转化结果4-51和的确酸化反应体茶如下，全B25pl.末靖平淆反应液5Hl

8、ioxW4t冲液2.5Pl10mMATP1T4PolynucleotideKinase1Pl灭茵水15.5pl地反应液在37反应30分钟后.于65P保沒10分伊使酵失活.插入DNA片段栽体脱确酸化转化如蓝Colony/白Colony(Colony/gg載体DNA)卡那需索抗性Colony/白Colony(%)末竭平淆化末靖平淆化后5,末靖祕化1.4X106/1.8X1040+1.2X106/3.2X10464+6.0X1072.1X10471表2.利用PCR扩増卡那需素抗性基因的克隆效率Q&AQ1-一次末靖平淆化反应的DNA愛長多少?Al.对于立线型PUC18DNA(2686bp)来说大釣为0

9、110pg(根据DNA5末JU浓度换算釣0110pmol)最适:为12pgoQ2.A2.DNABluntingKit中的LigationSolutionA、B可用LigationKitVer.2代簪吗？使用LigationKitVer.2因为反应体积小,所以比较容劾受到DNA濬液组成的形响，因此用LigationKitVer.2代着EluntingKit中的LigationSolutionAE时，有时会降低達接效率。如要使用LigationKitVer.2进行達接时可先用苯附抽提和乙障沉淀法精制DNA。Q3.限制甘切片段经和平淆处理后，5,是否带有H破轄?A3.限甸肆切片段经和平淆(Blunting)处理后，其5,靖帶林破轄，克隆时最好使用去詹酸化栽体,以防止栽体的自身连接。Q4.A4.当使用BluntingKit使PCR严物和平淆后，再与裁体连按时是否要将其5,末醐酸化？对于PCR扩増产物，險非是使用了5,确酸化的引物做PCR反应，否JHJPCR片段的5,靖不带有确酸墓。因此克隆PCR产物时不要将載体去确酸化。此时若与去确酸化載体连按时则必須使用T4PNK将PCR产物的5,剰聘澈化。利用DNABluntingKit进行平淆反应后，用苯附抽提法可将肆完全除去，然后进行T4PNK进行5末螺确建化反应，再在65P下加热10分钟使肆完全失活。此反